細胞破壁對螺旋藻藻藍蛋白提取效果的影響

俞建峰

傅 劍1,2

馬 瀟1,2

崔政偉1,2

(1. 江南大學機械工程學院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省食品先進制造裝備技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

細胞破壁對螺旋藻藻藍蛋白提取效果的影響

俞建峰1,2

傅 劍1,2

馬 瀟1,2

崔政偉1,2

(1. 江南大學機械工程學院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省食品先進制造裝備技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

螺旋藻細胞破壁是藻藍蛋白提取的關(guān)鍵工序。采用溶脹法、超細剪切法、超聲波法、反復凍融法、溶脹—超細剪切法和溶脹—超細剪切—超聲波法對螺旋藻細胞進行破壁處理；通過對比分析破壁后提取液中的藻藍蛋白得率來評價破壁方法的優(yōu)劣。結(jié)果表明，溶脹法、超細剪切法、超聲波法、反復凍融法、溶脹—超細剪切法、溶脹—超細剪切—超聲波法得到的最高藻藍蛋白得率分別為8.90%，7.38%，8.00%，8.26%，9.22%，8.88%。綜合考慮，溶脹—超細剪切法相對其它5種破壁方法而言，其操作簡單便捷，破壁效果更加顯著，藻藍蛋白得率高；溶脹—超細剪切法最佳的提取工藝為：溶脹時間12 h，剪切時間5 min。

螺旋藻；藻藍蛋白；細胞破壁；提取

螺旋藻(SpirulinaPlatensis)是一種絲狀原核多細胞藻類，體長200～500 μm，寬5～10 μm，圓柱形，呈螺旋彎曲狀。螺旋藻主要包含鈍頂螺旋藻(S.Platensis)、極大螺旋藻(S.Maxim)和鹽澤螺旋藻(S.Subsalsa)3種。螺旋藻內(nèi)部富含藻藍蛋白、葉綠素、胡蘿卜素及不飽和脂肪酸等多種生物活性成分[1]，營養(yǎng)豐富，總蛋白質(zhì)含量高達55%～65%[2]。

藻藍蛋白(phycocyanin，PC)是一種重要的營養(yǎng)豐富的捕光色素蛋白，具有強烈的熒光性，常被制成生物探針用于成分含量檢測[3]；藻藍蛋白內(nèi)氨基酸組成成分齊全，必需氨基酸含量高，具有抗癌[4-5]、抗氧化[6-8]、提高生理機能等多種生理功能。近年來藻藍蛋白在生物醫(yī)療[9]和食品方面[10]的應(yīng)用研究正在不斷拓展深入，所以藻藍蛋白的提取分離成為時下技術(shù)工程研究的一大熱門方向。

現(xiàn)階段螺旋藻藻藍蛋白的提取方法種類繁多，然而至今仍沒有相關(guān)文獻提出一種成熟穩(wěn)定的提取方法，所以藻藍蛋白的提取研究仍處于創(chuàng)新發(fā)展階段[11]。螺旋藻藻藍蛋白提取的關(guān)鍵技術(shù)在于細胞破壁和分離純化，因此細胞破壁技術(shù)是蛋白提取的關(guān)鍵工藝技術(shù)之一[12]。目前常用的細胞破壁技術(shù)有溶脹法[13]、反復凍融法[14]、超聲波法[15]、珠磨法[16]等，且無相關(guān)文獻公開提及到超細剪切細胞破壁方法。本試驗擬以鈍頂螺旋藻為研究對象，通過比較溶脹法、超細剪切法、超聲波法、反復凍融法、溶脹—超細剪切法、溶脹—超細剪切—超聲波法等細胞破壁方法對螺旋藻藻藍蛋白提取效果的影響，篩選出一種提取效率高、提取時間短、能耗低的細胞破壁方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺旋藻干粉：西安禾一生物技術(shù)有限公司；

硫酸銨：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；

磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

臺式離心機：TGL-16C型，上海安亭科學儀器廠；

紫外可見分光光度計：UV1800型，日本島津公司；

精密電子天平：ARB120型,奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司；

超聲波細胞粉碎機：JY99-IIDN型,寧波新芝科技股份有限公司；

食品超細剪切機：HFX280B型，南昌贛康寶工貿(mào)有限公司；

電熱恒溫水槽：DK-80型，上海三發(fā)科學儀器有限公司；

冰箱：BCD-300WJ型，LG集團。

1.2 試驗方法

1.2.1 藻藍蛋白濃度及得率 藻藍蛋白的濃度[17]和得率[18]計算：

(1)

(2)

式中：

Pc——藻藍蛋白濃度，mg/mL；

Y——藻藍蛋白的得率，%；

A620——樣品在波長為620 nm處的吸光度；

A652——樣品在波長為652 nm處的吸光度；

V——藻藍蛋白粗提取液體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

DB——螺旋藻粉重量，g。

1.2.2 溶脹法 稱取一定量的螺旋藻粉，按液料比20∶1 (mL/g)[19-20]加入pH =7的磷酸緩沖液[21]，攪拌均勻后，置于4 ℃的低溫環(huán)境下保存。在溶脹1，2，3，5，6，12，24，48，72 h后分別提取1/9的液體進行離心處理(15 000 r/min，15 min)，取離心上清液，加入一定量的飽和度為20%的硫酸銨溶液進行鹽析[22]。靜置一段時間對鹽析液進行離心處理，取沉淀，利用磷酸緩沖液溶解沉淀，得到的溶解液便是最終提取的藻藍蛋白溶液。用紫外分光光度計檢測溶解液的吸光度，并計算出藻藍蛋白提取液的濃度及得率。

1.2.3 超細剪切法 稱取一定量的螺旋藻粉，按液料比20∶1 (mL/g)加入pH =7的磷酸緩沖液，攪拌均勻后，置于4 ℃的低溫環(huán)境下保存4 h[23]。低溫溶脹4 h后將溶脹液分成7等份，用食品超細剪切機分別處理1，2，3，4，6，8，10 min。超細剪切的過程當中由于物料之間的碰撞會產(chǎn)生一定的熱量，為防止蛋白質(zhì)變性，此處采用間歇式工作方法，如剪切30 s，停止30 s。用紫外分光光度計檢測溶解液的吸光度，并計算出藻藍蛋白提取液的濃度及得率。

1.2.4 超聲波法 稱取一定量的螺旋藻粉，按液料比20∶1 (mL/g)加入pH =7的磷酸緩沖液，攪拌均勻后，置于4 ℃的低溫環(huán)境下保存4 h。低溫溶脹4 h后將溶脹液分成6等分，用超聲波細胞粉碎機分別處理2，4，6，8，10，12 min，超聲波功率為90 W。由于超聲波處理的過程當中會產(chǎn)生一定的熱量，為防止蛋白質(zhì)變性，此處采用間歇式工作方法，如工作2 s，停止5 s。用紫外分光光度計檢測溶解液的吸光度，并計算出藻藍蛋白提取液的濃度及得率。

1.2.5 反復凍融法 稱取一定量的螺旋藻粉，按液料比20∶1 (mL/g)加入pH =7的磷酸緩沖液，攪拌均勻后，置于-20 ℃的低溫環(huán)境中進行冷凍處理。溶液凍結(jié)實后取出，進行37 ℃水浴加熱處理[24]，取溶液的1/5進行離心處理(15 000 r/min，15 min)，剩余溶液繼續(xù)做凍融處理，總共5次。用紫外分光光度計檢測溶解液的吸光度，并計算出藻藍蛋白提取液的濃度及得率。

1.2.6 溶脹—超細剪切法 稱取一定量的螺旋藻粉，按液料比20∶1 (mL/g)加入pH =7的磷酸緩沖液，攪拌均勻后，置于4 ℃的低溫環(huán)境下保存。在溶脹4，8，12，24 h后分別提取1/4的溶液，將每份溶液又分成3等分，等分后的溶液用食品超細剪切機分別處理5，10，15 min。用紫外分光光度計檢測溶解液的吸光度，并計算出藻藍蛋白提取液的濃度及得率。

1.2.7 溶脹—超細剪切—超聲波法 稱取一定量的螺旋藻粉，按液料比20∶1 (mL/g)加入pH =7的磷酸緩沖液，攪拌均勻后，置于4 ℃的低溫環(huán)境下保存。在溶脹4，8，12，24 h后分別提取1/4的溶液，等分后的溶液用食品超細剪切機分別處理5 min。提取剪切后的溶液，用超聲波細胞粉碎機分別處理5 min，對超聲波處理后的溶液進行離心處理(15 000 r/min，15 min)，取離心上清液。用紫外分光光度計檢測溶解液的吸光度，并計算出藻藍蛋白提取液的濃度及得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶脹法對藻藍蛋白得率的影響

溶脹法對藻藍蛋白得率的影響見圖1。

由圖1可知，隨著溶脹時間的延長，藻藍蛋白得率呈先增加后逐漸穩(wěn)定的趨勢，溶脹時間為24 h時，藻藍蛋白得率達到8.9%，且溶脹6 h時藻藍蛋白得率就已達到8.08%，接近藻藍蛋白得率的穩(wěn)定值。綜合分析可知，溶脹時間對螺旋藻細胞破壁具有一定的影響，且溶脹24 h后的破壁效果相對更加明顯，但是考慮到工廠實際生產(chǎn)情況，溶脹時間一般選用4～8 h。

圖1 溶脹時間與藻藍蛋白得率的關(guān)系Figure 1 Relationship between swelling time and yield of phycocyanin

2.2 超細剪切法對藻藍蛋白得率的影響

超細剪切法對藻藍蛋白得率的影響見圖2。

圖2 剪切時間與藻藍蛋白得率的關(guān)系Figure 2 Relationship between ultrafine shearing time and yield of phycocyanin

由圖2可知，隨著剪切時間的延長，藻藍蛋白得率先不斷增加后趨于穩(wěn)定，且剪切時間為8 min時，藻藍蛋白得率達到最大值7.38%。前3個取樣點出現(xiàn)的V型曲線，可能是剪切生熱導致蛋白質(zhì)變性的影響大于超細剪切破壁的影響，隨著剪切時間不斷延長，超細剪切破壁成為影響藻藍蛋白得率的主要因素。9 min之后曲線出現(xiàn)略微下降，可能是剪切時物料之間的相互運動產(chǎn)生了一定的熱量，導致小部分蛋白失活。由此可知，超細剪切對藻藍細胞的破壁效果影響較大，試驗中最低得率值為3.79%，但是僅僅經(jīng)過了6～8 min的剪切處理，得率上升到了7.38%，增幅較大。綜上分析，超細剪切破壁的方法效率比較高，對工業(yè)生產(chǎn)具有一定的潛在價值。

2.3 超聲波法對藻藍蛋白得率的影響

超聲波法對藻藍蛋白得率的影響見圖3。

由圖3可知，超聲時間為2 min時，藻藍蛋白的得率達到最大值(8.0%)。當曲線達到另一個極值點(超聲時間為8 min，得率為7.97%)時，得率開始急劇降低，可能是超聲產(chǎn)生的高溫導致溶出的蛋白質(zhì)失活[25]。超聲時間在0～8 min時，超聲波產(chǎn)生的空穴效應(yīng)使得螺旋藻細胞破裂，藻藍蛋白溶解到緩沖液中。超聲時間在8 min之后，超聲產(chǎn)生的熱量導致一部分蛋白質(zhì)變性，曲線整體急劇下降。綜上所述，超聲波破壁效果較好，但是超聲過程中產(chǎn)生的熱量對藻藍蛋白得率的影響較大，且難以精確控制，因此需要進一步研究才能真正應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

圖3 超聲時間與藻藍蛋白得率的關(guān)系Figure 3 Relationship between ultrasonic time and yield of phycocyanin

2.4 反復凍融法對藻藍蛋白得率的影響

反復凍融法對藻藍蛋白得率的影響見圖4。

圖4 凍融次數(shù)與藻藍蛋白得率的關(guān)系Figure 4 Relationship between freezing-thawing times and yield of phycocyanin

由圖4可知，隨著凍融次數(shù)的增加，藻藍蛋白得率不斷升高，而且在反復凍融4次之后，破壁效果最佳，此時藻藍蛋白得率達到了8.26%。反復凍融處理1～3次時，對藻藍蛋白提取效果的影響不大；處理4次時，藻藍蛋白得率顯著增加；處理5次時，藻藍蛋白的得率出現(xiàn)略微下降，可能是溫度反復快速的變化導致蛋白質(zhì)變性[26]。采用凍融法螺旋藻細胞破壁，需要在超低溫的環(huán)境進行下，所以難以應(yīng)用到工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中，現(xiàn)階段主要是實驗室小規(guī)模試驗，因此真正的投入使用還需要技術(shù)的進一步提升改進。

2.5 溶脹—超細剪切法對藻藍蛋白得率的影響

溶脹—超細剪切法對藻藍蛋白得率的影響見圖5。

由圖5可知，在溶脹時間為4 h或8 h的條件下進行螺旋藻細胞破壁處理，藻藍蛋白得率均呈上升趨勢，且當溶脹時間為8 h時，剪切時間為15 min，藻藍蛋白得率達到8.9%，與溶脹時間為12 h時藻藍蛋白得率的水平接近。在溶脹時間為12 h的條件下，藻藍蛋白得率隨剪切時間的變化基本一致，而且出現(xiàn)略微的下降?？赡苁侨苊洉r間太長，溶脹12 h后螺旋藻內(nèi)的藻藍蛋白基本已經(jīng)溶出，而且此時進行超細剪切并沒有起到破壁的作用，更多的是產(chǎn)生的熱量導致蛋白質(zhì)變性?；谝陨戏治?，溶脹和超細剪切協(xié)同作用對螺旋藻細胞破壁的影響較大，可以大大縮短溶脹時間，從而減少整個提取過程所消耗的時間，對工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導意義。

圖5 溶脹時間和剪切時間協(xié)同作用與藻藍蛋白得率的關(guān)系Figure 5 Relationship of interactions of swelling time and ultrafine shearing time on yield of phycocyanin

2.6 溶脹—超細剪切—超聲法對藻藍蛋白得率的影響

溶脹—超細剪切—超聲法對藻藍蛋白得率的影響見圖6。

圖6 溶脹—超細剪切—超聲法中溶脹時間與 藻藍蛋白得率的關(guān)系

Figure 6 Relationship of swelling time and yield of phycocyanin based on the method of swelling-ultrafine shearing-ultrasonication

由圖6可知，溶脹4 h，超細剪切處理5 min，超聲波處理5 min，藻藍蛋白得率為7.72%。從圖1可知，在溶脹4 h時，藻藍蛋白得率大約為6%；從圖2可知，溶脹4 h，超細剪切處理5 min，藻藍蛋白得率大約為6.8%。根據(jù)以上分析知，溶脹—超細剪切—超聲法應(yīng)用于螺旋藻細胞破壁中，在相同溶脹時間條件下，其破壁效果比溶脹法和超細剪切法要好。

2.7 不同細胞破壁方法的對比

細胞破壁方法對藻藍蛋白得率的影響見表1。

表1 不同細胞破壁方法作用下藻藍蛋白得率的比較Table 1 Comparison on yield of phycocyanin of cell disruption methods

通過對6種破壁方法進行對比分析，可以得出溶脹—超細剪切法在本試驗中的提取效果最好，藻藍蛋白得率最大為9.22%；同時溶脹法得到的藻藍蛋白得率最大為8.9%，超聲波法得到的藻藍蛋白得率為8.0%，溶脹—超細剪切—超聲波法得到的藻藍蛋白得率為8.88%；以上3種破壁方法的效果基本一致，但是溶脹法得到藻藍蛋白得率是在溶脹24 h的條件下得到的，時間消耗比較長；超聲波法得到藻藍蛋白得率是在溶脹4 h和超聲處理2 min的條件下得到的，消耗時間和能耗均比較少；溶脹—超細剪切—超聲波法得到藻藍蛋白得率是在溶脹12 h，超細剪切處理5 min和超聲波處理5 min的條件下得到的，消耗時間和能耗相對較多；反復凍融4次得到的藻藍蛋白得率為8.26%，相對也比較高，但是其時間消耗和能耗也較大。采用溶脹12 h及超細剪切5 min可獲得良好的螺旋藻細胞破壁效果。

3 結(jié)論

通過對比分析，溶脹—超細剪切法在本試驗中的細胞破壁效果最好，藻藍蛋白得率達到9.22%；溶脹法存在生產(chǎn)周期長，超聲波法和溶脹—超細剪切—超聲波法在運行中超聲波能量轉(zhuǎn)化為熱量造成蛋白變性，反復凍融法能耗高且耗時，這些細胞破壁方法的缺點使得工業(yè)化應(yīng)用存在技術(shù)瓶頸。因此，溶脹—超細剪切法可以作為一種新型的螺旋藻細胞破壁方法。

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Comparison of cell disruption methods for the extraction of Phycocyanin fromSpirulinaPlatensis

YUJian-feng1,2

FUJian1,2

MAXiao1,2

CUIZheng-wei1,2

(1.MechanicalEngineeringSchool,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China;2.JiangsuKeyLaboratoryofAdvancedFoodManufacturingEquipment&Technology,Wuxi,Jiangsu214122,China)

The cell disruption is an important step during the extraction of phycocyanin fromSpirulinaPlatensis. Six methods including swelling, ultrafine shearing, ultrasonication, freezing and thawing, swelling-ultrafine shearing and swelling-ultrafine shearing-ultrasonication were applied to break the cell-wall ofS.plarensis. The effects of differentwall-broken methods were evaluated based on the the yield of the phycocyanin. The yield rates of phycocyanin extraction were 8.90%, 7.38%, 8.0%, 8.26%, 9.22%, 8.88%, Respectively,by using the swelling, ultrafine shearing, ultrasonication, thawing and swelling, swelling-ultrafine shearing, swelling-ultrafine shearing-ultrasonication. Finally, the swelling-ultrafine shearing was considered as the best way to break the wall, with swelling for 12 h and the shearing for 5 min.

SpirulinaPlatensis; phycocyanin; cell disruption; extraction

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項(編號：JUSRP51634B)；江蘇省食品先進制造裝備技術(shù)重點實驗室開放課題(編號：FM-2015-09)

俞建峰(1974—)，男，江南大學副教授，博士。 E-mail:robotmcu@126.com

2016—09—10

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.035