降檸檬酸菌株的篩選及鑒定

張 鐸

毛 勇4

毛 健1,2,3,5,6

劉雙平1,2,3,5,6

周志磊1,2,3,5,6

(1. 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3. 江南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫 214122；4. 中國(guó)酒業(yè)協(xié)會(huì)，北京 100831；5. 國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興 312000；6． 江南大學(xué)﹝如皋﹞食品生物技術(shù)研究所，江蘇 如皋 226500)

降檸檬酸菌株的篩選及鑒定

張 鐸1,2,3

毛 勇4

毛 健1,2,3,5,6

劉雙平1,2,3,5,6

周志磊1,2,3,5,6

(1. 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3. 江南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫 214122；4. 中國(guó)酒業(yè)協(xié)會(huì)，北京 100831；5. 國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興 312000；6． 江南大學(xué)﹝如皋﹞食品生物技術(shù)研究所，江蘇 如皋 226500)

為篩選具有降檸檬酸能力的酵母菌株，對(duì)一檸檬酸廠廢水廢渣中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)分離純化保藏，共獲得具有耐檸檬酸的菌株15株。對(duì)15株菌株的降檸檬酸能力進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)5株菌的降檸檬酸能力較強(qiáng)，發(fā)酵5 d可降解檸檬酸培養(yǎng)基中70%以上的檸檬酸。測(cè)定5株菌的酒精耐受性，菌株NS2、NL2的酒精耐受能力較強(qiáng)。觀察該兩株菌的形態(tài)學(xué)及生理生化特性，將NS2鑒定為畢赤酵母菌，NL2鑒定為熱帶假絲酵母菌。進(jìn)一步通過(guò)分子生物手段進(jìn)行18S rDNA PCR測(cè)序分析，將NS2鑒定為Pichiakudriavzevii，NL2鑒定為Candidatropicalis。研究成果可為今后應(yīng)用生物降酸法降低山楂酒等果酒中有機(jī)酸含量提供指導(dǎo)。

酵母菌；降酸；畢赤酵母菌；篩選；測(cè)序；鑒定

山楂(CrataeguspinnatifidaBunge)屬薔薇科山楂屬，又名山里果、山里紅，是中國(guó)北方地區(qū)重要的栽培水果[1]。由于其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和酸甜可口的風(fēng)味特點(diǎn)，山楂也常用于釀造果酒。酸度是果酒的釀造過(guò)程中的重要指標(biāo)之一，適量的有機(jī)酸有助于豐富果酒風(fēng)味，營(yíng)造出清爽可口的口感，同時(shí)降低酒體中的pH，起到抑制雜菌生長(zhǎng)的作用。但有機(jī)酸含量過(guò)高則會(huì)產(chǎn)生酒體酸澀，難以入口等[2]。發(fā)酵型果酒的有機(jī)酸主要來(lái)自于發(fā)酵原料，研究[3]發(fā)現(xiàn)不同種類果酒中所含有機(jī)酸不同，主要為酒石酸、蘋果酸和檸檬酸。葡萄酒中的有機(jī)酸主要為酒石酸[4]，蘋果酒中富含大量蘋果酸[5]，而山楂酒、橙酒等果酒中的有機(jī)酸主要為檸檬酸[6]。目前傳統(tǒng)的果酒降酸方法主要分為物理降酸法如離子交換樹降酸法[7]、電滲析降酸法[8-9]、低溫冷凍降酸法等和化學(xué)降酸法[10]，以及生物降酸法[11]等。這些降酸方法各有優(yōu)劣，有研究[12]表明冷凍降酸法不添加其他物質(zhì)，對(duì)葡萄酒原有的風(fēng)味營(yíng)養(yǎng)影響較小，但降酸幅度較小，一般可以降低葡萄酒中0.5～2.0 g/L的酒石酸。有報(bào)道[13]采用電滲析降酸法對(duì)楊梅果酒進(jìn)行降酸處理，可以降低約42%的可滴定酸，但其是一個(gè)連續(xù)的降酸過(guò)程，動(dòng)力消耗大，成本高?；瘜W(xué)降酸法的原理是利用偏堿性鹽與酒體中的有機(jī)酸反應(yīng)從而達(dá)到降酸目的，常用的降酸劑有Na2CO3、K2CO3、KHCO3等，其降酸效果較為明顯[14]。但由于引入了化學(xué)添加劑，會(huì)導(dǎo)致果酒酒體渾濁，產(chǎn)生苦澀口味等不利影響。生物降酸法中最常見的為蘋果酸—乳酸發(fā)酵，這種方法普遍應(yīng)用于葡萄酒的后酵階段[15]，不僅能顯著降低酸度，還可以改善酒體風(fēng)味，提升葡萄酒的品質(zhì)[16]。山楂酒中的檸檬酸含量過(guò)高，亟需解決，目前山楂酒的化學(xué)降酸法研究報(bào)道較多，而利用生物降酸法降低檸檬酸含量的研究報(bào)道相對(duì)較少，王立芳等[17]研究獲得一株陸生伊薩酵母(Isstchenkiaterricola)，在蘋果酸和檸檬酸為唯一碳源的培養(yǎng)基中可降解79.9%的蘋果酸和73.1%的檸檬酸，但未繼續(xù)探究菌株在果酒中的實(shí)際降酸效果。由于生物降酸避免了化學(xué)試劑的加入，在顯著降低酸度的同時(shí)還可以部分改善果酒品質(zhì)，符合消費(fèi)者追求天然的、無(wú)添加劑的消費(fèi)心理。本研究擬通過(guò)以檸檬酸為唯一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選可降解檸檬酸的菌株，旨在今后可以應(yīng)用于發(fā)酵山楂酒降酸工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

檸檬酸廢水廢渣樣品：取自江蘇省宜興市一檸檬酸廠；

dNTP、瓊脂糖等分子生物試劑：加拿大BBI公司；

其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；

YPD培養(yǎng)基：20 g葡萄糖，20 g魚粉蛋白胨，20 g酵母提取物，自然pH，溶于1 L蒸餾水中；

WL培養(yǎng)基：酵母提取物4 g，胰蛋白胨5 g，葡萄糖50 g，磷酸氫二鉀0.55 g，氯化鉀0.425 g，氯化鈣0.125 g，硫酸鎂0.125 g，氯化鐵0.002 5 g，硫酸錳0.002 5 g，溴甲酚綠0.022 g，pH 6.5，溶于1 L蒸餾水中；

檸檬酸液體培養(yǎng)基：酵母提取物2.5 g，魚粉蛋白胨2.5 g，磷酸二氫鉀 0.55 g，氯化鈣 0.125 g，硫酸鎂 0.125 g，硫酸錳0.002 5 g，檸檬酸12 g，pH 2.8，溶于1 L蒸餾水中。固體培養(yǎng)基則在上述配方基礎(chǔ)上加入20 g/L的瓊脂，121 ℃高壓滅菌20 min[18]。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：5810R型，德國(guó) Eppendorf 公司；

恒溫水浴鍋：HH-S2型，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；

pH計(jì)：FE20k型，梅特勒-托利多儀器有限公司；

鼓風(fēng)干燥箱：DGG-9240B型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

電子天平：EL3002型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

立式壓力蒸氣滅菌鍋：YXQ-LS-50SII型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；

PCR儀：ProFlex型，美國(guó) Life 公司；

電泳儀：DYY-6C型，北京六一儀器廠；

凝膠成像儀：Gel Doc XR型，美國(guó)伯樂(lè)公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-2100型，尤尼科(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化

(1) 采樣富集培養(yǎng)：從檸檬酸廠生產(chǎn)過(guò)程中采集廢渣樣品4份分別記為S1、S2、S3、S4，廢水樣品4份，分別記為L(zhǎng)1、L2、L3、L4。取4份廢渣樣品各1 g，分別接入50 mL YPD培養(yǎng)基中，吸取廢水樣品各1 mL，分別接入50 mL YPD培養(yǎng)基中，放置于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)條件30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。

(2) 檸檬酸培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)：若菌株具有降解檸檬酸的能力，其在檸檬酸培養(yǎng)基中必定可以生長(zhǎng)，吸取富集培養(yǎng)液2 mL，分別接種于50 mL檸檬酸培養(yǎng)基，放置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)條件30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。

(3) 菌株的分離純化培養(yǎng)：將8個(gè)錐形瓶中的菌液分別進(jìn)行梯度稀釋后涂布于WL平板培養(yǎng)基上，梯度稀釋的比例分別為10-3，10-4，10-5，10-6，10-7。置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件30 ℃，48 h。挑取培養(yǎng)基上疑似酵母菌的菌株劃線接種于平板培養(yǎng)基中，繼續(xù)挑取單菌落重復(fù)平板劃線培養(yǎng)。

1.2.2 菌株保藏 將菌株平板劃線純化培養(yǎng)2代后，挑取單菌落接入50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)36 h，靜置10 min，移液槍吸取1 mL培養(yǎng)基底部較濃菌液于規(guī)格為2 mL的甘油保藏管中，再加入已滅菌的30%甘油1 mL，旋緊管蓋后振蕩混勻，注明菌株名稱和保藏日期，置于菌種保藏盒，上述操作均在超凈臺(tái)無(wú)菌完成。將菌種保藏盒放入-80 ℃超低溫冰箱保藏。

1.2.3 降檸檬酸菌株篩選

(1) 菌株降檸檬酸能力試驗(yàn)：活化菌株接種于檸檬酸液體培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間5 d，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定檸檬酸濃度，比較菌株降解檸檬酸能力。測(cè)定方法采用滴定法，以檸檬酸計(jì)。

(2) 菌株酒精耐受性試驗(yàn)：將活化好的種子液以4%的接種量接種于50 mL 含有5 g/L檸檬酸的YPD液體培養(yǎng)基中，分別加入無(wú)水乙醇，調(diào)整初始酒精體積分?jǐn)?shù)為0%～10%，30 ℃培養(yǎng)5 d，利用紫外分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每組做3個(gè)平行樣。

1.2.4 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 對(duì)酵母菌進(jìn)行平板培養(yǎng)及鏡檢，觀察菌株形態(tài)學(xué)特征。

(1) 菌落培養(yǎng)特征：將菌株活化后挑取單菌落劃線接種于YPD平板培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間2～3 d，觀察平板培養(yǎng)基上菌落形態(tài)。

(2) 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)特征：將菌株活化后挑取單菌落接種于50 mL YPD液體培養(yǎng)基，置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時(shí)間2～3 d，觀察液體培養(yǎng)基中菌體培養(yǎng)狀態(tài)。

(3) 細(xì)胞鏡檢：使用顯微鏡觀察40×10倍下細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5 菌株生理生化鑒定

(1) 糖發(fā)酵試驗(yàn)：鑒定所需發(fā)酵的碳源為葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、D-半乳糖。分別將碳源加入含有杜氏發(fā)酵管的氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加量為0.5%，過(guò)濾除菌(0.20 μm)?；罨闚S2后分別接入不同碳源培養(yǎng)基中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃，每2 d觀察一次，連續(xù)觀察2周，于4周后再次觀察。主要觀察杜氏小管中是否產(chǎn)生氣體從而判斷能否發(fā)酵該種碳源，若有氣泡則記為陽(yáng)性，若無(wú)氣泡則記為陰性，每種碳源做3次重復(fù)[19]19[20]15。

(2) 碳源同化試驗(yàn)：葡萄糖、乳糖、蔗糖、D-半乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘油、甲醇、乙醇、肌醇、甘露醇、檸檬酸、琥珀酸15種碳源。分別將碳源加入氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加量0.5%，另取一不添加碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照，過(guò)濾除菌(0.20 μm)。在YPD液體培養(yǎng)基中活化菌株NS2，取滅菌離心管，倒入培養(yǎng)液離心獲得菌沉淀，離心條件10 000×g，5 min。以無(wú)菌水洗滌沉淀，重復(fù)2次，加入無(wú)菌水制得菌懸液。將菌懸液接種于上述培養(yǎng)基中，接種量5%，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周，培養(yǎng)溫度25 ℃。每周觀察一次，將試管振蕩均勻仔細(xì)觀察菌液是否渾濁，若渾濁則記為陽(yáng)性，若澄清則記為陰性[19]18[20]15。

(3) 氮源同化試驗(yàn)：鑒定為硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸銨、尿素，試驗(yàn)操作與碳源同化試驗(yàn)相同，因?yàn)閜H值小于6時(shí)形成的亞硝酸對(duì)酵母存在毒性，因此調(diào)節(jié)初始pH至6.5[19]19[20]15-16。

1.2.6 菌株分子生物鑒定

(1) 菌株DNA提取：吸取1.5 mL菌液于2 mL EP管中，10 000×g離心10 min；收集沉淀，加2 mL ddH2O混懸均勻；10 000×g離心2 min，得菌沉淀，重復(fù)1次。用細(xì)胞破碎儀破碎，每破碎15 s后將EP管置于冰水浴60 s，重復(fù)5次。加1.5 mL ddH2O混懸均勻，10 000×g離心10 min，得菌沉淀。菌沉淀中加入0.5 mL DNA抽提液(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，100 mmol/L EDTA，pH 8.0，100 mmol/L Na3PO4，1.5 mol/L NaCl)混懸，37 ℃條件下靜置30 min；加入125 μL 10% SDS后，立即加入5 μL 蛋白酶K(濃度為20 mg/mL)，混均后65 ℃水浴1 h，每隔15 min上下顛倒混均樣品；加入700 μL CTAB緩沖液，混均后65 ℃水浴1 h，每隔15 min上下顛倒混均樣品。

所得樣品用等體積的氯仿—異戊醇(體積比24∶1)混均后于4 ℃條件下，12 000×g離心10 min，抽提2～3次；以0.6倍體積的異丙醇于-20 ℃沉淀1 h；4 ℃，12 000×g離心10 min，收集核酸沉淀；加入1 mL 70%的乙醇于4 ℃條件下，12 000×g離心10 min，洗滌沉淀2～3次，倒扣去除過(guò)量水分，于37 ℃干燥DNA約5 min；加50 μL ddH2O溶解沉淀，加入終濃度為0.5 μL/mL的RNA酶，并在37 ℃下水浴消化30～60 min，以去除RNA；得到的DNA樣品置于-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) PCR檢測(cè)方法：將得到的菌株DNA進(jìn)行Touch down PCR擴(kuò)增，對(duì)菌株的18S rDNA區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，真菌采用張霞等[21]在相關(guān)研究中所使用的通用引物，上游引物為NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’，下游引物為NS8：5’-TCCGCAGGTTCACCTACGCGA-3’，擴(kuò)增的片段大小約為1 700 bp。PCR體系為(50 μL)：Taq PCR master mix 25 μL，上下引物各0.5 μL，模板2.5 μL，補(bǔ)無(wú)菌水至50 μL。相應(yīng) PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min(Touch down PCR，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降低1 ℃)；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min(共20個(gè)循環(huán))；72 ℃終延伸7 min[22]。

(3) 電泳檢測(cè)：接通電泳儀，設(shè)定電流45 mA，電壓80 V，當(dāng)指示染料前沿遷移至膠體的2/3處停止電泳，整個(gè)電泳持續(xù)約30 min，跑膠驗(yàn)證。

(4) PCR產(chǎn)物檢測(cè)：將PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果對(duì)微生物進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 降檸檬酸酵母的篩選

2.1.1 降酸酵母菌的篩選與保藏 通過(guò)對(duì)檸檬酸廠廢水廢渣中菌株的富集培養(yǎng)，分離純化，共得到可在檸檬酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的疑似酵母菌15株。按1.2.2中方法對(duì)這些菌株進(jìn)行保藏。

2.1.2 降酸菌株在檸檬酸培養(yǎng)基中的篩選 配制檸檬酸液體培養(yǎng)基，以檸檬酸為唯一碳源培養(yǎng)菌株，篩選具有較強(qiáng)降檸檬酸能力的菌株，測(cè)得檸檬酸培養(yǎng)基中檸檬酸初始含量為11.3 g/L。對(duì)15株保藏菌株進(jìn)行平板活化，另取兩株商業(yè)釀酒酵母菌作為對(duì)照。挑取平板單菌落接入50 mL YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得種子培養(yǎng)基，將種子培養(yǎng)基接入檸檬酸培養(yǎng)基，接種量4%。恒溫?fù)u床培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)條件30 ℃，150 r/min。發(fā)酵結(jié)束后培養(yǎng)基的殘余檸檬酸含量見圖1。

圖1 菌株的檸檬酸降解能力Figure 1 The capability of reducing citric acid

由圖1可知，各個(gè)菌株的降檸檬酸能力強(qiáng)弱不一。菌株NS2、NS7、NL2、NL3、CS8具有較強(qiáng)的檸檬酸降解能力，發(fā)酵5 d后可降解培養(yǎng)基中70%以上的檸檬酸，其余菌株的降檸檬酸能力相對(duì)較弱，而商業(yè)釀酒酵母菌RW和SY在該條件下生長(zhǎng)受到明顯抑制，難以降解利用檸檬酸。其中菌株NS2的降檸檬酸能力最強(qiáng)，在發(fā)酵5 d后檸檬酸含量從11.2 g/L 下降到1.76 g/L，降解培養(yǎng)基中約84%的檸檬酸，對(duì)降檸檬酸能力較強(qiáng)的菌株NS2、NS7、NL2、NL3、CS8進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2 菌株酒精耐受性試驗(yàn)

由于菌株需應(yīng)用于山楂酒釀造中，因此需要對(duì)菌株的酒精耐受性進(jìn)行試驗(yàn)，確定菌株的酒精耐受能力后選取具有較強(qiáng)酒精耐受性的菌株，將其應(yīng)用于山楂酒釀造的適當(dāng)階段。

由圖2可知，5株菌株對(duì)酒精耐受性有所差異。在酒精度為0%vol時(shí)，5株菌的生長(zhǎng)情況均良好，但隨著酒精度的升高，菌液濃度逐漸下降。酒精度在1%～4%vol時(shí)，5株菌均可以生長(zhǎng)，其中NS2酒精耐受能力最強(qiáng)，NL2次之，這兩株菌生長(zhǎng)情況良好，其余3株菌的生長(zhǎng)則受到明顯抑制。當(dāng)酒精度上升到5%vol時(shí)，5株菌的菌液濃度均處在較低水平，當(dāng)酒精度達(dá)到6%vol時(shí)，菌株都已經(jīng)難以生長(zhǎng)。可以看出菌株NS2、NL2的酒精耐受能力相對(duì)較強(qiáng)，可以耐受0%～4%vol的酒精度。初步判斷這5株菌均非釀酒酵母，選取酒精耐受能力相對(duì)較強(qiáng)的NS2、NL2進(jìn)行培養(yǎng)觀察鑒定。

圖2 菌株酒精度耐受性測(cè)試結(jié)果Figure 2 The stress resistance of ethanol

2.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

酵母菌的菌落培養(yǎng)特征與個(gè)體形態(tài)特征，是酵母菌種鑒定的重要依據(jù)之一[23]7-8。

2.3.1 菌落培養(yǎng)特征 菌株NS2的菌落大而厚，表面不光滑，具有細(xì)微褶皺，菌落邊緣呈細(xì)小的鋸齒狀；菌落顏色呈乳白色，正反面及內(nèi)外顏色一致；易用針挑起，菌落質(zhì)地均勻。菌株NL2的菌落呈圓形，大且中間略有凸起，菌落邊緣呈鋸齒狀，顏色呈白色，質(zhì)地均勻。

2.3.2 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)特征 兩株菌的菌液均明顯渾濁，靜置后表面均形成一層較薄的白色醭膜。

2.3.3 個(gè)體形態(tài)特征 對(duì)菌株進(jìn)行40×10倍顯微鏡鏡檢，鏡檢結(jié)果見圖3。

圖3 菌株NS2、NL2的細(xì)胞形態(tài)Figure 3 The Cell morphology ( × 400) of the strain NS2 and NL2

菌株NS2的細(xì)胞形態(tài)為橢圓形，細(xì)胞大小(長(zhǎng)×寬)約為 3.0～4.5 μm×3.5～6.0 μm；菌株NL2的細(xì)胞形態(tài)為圓形，細(xì)胞大小(長(zhǎng)×寬)約為4～5 μm×4～5 μm。

2.4 菌株生理生化試驗(yàn)

2.4.1 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果 一半以上的酵母菌在半?yún)捬鯒l件下至少可以發(fā)酵D-葡萄糖，若菌株可以利用該化合物，則菌株可以通過(guò)無(wú)氧機(jī)制對(duì)糖類化合物進(jìn)行分解代謝，釋放氣體。通過(guò)尋找收集形成的CO2氣體可以鑒定菌株對(duì)該發(fā)酵糖的利用能力[23]25-26。菌株NS2、NL2的糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果?Table 1 The ability of the strains to ferment sugars

? “+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性。

2.4.2 碳源同化試驗(yàn) 不同酵母菌對(duì)某種有機(jī)化合物作為單一碳源的利用能力存在差異，通過(guò)這些差異可以在一定程度上區(qū)分不同酵母菌。這些化合物包括糖類、多羥糖醇和有機(jī)酸類。碳源同化試驗(yàn)即為鑒定酵母菌在好氧環(huán)境下利用這些化合物的能力[23]20-24。菌株NS2、NL2碳源同化試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.4.3 氮源同化試驗(yàn) 有研究[23]24-25發(fā)現(xiàn)大約有1/4的酵母菌可以利用硝酸鹽及其他含氮化合物，因此氮源同化試驗(yàn)對(duì)于鑒定酵母具有重要的應(yīng)用價(jià)值。菌株NS2、NL2的氮源同化試驗(yàn)見表3。

表2 碳源同化試驗(yàn)?Table 2 Carbon Assimilation of the strains

? “+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性。

表3 氮源同化試驗(yàn)?Table 3 Nitrogen Assimilation of the strains

? “+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性。

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果對(duì)菌株NS2、NL2的形態(tài)學(xué)特征及生理生化進(jìn)行分析比對(duì)，對(duì)照文獻(xiàn)[23]34-44中對(duì)于酵母菌的描述，菌株NS2符合畢赤酵母菌的生理生化及形態(tài)學(xué)特征，菌株NL2符合熱帶假絲酵母的生理生化及形態(tài)學(xué)特征，因此初步判斷這兩株菌分別為畢赤酵母菌、熱帶假絲酵母菌。

2.5 菌株分子生物學(xué)鑒定

按1.2.6中方法提取菌株的DNA，進(jìn)行18S rDNA PCR擴(kuò)增，電泳圖見圖4，兩株菌的PCR產(chǎn)物均在1 700 bp處有明亮條帶，判斷得到的產(chǎn)物為目的產(chǎn)物。

圖4 菌株NS2和NL2的18S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖Figure 4 Result of 18S rDNA PCR amplify of NS2 and NL2

將擴(kuò)增產(chǎn)物送至金斯瑞公司測(cè)序，NS2、NL2的測(cè)序結(jié)果見附錄1。菌株NS2、NL2經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的18S rDNA序列全長(zhǎng)為1 700 bp左右，在NCBI中BLAST比對(duì)進(jìn)行序列同源性分析，菌株NS2的18S序列與Pichiasp.的18S序列同源性最高，相似性達(dá)99%。根據(jù)18S序列使用MAGE軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖5。由圖5可知，NS2與庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)親緣關(guān)系最近，同源性極高，因此將菌株NS2鑒定為Pichiakudriavzevii。

圖5 基于菌株NS2的18S rDNA序列同源性構(gòu)建 的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 Phylogenetic tree of NS2 based on 18S rDNA sequences

菌株NL2的18S序列與Candidasp.的18S序列同源性最高，相似性達(dá)99%。根據(jù)18S序列使用MAGE軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖6。由圖6可知，NL2與熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)親緣關(guān)系最近，同源性極高，因此將菌株NL2鑒定為Candidatropicalis。

3 結(jié)論

本研究從檸檬酸廢水廢渣中分離培養(yǎng)純化獲得15株耐檸檬酸菌株，測(cè)定降檸檬酸能力發(fā)現(xiàn)其中5株菌株具有較強(qiáng)的降檸檬酸能力，發(fā)酵5 d后檸檬酸含量從11.3 g/L下降到1.8～2.8 g/L，降解了培養(yǎng)基中70%以上的檸檬酸。測(cè)試這5株菌的酒精耐受性，發(fā)現(xiàn)菌株NS2和NL2的酒精耐受能力相對(duì)較強(qiáng)，最高可以耐受4%vol的酒精度，可以考慮將其應(yīng)用于山楂酒釀造初期階段。對(duì)這兩株菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化性質(zhì)分析，結(jié)合分子生物學(xué)手段初步鑒定菌株NS2為Pichiakudriavzevii，菌株NL2為Candidatropicalis，為今后研究生物降酸法降低山楂酒中檸檬酸提供了理論支持。

圖6 基于菌株NL2的18S rDNA序列同源性構(gòu)建的 系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 6 Phylogenetic tree of NL2 based on 18S rDNA sequences

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Study on isolation and identification of reducing citric acid strains

ZHANGDuo1,2,3

MAOYong4

MAOJian1,2,3,5,6

LIUShuang-ping1,2,3,5,6

ZHOUZhi-lei1,2,3,5,6

(1.NationalEngineeringLaboratoryforCerealFermentationTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China; 2.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China; 3.SynergeticInnovationCenterofFoodSafetyandNutrition,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China; 4.ChinaAlcoholicDrinksAssociation,Beijing100831,China; 5.NationalEngineeringResearchCenterofChineseRiceWine,Shaoxing,Zhejiang312000,China; 6.JiangnanUniversityandRugaoInstituteofFoodTechnology,Rugao,Jiangsu225004,China)

In order to screen the strains which have the capability of reducing the citric acid, 15 strains of yeasts were isolated from the materials of waste water and waste residue. The waste water and residue were collected in the citric acid factory. The yeasts were screened based on the capability of fermenting the citric acid. It was found that the 5 strains had good capability of reducing the citric acid. They could reduce at least 70% citric acid of the culture medium after 5 d fermentation. The 5 strains were tested the stress resistance of ethanol. The strain NS2 and NL2 have strong stress resistance. The morphological and physiology characteristics of NS2 and NL2 were measured by microscopic observation, assimilation of carbon and nitrogen. Then the two strains were identified by 18S rDNA sequencing and the phylogenetic analysis. In the end, NS2 was identified asPichiakudriavzevii, NL2 was identified asCandidatropicalis. They can be used in the technology of acid reduction in the hawthorn wine in the future.

Yeast; Acid Reduction;Pichia; Screen; Sequencing; Identification

國(guó)家自然科學(xué)基金-面上項(xiàng)目(編號(hào)：31571823)；江蘇省自然科學(xué)基金-面上研究項(xiàng)目(編號(hào)： BK20161293)；2015年度區(qū)科技重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)，編號(hào)：NY2015009)

張鐸，男，江南大學(xué)在讀碩士研究生。

毛健(1970—)，男，江南大學(xué)教授，博士研究生導(dǎo)師，博士。E-mail：maojian@jiangnan.edu.cn

2017—03—10

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.001