復(fù)方酸棗仁顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

吳瓊　胡北　李想

[摘要] 目的 對(duì)復(fù)方酸棗仁顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。 方法 采用薄層色譜法（TLC）對(duì)制劑中的酸棗仁、知母、甘草三味藥材進(jìn)行專(zhuān)屬性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)處方中藥材知母的有效成分芒果苷進(jìn)行含量測(cè)定。色譜柱為Welchrom C18 HPLC Column（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（7∶7∶86），檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃。 結(jié)果 酸棗仁、知母、甘草三味藥材的TLC特征斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性沒(méi)有干擾。芒果苷在1.072～167.5 μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=42 888X-30 400，r = 0.999 9。平均加樣回收率為99.15%，RSD=2.82%（n = 6）。3批樣品中芒果苷的含量分別為0.1690、0.2473、0.2735 mg/g，符合要求。 結(jié)論 所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確、重復(fù)性良好，可用于復(fù)方酸棗仁顆粒的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 復(fù)方酸棗仁顆粒；芒果苷；高效液相色譜法；薄層色譜法；質(zhì)量控制

[中圖分類(lèi)號(hào)] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）05（c）-0144-05

[Abstract] Objective To establish the quality standard for Fufang Suanzaoren Granules. Methods Ziziphi spinosae semen， Anemarrhenae rhizome， Glycyrrhizae radix et rhizoma were identified by TLC. The contents of mangiferin were determined by HPLC. HPLC method on mangiferin was adopted on a Welchrom C18 （4.6 mm×200 mm， 5 μm） column with Methanol-acetonitrile-0.5% acetic acid （7∶7∶86） as the mobile phase， the flow rate was 1.0 mL/min， the detection wavelength was 258 nm， the column temperature was 30℃ and the injection volum was 10 μL. Results TLC spots of Ziziphi spinosae semen， Anemarrhenae rhizome， Glycyrrhizae radix et rhizoma were clear with good resolution and without interference of negative samples. There was a good linearity within the range of 1.072-167.5 μg/mL， with the linear equation of Y=42 888X-30 400， r = 0.999 9. The average recovery of berberine hydrochloride was 99.15% and the RSD was 2.82% （n = 6）. The content of Mangiferin in three batchs samples were satisfactory. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible. It can be used as the quality control method of Fufang Suanzaoren Granules.

[Key words] Fufang Suanzaoren Granules； Mangiferin； HPLC； TLC； Quality standard

復(fù)方酸棗仁顆粒含有川芎、知母、酸棗仁、甘草、茯苓五味中藥，具有養(yǎng)肝血，安心神，調(diào)血養(yǎng)肝，清熱除煩的功效，用于治療虛勞煩不得眠、心悸、盜汗、頭暈?zāi)垦?、咽干口燥、脈弦或細(xì)數(shù)所致的心煩失眠等癥，臨床應(yīng)用中療效確切，效果較好。復(fù)方酸棗仁顆粒是由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）生產(chǎn)的，根據(jù)總后勤部衛(wèi)生部下發(fā)的“軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃”中對(duì)醫(yī)院制劑標(biāo)準(zhǔn)研究項(xiàng)目的提高的要求，對(duì)復(fù)方酸棗仁顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了再提高和進(jìn)一步完善[1]。復(fù)方酸棗仁顆粒中的知母是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，性苦、甘、寒，有清熱瀉火，滋陰潤(rùn)燥之功效[2]。復(fù)方酸棗仁顆粒的原制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)，為了提高制劑的質(zhì)量，應(yīng)用薄層色譜法（TLC）對(duì)復(fù)方酸棗仁顆粒中的酸棗仁、知母、甘草三味藥材展開(kāi)了專(zhuān)屬性鑒別，同時(shí)應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定了知母的有效成分芒果苷的含量。

1 儀器與試藥

AUW120D型分析天平（日本島津公司）；KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率150 W，頻率40 kHz）；W600型Waters高效液相色譜儀（2996型紫外檢測(cè)器）；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）；芒果苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)為：111607-201503）；甘草苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)為：111610-201106）；知母對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)為：1070-200002）；酸棗仁對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)為：121517-201103）；復(fù)方酸棗仁顆粒（我院，批號(hào)分別為：20151008、20151212、20151215）；自制的知母、酸棗仁、甘草陰性樣品各1批；乙醇（沈陽(yáng)市蘇家屯區(qū)遼河化工廠）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；乙腈（色譜純，Sigma公司）；乙酸（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；水為重蒸水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酸棗仁藥材的薄層色譜鑒別 取復(fù)方酸棗仁顆粒20 g，研細(xì)，置圓底燒瓶中，加甲醇100 mL，加熱回流1 h，將其濾過(guò)，并將其濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使之溶解，之后用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次15 mL，合并正丁醇提取液，用氨水洗滌2次，每次用量10 mL，并將洗液棄去，將正丁醇液用水浴蒸干，用1 mL甲醇溶解殘?jiān)?，將此溶液作為?fù)方酸棗仁顆粒的供試品溶液[2-6]。另取酸棗仁對(duì)照藥材2 g，加入甲醇30 mL，依供試品溶液制法制成對(duì)照藥材溶液[2-6]。照TLC試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液及對(duì)照藥材溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）的上層為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，置于105℃加熱至斑點(diǎn)清晰[7-8]。供試品色譜中，在與酸棗仁對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)；在陰性樣品色譜中于相應(yīng)的位置上無(wú)干擾（圖1）。

2.1.2 知母薄層鑒別 取本品8 g，研細(xì)，置圓底燒瓶中，加乙醇40 mL，鹽酸1 mL，加熱回流1.5 h，放冷，濾過(guò)，取續(xù)濾液，加水10 mL，加甲苯振搖提取2次，每次20 mL，過(guò)濾后合并甲苯溶液，將其水浴蒸干，加入1 mL甲醇溶解殘?jiān)?，將此溶液作為?fù)方酸棗仁顆粒的供試品溶液[2-3]。另取知母對(duì)照藥材0.5 g，同供試品溶液制法制成對(duì)照藥材溶液。照TLC試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液及對(duì)照藥材溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮（7∶3）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。噴以5%香草醛硫酸溶液，置于105℃加熱至斑點(diǎn)清晰[9-10]。供試品色譜中，在與知母對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；在陰性對(duì)照樣品色譜中于相應(yīng)的位置上無(wú)干擾（圖2）。

2.1.3 甘草薄層鑒別 取復(fù)方酸棗仁顆粒16 g，研細(xì)，加入甲醇30 mL，超聲處理40 min，濾過(guò)，將濾液置于水浴蒸干，加入1 mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取甘草苷對(duì)照品，加甲醇，制成1 mg/mL的甘草苷溶液，作為對(duì)照品溶液[2-3]。照TLC試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液及對(duì)照品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水（10∶1∶1∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，置于105℃加熱至斑點(diǎn)清晰[11-12]。供試品色譜中，在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；在陰性樣品色譜中于相應(yīng)的位置上無(wú)干擾（圖3）。

2.2 芒果苷含量的測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Welchrom C18（4.6 mm×200 mm， 5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（7∶7∶86）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按芒果苷計(jì)算應(yīng)不低于3000[2-3，13-16]。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取適量芒果苷對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加入流動(dòng)相使溶解，制成每毫升含芒果苷10 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液及陰性供試品溶液的制備 取復(fù)方酸棗仁顆粒，研細(xì)，取約5 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL的70%乙醇，密塞后，稱(chēng)定其重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱(chēng)定其重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻后，濾過(guò)，量取續(xù)濾液2 mL，置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻，即得[17-18]。

另取缺少知母的陰性樣品顆粒，按供試品溶液制備的處理方法進(jìn)行處理，制得陰性樣品溶液。進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

2.2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下3種溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定。精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各10 μL，于高效液相色譜儀中測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖4，芒果苷的保留時(shí)間約為24 min，陰性樣品不干擾芒果苷的方法測(cè)定，芒果苷與其他的雜質(zhì)或成分的分離度>1.5，理論塔板數(shù)按芒果苷計(jì)算應(yīng)不低于3000。試驗(yàn)結(jié)果表明此方法專(zhuān)屬性強(qiáng)。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取濃度分別為1.072、3.216、10.72、42.880、167.500 μg/mL的芒果苷對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，按“2.2.1”色譜條件分析，測(cè)定各對(duì)照品的峰面積，以對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：Y=42 888X-30 400，r = 0.999 9。結(jié)果表明，芒果苷在1.072～167.5 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液（10 μg/mL）10 μL，連續(xù)進(jìn)針6次進(jìn)行測(cè)定，記錄各個(gè)色譜峰的峰面積，測(cè)得芒果苷峰面積的RSD為1.37%（n = 6）。結(jié)果表明，儀器的精密度符合要求。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批復(fù)方酸棗仁顆粒樣品（批號(hào)：20151212），研細(xì)，取約5 g，精密稱(chēng)定，按照“2.2.3”供試品溶液制備的方法進(jìn)行操作，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，分別在0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，測(cè)定樣品中不同時(shí)間段芒果苷的色譜峰峰面積，測(cè)得芒果苷峰面積的RSD為2.23%（n = 6）。說(shuō)明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批顆粒樣品（批號(hào)：20151212），研細(xì)，取約5 g，對(duì)其精密稱(chēng)定，按照“2.2.3”供試品溶液制備的方法進(jìn)行操作，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定每份供試樣品中芒果苷的含量[17-18]。結(jié)果顯示樣品中芒果苷的平均含量為0.2581 mg/g，RSD為2.34%（n = 6）。結(jié)果表明，本方法的重復(fù)性良好，符合要求。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批酸棗仁顆粒樣品（批號(hào)：20151211），研細(xì)，取約2.5 g（共6份），精密稱(chēng)定，分別精密加入芒果苷對(duì)照品溶液（0.67 mg/mL）1.0 mL，按照“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備的方法進(jìn)行操作，制成供測(cè)定回收率用的供試品溶液[17-20]，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件分析，測(cè)定樣品中芒果苷含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果該樣品中芒果苷的平均回收率為99.15%，RSD為2.82%（n = 6）；結(jié)果表明，本方法回收率較高。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.10 樣品含量測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的復(fù)方酸棗仁顆粒樣品（批號(hào)：20151008、20151212、20151215），按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，測(cè)定樣品中芒果苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果3批樣品芒果苷的含量分別為0.1690、0.2473、0.2735 mg/g。

3 討論

3.1 薄層鑒別

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)酸棗仁鑒別所采用的TLC展開(kāi)劑參考《中國(guó)藥典》2015年版酸棗仁鑒別項(xiàng)下的相關(guān)條件，最終采用正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）的上層為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，結(jié)果斑點(diǎn)清晰、陰性無(wú)干擾[2-6]。

3.2 含量測(cè)定

處方中君藥為酸棗仁，依照《中國(guó)藥典》2015年版一部中規(guī)定，選取酸棗仁皂苷A作為含量測(cè)定項(xiàng)，但試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，酸棗仁皂苷A含量過(guò)低，實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)法實(shí)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)峰的良好分離。故選擇對(duì)知母中有效成分芒果苷進(jìn)行含量測(cè)定。

參考《中國(guó)藥典》芒果苷的含量測(cè)定項(xiàng)下流動(dòng)相的選擇，選用甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（10∶5∶85）、甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（8∶8∶84）、甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（7∶7∶86）為流動(dòng)相作為試驗(yàn)條件進(jìn)行了考察，待測(cè)樣品與雜質(zhì)不能完全分離，陰性樣品有干擾，進(jìn)而調(diào)整流動(dòng)相的比例，最終選擇了甲醇-乙腈-0.5%的乙酸水（7∶7∶86）為流動(dòng)相，待測(cè)樣品可與雜質(zhì)可完全分離，陰性樣品沒(méi)有干擾，并取得了較好的峰形和較高的理論塔板數(shù)，效果良好[2]。

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（收稿日期：2017-01-30 本文編輯：李亞聰）