• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    STAT1基因敲除提高小鼠對(duì)EV71病毒的敏感性研究

    2017-07-05 18:31李光超張倩武婧
    關(guān)鍵詞:炎癥因子病毒感染

    李光超 張倩 武婧

    [摘要] 目的 分析STAT1基因敲除小鼠免疫相關(guān)因子表達(dá)差異,觀察STAT1基因敲除小鼠感染EV71病毒后的癥狀表現(xiàn)及病毒載量,為EV71抗病毒治療提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。 方法 LPS刺激STAT1基因敲除小鼠后,利用微珠免疫分析(CBA)方法對(duì)血清免疫相關(guān)因子定量分析;EV71感染STAT1基因敲除小鼠后,觀察癥狀及病理表現(xiàn),利用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)對(duì)肌肉病毒RNA定量分析。 結(jié)果 LPS刺激后,STAT1基因敲除小鼠血清多種細(xì)胞因子分泌水平下降(P < 0.01);EV71感染后,STAT1基因敲除小鼠病理?yè)p傷加重,肌肉中病毒載量升高(P < 0.01),與野生型小鼠相比表現(xiàn)出更嚴(yán)重的癥狀與更高的死亡率。 結(jié)論 STAT1在抗EV71感染的免疫過(guò)程中扮演重要角色,提示STAT1基因敲除可以提高小鼠對(duì)EV71病毒的敏感性。

    [關(guān)鍵詞] 病毒感染;EV71;STAT1;炎癥因子

    [中圖分類號(hào)] R373 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2017)05(c)-0014-05

    [Abstract] Objective To analyze the differential expression of immune-associated factors in STAT1 knockout mice, and observe the symptoms and viral load after EV71 virus infection, in order to provide a data base for anti-EV71 therapy. Methods Cytometric bead assay (CBA) was used to quantitative analysis the levels of serum immune-associated factors in STAT1 knockout mice after LPS-induced treatment. The symptom and tissue pathological features were observed and the level of muscle virus RNA was quantitated by real-time PCR in STAT1 knockout mice after EV71 virus infection. Results The levels of multi- immune-associated factors were decreased in STAT1 knockout mice after LPS stimulating (P < 0.01), and pathological damage was aggravated accompanied by the higher viral load in muscle (P < 0.01), also severe symptoms and higher mortality when compared to wide type mice after EV71 infection. Conclusions STAT1 plays an important role in the immune responseafter EV71 infection.Thus, STAT1 gene deletion can improve the sensitivity of mice to EV71 virus.

    [Key words] Virus infection; EV71; STAT1; Inflammatory cytokines

    手足口病是嬰幼兒最常見(jiàn)的傳染病,好發(fā)于5歲以下嬰幼兒[1]。腸道病毒71型(EV71)屬于人類腸道病毒A屬的小RNA病毒科,為常見(jiàn)的引起手足口病的病毒之一。病毒在腸道存活時(shí)間可達(dá)10周[2],引起嚴(yán)重的臨床癥狀,甚至導(dǎo)致患者死亡[3]。嬰幼兒感染EV71后,常發(fā)生手、足、口皰疹,以及引發(fā)無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、急性遲緩性麻痹、神經(jīng)源性水腫等多種神經(jīng)性疾病[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì),手足口病患者中感染EV71所導(dǎo)致的患者死亡率始終居高不下[5]。

    JAK/STAT信號(hào)通路是一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。STAT1作為STAT家族發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)成員,是JAK/STAT信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,具有免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等功能[6],在機(jī)體抗腫瘤免疫中也發(fā)揮重要的作用[7]。脂多糖(LPS)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分,作為細(xì)菌引起機(jī)體發(fā)熱反應(yīng)的主要成分之一,可引起免疫炎性反應(yīng)[8]。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予小鼠LPS刺激后,STAT1可與TLR4協(xié)同作用,使細(xì)胞因子分泌水平升高,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的功能[9]。

    STAT1也是機(jī)體免疫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)抗病毒、減少組織損傷的的媒介之一,調(diào)節(jié)JAK/STAT通路可以對(duì)EV71病毒的感染免疫產(chǎn)生影響[10]。STAT1在EV71病毒感染過(guò)程中可以發(fā)揮抗病毒的作用,同時(shí)EV71病毒也可以影響STAT1信號(hào)通路的激活。對(duì)EV71病毒感染細(xì)胞進(jìn)程中STAT1的影響進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),THP-1細(xì)胞的在EV71感染后STAT1磷酸化水平增加,使JAK/STAT信號(hào)通路激活[11];橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞STAT1介導(dǎo)的信號(hào)通路在EV71感染后,會(huì)通過(guò)干擾素途徑使其激活[12]。目前對(duì)EV71感染進(jìn)程中STAT1的作用研究多處于細(xì)胞水平[13],利用STAT1基因敲除的小鼠模型進(jìn)行動(dòng)物整體水平的研究鮮有報(bào)道。本研究利用STAT1敲除的C57BL/6小鼠模型,在整體動(dòng)物水平探討STAT1基因?qū)V71病毒復(fù)制的影響,為減少病毒復(fù)制及控制感染癥狀等治療提供可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 主要試劑與儀器 Trizol試劑 (Life Technologies);cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific);實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)染料(Applied Biosystems);鼠抗EV71單克隆抗體(Millipore, MAB979);細(xì)胞CBA檢測(cè)抗體(BD)。流式細(xì)胞儀(BD FACSCanto II);激光共聚焦顯微鏡(Leica Microsystems GmbH)。

    1.1.2 病毒 病毒為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所EV71課題組利用EV71病毒FY0805病毒株,經(jīng)ICR小鼠傳代適應(yīng)株MP10(Accession number: HQ712020)[14],儲(chǔ)存滴度1×109 TCID50。

    1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)STAT1-/- C57BL/6小鼠22只,體重7~9 g,10日齡;SPF級(jí)STAT1+/- C57BL/6小鼠20只,體重7~9 g,10日齡;SPF級(jí)野生型C57BL/6小鼠20只,體重7~9 g,10日齡;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究中心研制,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2014-0004,試驗(yàn)單位使用許可證編號(hào):SYXK(京)2015-0035。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 動(dòng)物分組 LPS刺激組:STAT1-/- (n = 10), STAT1+/- (n = 8),野生型 (n = 8)。EV71感染組:STAT1-/- (n = 6),STAT1+/-(n = 6),野生型 (n = 6)。衛(wèi)星組:STAT 1-/- (n = 6),STAT1+/-(n = 6),野生型(n = 6)。

    1.2.2 LPS刺激 3周齡C57BL/6小鼠腹腔注射LPS,劑量為每克體重10 μg。注射后24 h取小鼠血清,CBA方法檢測(cè)血清IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12/IL-23p40、MIP-1α、TNF-α。

    1.2.3 EV71病毒感染及一般指標(biāo)檢測(cè) EV71感染組及衛(wèi)星組C57BL/6小鼠10日齡,腹腔注射1×107 TCID50(致死劑量),在感染后9 d內(nèi)每日觀察并記錄體重、癥狀、生存率指標(biāo)。臨床癥狀評(píng)分為:0,無(wú)癥狀;1,豎毛;2,后肢行動(dòng)遲緩;3,單側(cè)后肢癱瘓;4,全部后肢癱瘓;5,死亡。感染后3 d對(duì)衛(wèi)星組小鼠實(shí)行安樂(lè)死,取后肢腿部肌肉30 mg,TRIzol法提取全RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA,利用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法對(duì)特異性片段擴(kuò)增并定量。所用引物序列編號(hào)為EV71-S1 (5'-AGATAGGGTGGCAGATGTAATTGAAAG-3')和EV71-A1(5'-TAGCATTTGATGATGCTCCAATTTCAG-3')。

    1.2.4 HE染色及免疫熒光分析 感染3 d后,衛(wèi)星組小鼠給予安樂(lè)死,取后肢肌肉,10%福爾馬林固定48 h,脫水后石蠟包埋,HE染色觀察病理變化。免疫熒光染色利用抗EV71單克隆抗體(1∶500)作為一抗,4℃過(guò)夜,隨后0.01 mol/L PBS清洗,鼠抗兔IgG(H+L)作為二抗(1∶200)孵育,0.01 mol/L PBS清洗后附熒光抗體,在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

    2 結(jié)果

    2.1 LPS刺激后STAT1敲除小鼠血清細(xì)胞因子水平降低

    對(duì)LPS刺激組的血清細(xì)胞因子定量分析發(fā)現(xiàn),STAT1基因敲除小鼠的血清細(xì)胞因子水平出現(xiàn)不同程度降低。腹腔注射LPS 24 h后,對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子進(jìn)行定量分析的結(jié)果顯示,STAT1基因敲除小鼠血清細(xì)胞因子的分泌水平都有不同程度的降低。與野生型小鼠相比,STAT1-/-小鼠細(xì)胞因子降低水平高于STAT1+/-小鼠,具體為:IL-1α(60.69%,P < 0.01)、IL-1β(91.92%,P < 0.01)、IL-6(79.93%,P < 0.05)、IL-10(56.66%,P < 0.01)、IL-12/IL-23p40(72.58%,P < 0.01)、TNF-α(62.03%,P < 0.01)以及Mouse MIP-1α(45.09%,P < 0.01)。在所檢測(cè)細(xì)胞因子中,小鼠IL-1β的降低水平最為明顯(P < 0.01)。見(jiàn)圖1。

    2.2 EV71感染后STAT1敲除小鼠癥狀加重

    EV71感染后,與野生型STAT1+/-小鼠相比,STAT1-/-小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的臨床癥狀、更高的死亡率以及更高的病毒載量。結(jié)果表明,EV71感染后,野生型小鼠在感染后6 d出現(xiàn)死亡,而STAT1-/-小鼠在感染4 d后出現(xiàn)死亡情況,死亡時(shí)間提前。感染6 d后STAT1-/-小鼠全部死亡,生存率為零,與其他組小鼠相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)(圖2A)。對(duì)感染EV71后小鼠出現(xiàn)的癥狀表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)分并統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),STAT1-/-小鼠在感染3 d后癥狀急劇惡化(斜率增加),與其他組相比癥狀表現(xiàn)更為嚴(yán)重(圖2B)。伴隨癥狀加重,STAT1-/-小鼠在感染3 d后的體重明顯減輕,其他兩組小鼠隨時(shí)間變化體重逐漸增加(圖2C)。對(duì)肌肉病毒載量檢測(cè)結(jié)果顯示,STAT1-/-小鼠的肌肉病毒載量明顯高于野生型小鼠與STAT1+/-小鼠,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。見(jiàn)圖2D。

    2.3 EV71感染后STAT1敲除小鼠組織損傷加重

    利用HE染色對(duì)小鼠后肢肌肉的病理變化進(jìn)行觀察,利用免疫熒光技術(shù)對(duì)不同組小鼠后肢肌肉中EV71抗原的表達(dá)量進(jìn)行了對(duì)比。400倍鏡下對(duì)EV71抗原熒光染色結(jié)果顯示,EV71抗原在小鼠后肢肌肉中有聚集現(xiàn)象,與野生型組相比,這種現(xiàn)象在STAT1-/-小鼠中更加明顯(圖3B),據(jù)此推測(cè)EV71在STAT-/-小鼠后肢肌肉中復(fù)制水平增高。與野生型及STAT1+/-相比,STAT1-/-小鼠表現(xiàn)出大片炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與組織纖維化(圖3A),組織損傷情況更為嚴(yán)重。見(jiàn)圖3。從生存率、病毒載量、HE染色等檢測(cè)指標(biāo)可見(jiàn),STAT1基因敲除小鼠抵抗EV71病毒感染復(fù)制的能力存在嚴(yán)重缺陷,可能是導(dǎo)致EV71病毒感染加重的原因。

    3 討論

    通過(guò)LPS刺激對(duì)免疫相關(guān)的細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析,在LPS刺激后STAT1-/-小鼠免疫相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平降低,與之前報(bào)道的結(jié)論[15]。本研究證實(shí)STAT1基因敲除可以對(duì)C57BL/6小鼠的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響。STAT1作為一種轉(zhuǎn)錄因子,可以通過(guò)與其它的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后,激活或抑制[16],其表達(dá)調(diào)控過(guò)程比較復(fù)雜。STAT1的作用包括誘導(dǎo)CXCL9、P21WAF1/CIP1、IFI205等基因的表達(dá)[17],直接誘導(dǎo)MCP1等趨化因子產(chǎn)生[18],以及與NF-κB協(xié)同參與免疫調(diào)節(jié)[19]等等。LPS刺激后,STAT1-/-小鼠與STAT1+/-小鼠的白介素、TNF-α、MIP-1α等細(xì)胞因子水平下調(diào),且STAT1-/-小鼠下調(diào)的程度高于STAT1+/-小鼠,證明STAT1參與了小鼠免疫應(yīng)答。

    有研究報(bào)道,IL-1β基因轉(zhuǎn)錄可以通過(guò)JAK/STAT信號(hào)途徑進(jìn)行調(diào)控[20]。在本實(shí)驗(yàn)中,STAT1-/-小鼠的血清IL-1β因子在LPS刺激下其分泌水平下調(diào)了90%以上,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01),推測(cè)可能是由于STAT1信號(hào)通路的影響引起IL-1β轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)所導(dǎo)致的。

    本實(shí)驗(yàn)證實(shí),STAT1基因敲除可以導(dǎo)致小鼠對(duì)EV71的敏感性增高。EV71病毒感染STAT1基因敲除小鼠后,其生存率、體重水平明顯降低,癥狀嚴(yán)重程度及病毒載量顯著增高,肌肉病理?yè)p傷更加嚴(yán)重,免疫熒光染色結(jié)果也可以觀察到EV71抗原在STAT1-/-小鼠肌肉的聚集水平升高。在整體動(dòng)物水平上印證了之前報(bào)道過(guò)的關(guān)于EV71感染實(shí)驗(yàn)的結(jié)論[13]。

    STAT1在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中扮演重要的角色,STAT-/-小鼠模型的構(gòu)建,對(duì)研究機(jī)體免疫功能提供了強(qiáng)有力的研究工具?,F(xiàn)已證實(shí)STAT1基因的缺失導(dǎo)致小鼠對(duì)EV71的敏感性增高。本實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物整體水平上探索了STAT1在抗EV71感染中的作用,可以為今后減少病毒復(fù)制及控制感染癥狀等治療提供可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] Lu J,Zeng H,Zheng H,et al. Hand,foot and mouth disease in Guangdong,China,in 2013:new trends in the continuing epidemic [J]. Clin Microbiol Infect,2014,20(7):442-445.

    [2] Teng S,Wei Y,Zhao SY,et al. Intestinal detoxification time of hand-foot-and-mouth disease in children with EV71 infection and the related factors [J]. World J Pediatr,2015, 11(4):380-385.

    [3] Shen J,Zhao C,Cao P,et al. Relationship between serologic response and clinical symptoms in children with enterovirus 71-infected hand-foot-mouth disease [J]. Int J Clin Exp Pathol,2015,8(9):11608-11614.

    [4] Huang HI,Chang YY,Lin JY,et al.Interactome analysis of the EV71 5' untranslated region in differentiated neuronal cells SH-SY5Y and regulatory role of FBP3 in viral replication [J]. Proteomics,2016,16(17):2351-2362.

    [5] 隋美麗,李懿,劉新奎,等.手足口病流行病學(xué)-病原學(xué)及重癥化機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2017, 12(1):92-98.

    [6] Catalfamo M,Cecile LS,Luckey MA,et al. Overexpression of total STAT1 during lymphopenia-induced proliferation leads to decrease CD4 T cell survival [J]. J Immunol,2016, 196(1 Supplement):55-56.

    [7] Hsu KS,Zhao X,Cheng X,et al. Dual regulation of Stat1 and Stat3 by the tumor suppressor protein PML contributes to IFNα-mediated inhibition of angiogenesis [J]. J Biol Chem,2017:jbc.M116.771071.

    [8] Lee SH,Kwak CH,Lee SK,et al. Anti-inflammatory effect of ascochlorin in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophage cells is accompanied with the down-regulation of iNOS,COX-2 and proinflammatory cytokines through NF-κB,ERK1/2,and p38 signaling pathway [J]. J Cell Biochem,2016,117(4):978-987.

    [9] Luu K,Greenhill CJ,Majoros A,et al. STAT1 plays a role in TLR signal transduction and inflammatory responses [J]. Immunol Cell Biol,2014,92(9):761-769.

    [10] Zou R,Zhang G,Li S,et al. A functional polymorphism in IFNAR1 gene is associated with susceptibility and severity of HFMD with EV71 infection [J]. Sci Rep,2015, 2015:5.

    [11] 李圓圓,史偉峰,史梅,等. JAK/STAT信號(hào)通路對(duì)腸道病毒71型感染的調(diào)控作用[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2015,33(9):683-686.

    [12] Wang LC,Chen SO,Chang SP,et al. Enterovirus 71 proteins 2A and 3D antagonize the antiviral activity of Gamma interferon via signaling attenuation [J]. J Virol,2015, 89(14):7028-7037.

    [13] Pathinayake PS,Hsu ACY,Wark PAB. innate immunity and immune evasion by Enterovirus 71 [J]. Viruses,2015,7(12):6613-6630.

    [14] Xiu J,Zhu H,Xu Y,et al. Necrotizing myositis causes restrictive hypoventilation in a mouse model for human enterovirus 71 infection [J]. Virol J,2013,10(1):215.

    [15] Lee HH,Shin JS,Lee WS,et al. Biflorin,isolated from the flower buds of Syzygiumaromaticum L.,suppresses LPS-induced inflammatory mediators via STAT1 inactivation in macrophages and protects mice from endotoxin shock [J]. J Nat Products,2016,79(4):711-720.

    [16] Kim S,Koga T,Isobe M,et al. Stat1 functions as a cytoplasmic attenuator of Runx2 in the transcriptional program of osteoblast differentiation [J]. Genes Development,2003,17(16):1979-1991.

    [17] Chaudhuri A,Yang B,Gendelman HE,et al. STAT1 signaling modulates HIV-1-induced inflammatory responses and leukocyte transmigration across the blood-brain barrier [J]. Blood,2008,111(4):2062-2072.

    [18] Matikainen S,Pirhonen J,Miettinen M,et al. Influenza A and sendai viruses induce differential chemokine gene expression and transcription factor activation in human macrophages [J]. Virology,2000,276(1):138-147.

    [19] Swierkot J,Nowak B,Czarny A,et al. The activity of JAK/STAT and NF-κB in patients with rheumatoid arthritis [J]. Advances Clin Expe Med,2016,25(4):709-717.

    [20] Lee C,Lim HK,Sakong J,et al. Janus kinase-signal transducer and activator of transcription mediates phosphatidic acid-induced interleukin (IL)-1β and IL-6 production [J]. Mol Pharmacol,2006,69(3):1041-1047.

    (收稿日期:2017-01-27 本文編輯:蘇 暢)

    猜你喜歡
    炎癥因子病毒感染
    預(yù)防諾如病毒感染
    丙型肝炎病毒感染和2型糖尿病的相關(guān)性
    豬細(xì)小病毒感染的防治
    豬瘟病毒感染的診治
    烏司他丁對(duì)急腹癥患者圍術(shù)期炎癥因子的影響
    胸腔鏡微創(chuàng)手術(shù)對(duì)早期周圍型肺癌患者術(shù)后炎癥反應(yīng)和免疫功能的影響
    胸腹腔鏡微創(chuàng)手術(shù)與傳統(tǒng)開(kāi)胸手術(shù)對(duì)食管癌患者術(shù)后肺功能、炎癥因子水平的影響
    阿托伐他汀強(qiáng)化降脂對(duì)急性腦梗死患者療效與炎癥因子的影響
    血必凈治療重癥肺炎的效果觀察及對(duì)炎癥因子和氧化、抗氧化因子的影響
    氨氯地平聯(lián)合阿托伐他汀對(duì)高血壓合并高血脂患者內(nèi)皮功能的影響
    在线观看免费高清a一片| 国产伦理片在线播放av一区| 十分钟在线观看高清视频www| 宅男免费午夜| 亚洲精品日本国产第一区| 国产一区二区在线观看日韩| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 亚洲欧美成人综合另类久久久| 宅男免费午夜| 妹子高潮喷水视频| 精品午夜福利在线看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲成人一二三区av| 久久久久人妻精品一区果冻| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产av一区二区精品久久| 下体分泌物呈黄色| 久久久精品94久久精品| 91国产中文字幕| 久久鲁丝午夜福利片| 成年av动漫网址| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产av码专区亚洲av| 91成人精品电影| 91精品国产国语对白视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久久久国产精品人妻一区二区| 一级a做视频免费观看| 久久免费观看电影| 不卡视频在线观看欧美| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产一级毛片在线| 麻豆乱淫一区二区| 青春草国产在线视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 18禁动态无遮挡网站| 新久久久久国产一级毛片| 国产免费又黄又爽又色| 国产午夜精品一二区理论片| 国产成人精品一,二区| 亚洲经典国产精华液单| 欧美日韩精品成人综合77777| 制服人妻中文乱码| 国产精品久久久久久久久免| 成人亚洲精品一区在线观看| 午夜日本视频在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 精品一品国产午夜福利视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 黑人猛操日本美女一级片| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品久久久久久精品电影小说| a级毛色黄片| 久久精品国产亚洲av天美| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 99久久中文字幕三级久久日本| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久久国产精品麻豆| 中文字幕人妻熟女乱码| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲久久久国产精品| 久久99蜜桃精品久久| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产亚洲一区二区精品| 久久久久国产网址| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 黄色毛片三级朝国网站| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲中文av在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲国产最新在线播放| 涩涩av久久男人的天堂| 久久99一区二区三区| 一本色道久久久久久精品综合| 婷婷色综合www| av在线老鸭窝| 人成视频在线观看免费观看| 国产亚洲最大av| 一本大道久久a久久精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 一本久久精品| 久久久久久久亚洲中文字幕| 免费观看在线日韩| 日韩三级伦理在线观看| 51国产日韩欧美| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲国产av新网站| 亚洲情色 制服丝袜| 韩国高清视频一区二区三区| 精品酒店卫生间| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久久 成人 亚洲| 久久久久久久国产电影| 免费av不卡在线播放| 精品一区二区免费观看| 亚洲av免费高清在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 精品国产一区二区久久| 99久久精品国产国产毛片| 丁香六月天网| 美女大奶头黄色视频| 日韩三级伦理在线观看| 一级黄片播放器| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产精品 国内视频| 国产精品欧美亚洲77777| a 毛片基地| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产精品女同一区二区软件| 香蕉精品网在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲综合色惰| 大香蕉97超碰在线| 赤兔流量卡办理| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产片内射在线| 丝袜脚勾引网站| 久久这里有精品视频免费| 国产精品 国内视频| 国产视频首页在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 波野结衣二区三区在线| 国产精品免费大片| 国产成人欧美| 插逼视频在线观看| 国产男人的电影天堂91| 亚洲欧美一区二区三区国产| 看免费成人av毛片| 成人国产av品久久久| 十分钟在线观看高清视频www| 婷婷色综合www| 国产又爽黄色视频| 国产精品 国内视频| 制服人妻中文乱码| 新久久久久国产一级毛片| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 日韩av免费高清视频| 国产片特级美女逼逼视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| av播播在线观看一区| 亚洲色图综合在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 看十八女毛片水多多多| av又黄又爽大尺度在线免费看| 51国产日韩欧美| 精品少妇黑人巨大在线播放| 美女国产视频在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 99九九在线精品视频| 亚洲国产看品久久| 亚洲天堂av无毛| xxxhd国产人妻xxx| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 边亲边吃奶的免费视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 乱码一卡2卡4卡精品| 人成视频在线观看免费观看| 国产成人免费无遮挡视频| 新久久久久国产一级毛片| 永久免费av网站大全| 丰满迷人的少妇在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| av.在线天堂| 少妇的逼好多水| 久久韩国三级中文字幕| av在线app专区| 男女下面插进去视频免费观看 | 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 男女高潮啪啪啪动态图| 青春草国产在线视频| 国产精品.久久久| 中国三级夫妇交换| 在线观看www视频免费| 黄色一级大片看看| 中国三级夫妇交换| 欧美3d第一页| 欧美xxⅹ黑人| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲av国产av综合av卡| 精品国产国语对白av| 亚洲丝袜综合中文字幕| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品熟女久久久久浪| 久久毛片免费看一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 久久精品国产亚洲av涩爱| 搡女人真爽免费视频火全软件| 在现免费观看毛片| 国产高清三级在线| 亚洲在久久综合| 亚洲av中文av极速乱| xxxhd国产人妻xxx| 日韩一区二区视频免费看| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲国产最新在线播放| 99国产精品免费福利视频| 久久久久久伊人网av| 水蜜桃什么品种好| 精品国产一区二区三区久久久樱花| √禁漫天堂资源中文www| 国产一级毛片在线| 一级片免费观看大全| 中文字幕av电影在线播放| av在线app专区| 亚洲av中文av极速乱| 男男h啪啪无遮挡| 国产日韩欧美亚洲二区| 18禁国产床啪视频网站| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产又色又爽无遮挡免| 国产成人精品福利久久| 久久免费观看电影| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久精品国产综合久久久 | 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久久久久伊人网av| 毛片一级片免费看久久久久| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久av网站| 亚洲av中文av极速乱| 久久久精品94久久精品| 一二三四在线观看免费中文在 | 中文字幕人妻丝袜制服| av免费在线看不卡| 最近手机中文字幕大全| 亚洲国产精品国产精品| 久久免费观看电影| 高清欧美精品videossex| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久久久久伊人网av| 国产乱来视频区| 黑丝袜美女国产一区| 成人影院久久| 免费人成在线观看视频色| 69精品国产乱码久久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 香蕉丝袜av| 成人漫画全彩无遮挡| 精品人妻一区二区三区麻豆| 美女主播在线视频| 一二三四在线观看免费中文在 | 丰满乱子伦码专区| 国产在视频线精品| 免费黄网站久久成人精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日韩一区二区视频免费看| 国产高清不卡午夜福利| 国产一区二区在线观看日韩| 精品久久蜜臀av无| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久人人爽人人片av| 伊人久久国产一区二区| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品欧美亚洲77777| 美女福利国产在线| 国产 精品1| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲精品美女久久av网站| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 日本wwww免费看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日本91视频免费播放| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 日本vs欧美在线观看视频| 我要看黄色一级片免费的| 国产又爽黄色视频| 久久久亚洲精品成人影院| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲成人一二三区av| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲高清免费不卡视频| 日本欧美国产在线视频| 在线观看人妻少妇| 性高湖久久久久久久久免费观看| 色94色欧美一区二区| 久久99一区二区三区| 国产 一区精品| 国国产精品蜜臀av免费| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲成人一二三区av| 欧美人与善性xxx| 满18在线观看网站| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲综合精品二区| 在线观看www视频免费| 亚洲第一av免费看| 大香蕉久久网| 精品国产乱码久久久久久小说| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产综合精华液| 夫妻午夜视频| 国产男人的电影天堂91| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲国产精品一区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 在线 av 中文字幕| 久久久久久久大尺度免费视频| av在线老鸭窝| 九草在线视频观看| 18在线观看网站| 七月丁香在线播放| 中国国产av一级| 大香蕉97超碰在线| 久久久久久人人人人人| 精品人妻在线不人妻| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 精品少妇内射三级| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| av视频免费观看在线观看| 99热网站在线观看| 秋霞在线观看毛片| 国产在线视频一区二区| 最近最新中文字幕免费大全7| 一级毛片我不卡| 在线观看免费视频网站a站| 激情五月婷婷亚洲| 18禁国产床啪视频网站| 大陆偷拍与自拍| 亚洲av福利一区| 国产日韩欧美视频二区| 久久久久久久久久久免费av| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲精品456在线播放app| 在线天堂最新版资源| 国产片内射在线| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲欧美精品自产自拍| 中国三级夫妇交换| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲av综合色区一区| 成人二区视频| kizo精华| 成人毛片60女人毛片免费| 各种免费的搞黄视频| 午夜老司机福利剧场| 日韩一区二区视频免费看| 国产 一区精品| 一本久久精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产成人免费观看mmmm| 99热全是精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧美色中文字幕在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲少妇的诱惑av| 成人毛片60女人毛片免费| 人人澡人人妻人| av在线app专区| 18在线观看网站| 大片免费播放器 马上看| 国产又爽黄色视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 嫩草影院入口| 成年动漫av网址| 国产一区二区在线观看日韩| 久久久久精品性色| av有码第一页| 久久久精品94久久精品| av线在线观看网站| 日韩一本色道免费dvd| 一二三四中文在线观看免费高清| 精品视频人人做人人爽| 最新中文字幕久久久久| 日韩 亚洲 欧美在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 中文字幕最新亚洲高清| 97在线人人人人妻| 一区二区三区精品91| 欧美国产精品va在线观看不卡| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 亚洲av国产av综合av卡| 国产亚洲一区二区精品| 波多野结衣一区麻豆| 婷婷成人精品国产| 又大又黄又爽视频免费| videos熟女内射| 亚洲美女视频黄频| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲成人一二三区av| 国产成人精品无人区| 午夜福利视频精品| 欧美人与善性xxx| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| av卡一久久| 亚洲,欧美精品.| 精品午夜福利在线看| 久久久久久人人人人人| 大香蕉久久成人网| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久99一区二区三区| 国产精品一二三区在线看| 国产精品一区二区在线观看99| 制服人妻中文乱码| 久热这里只有精品99| 十分钟在线观看高清视频www| 999精品在线视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 一区二区三区乱码不卡18| 人妻一区二区av| 在线观看三级黄色| 超碰97精品在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲图色成人| 亚洲国产欧美在线一区| 宅男免费午夜| 午夜福利视频精品| 日本黄大片高清| 黄色视频在线播放观看不卡| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久久久久久国产电影| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产av一区二区精品久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| videosex国产| 五月天丁香电影| 国产黄色免费在线视频| 午夜精品国产一区二区电影| 成人国产av品久久久| 国产 精品1| 国产黄频视频在线观看| 老熟女久久久| 国产男女内射视频| 亚洲国产精品999| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 成人亚洲欧美一区二区av| 婷婷色综合www| 国产精品 国内视频| 免费看av在线观看网站| 99热网站在线观看| 人妻 亚洲 视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 老司机影院毛片| 在线 av 中文字幕| 91aial.com中文字幕在线观看| 高清毛片免费看| 精品久久蜜臀av无| 欧美激情 高清一区二区三区| 一区二区三区四区激情视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久久久精品性色| 日本色播在线视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美日韩成人在线一区二区| 一级黄片播放器| 欧美成人午夜免费资源| 乱码一卡2卡4卡精品| 久久这里只有精品19| 中文字幕制服av| 国产一区二区三区av在线| 亚洲五月色婷婷综合| 丝袜人妻中文字幕| 青春草国产在线视频| 中文欧美无线码| 国产精品蜜桃在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产精品国产三级国产专区5o| 中文天堂在线官网| 色婷婷久久久亚洲欧美| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲中文av在线| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 精品视频人人做人人爽| 精品久久蜜臀av无| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲国产av新网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲熟女精品中文字幕| 秋霞在线观看毛片| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日本欧美国产在线视频| av.在线天堂| 午夜福利影视在线免费观看| 久久国产精品大桥未久av| 嫩草影院入口| 久久精品人人爽人人爽视色| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲,欧美,日韩| 久久综合国产亚洲精品| 国产午夜精品一二区理论片| 午夜久久久在线观看| 青春草视频在线免费观看| 色吧在线观看| 午夜福利视频在线观看免费| av免费在线看不卡| 丁香六月天网| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美最新免费一区二区三区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 一区二区三区四区激情视频| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲精品色激情综合| 国产成人一区二区在线| 99久久精品国产国产毛片| 久久99蜜桃精品久久| 在线观看人妻少妇| 天堂8中文在线网| 99视频精品全部免费 在线| 51国产日韩欧美| 一区二区av电影网| 国产精品国产av在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 午夜福利,免费看| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产成人精品婷婷| 国产色婷婷99| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 伊人久久国产一区二区| 99热网站在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频| 国产乱人偷精品视频| 女人精品久久久久毛片| 丝袜喷水一区| 国产男人的电影天堂91| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲成国产人片在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| av福利片在线| 中文字幕免费在线视频6| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 九九爱精品视频在线观看| 国产成人91sexporn| 少妇精品久久久久久久| 精品久久蜜臀av无| 成人综合一区亚洲| 丰满乱子伦码专区| 久久av网站| av国产精品久久久久影院| 久久久久国产网址| 热99国产精品久久久久久7| 午夜av观看不卡| 国产成人精品一,二区| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久99一区二区三区| 午夜精品国产一区二区电影| 一级毛片电影观看| 国产熟女欧美一区二区| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲内射少妇av| 女性生殖器流出的白浆| 少妇熟女欧美另类| 亚洲av男天堂| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日本欧美国产在线视频| 最新中文字幕久久久久| 蜜桃在线观看..| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 香蕉国产在线看| 精品一品国产午夜福利视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 男人添女人高潮全过程视频| 精品少妇内射三级| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美97在线视频| 亚洲高清免费不卡视频| 中文欧美无线码| 成年女人在线观看亚洲视频| 9191精品国产免费久久| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 乱码一卡2卡4卡精品| 久久99热这里只频精品6学生| 22中文网久久字幕| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 观看美女的网站| 一级片免费观看大全| 精品亚洲成国产av| 午夜免费鲁丝| 男女啪啪激烈高潮av片| 一个人免费看片子| 国产成人免费无遮挡视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 免费少妇av软件| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 一个人免费看片子| 卡戴珊不雅视频在线播放| 一区二区三区精品91| 久久婷婷青草| 人妻人人澡人人爽人人| 免费观看a级毛片全部| 久热这里只有精品99|