• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    STAT1基因敲除提高小鼠對(duì)EV71病毒的敏感性研究

    2017-07-05 18:31李光超張倩武婧
    關(guān)鍵詞:炎癥因子病毒感染

    李光超 張倩 武婧

    [摘要] 目的 分析STAT1基因敲除小鼠免疫相關(guān)因子表達(dá)差異,觀察STAT1基因敲除小鼠感染EV71病毒后的癥狀表現(xiàn)及病毒載量,為EV71抗病毒治療提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。 方法 LPS刺激STAT1基因敲除小鼠后,利用微珠免疫分析(CBA)方法對(duì)血清免疫相關(guān)因子定量分析;EV71感染STAT1基因敲除小鼠后,觀察癥狀及病理表現(xiàn),利用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)對(duì)肌肉病毒RNA定量分析。 結(jié)果 LPS刺激后,STAT1基因敲除小鼠血清多種細(xì)胞因子分泌水平下降(P < 0.01);EV71感染后,STAT1基因敲除小鼠病理?yè)p傷加重,肌肉中病毒載量升高(P < 0.01),與野生型小鼠相比表現(xiàn)出更嚴(yán)重的癥狀與更高的死亡率。 結(jié)論 STAT1在抗EV71感染的免疫過(guò)程中扮演重要角色,提示STAT1基因敲除可以提高小鼠對(duì)EV71病毒的敏感性。

    [關(guān)鍵詞] 病毒感染;EV71;STAT1;炎癥因子

    [中圖分類號(hào)] R373 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2017)05(c)-0014-05

    [Abstract] Objective To analyze the differential expression of immune-associated factors in STAT1 knockout mice, and observe the symptoms and viral load after EV71 virus infection, in order to provide a data base for anti-EV71 therapy. Methods Cytometric bead assay (CBA) was used to quantitative analysis the levels of serum immune-associated factors in STAT1 knockout mice after LPS-induced treatment. The symptom and tissue pathological features were observed and the level of muscle virus RNA was quantitated by real-time PCR in STAT1 knockout mice after EV71 virus infection. Results The levels of multi- immune-associated factors were decreased in STAT1 knockout mice after LPS stimulating (P < 0.01), and pathological damage was aggravated accompanied by the higher viral load in muscle (P < 0.01), also severe symptoms and higher mortality when compared to wide type mice after EV71 infection. Conclusions STAT1 plays an important role in the immune responseafter EV71 infection.Thus, STAT1 gene deletion can improve the sensitivity of mice to EV71 virus.

    [Key words] Virus infection; EV71; STAT1; Inflammatory cytokines

    手足口病是嬰幼兒最常見(jiàn)的傳染病,好發(fā)于5歲以下嬰幼兒[1]。腸道病毒71型(EV71)屬于人類腸道病毒A屬的小RNA病毒科,為常見(jiàn)的引起手足口病的病毒之一。病毒在腸道存活時(shí)間可達(dá)10周[2],引起嚴(yán)重的臨床癥狀,甚至導(dǎo)致患者死亡[3]。嬰幼兒感染EV71后,常發(fā)生手、足、口皰疹,以及引發(fā)無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、急性遲緩性麻痹、神經(jīng)源性水腫等多種神經(jīng)性疾病[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì),手足口病患者中感染EV71所導(dǎo)致的患者死亡率始終居高不下[5]。

    JAK/STAT信號(hào)通路是一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。STAT1作為STAT家族發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)成員,是JAK/STAT信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,具有免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等功能[6],在機(jī)體抗腫瘤免疫中也發(fā)揮重要的作用[7]。脂多糖(LPS)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分,作為細(xì)菌引起機(jī)體發(fā)熱反應(yīng)的主要成分之一,可引起免疫炎性反應(yīng)[8]。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予小鼠LPS刺激后,STAT1可與TLR4協(xié)同作用,使細(xì)胞因子分泌水平升高,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的功能[9]。

    STAT1也是機(jī)體免疫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)抗病毒、減少組織損傷的的媒介之一,調(diào)節(jié)JAK/STAT通路可以對(duì)EV71病毒的感染免疫產(chǎn)生影響[10]。STAT1在EV71病毒感染過(guò)程中可以發(fā)揮抗病毒的作用,同時(shí)EV71病毒也可以影響STAT1信號(hào)通路的激活。對(duì)EV71病毒感染細(xì)胞進(jìn)程中STAT1的影響進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),THP-1細(xì)胞的在EV71感染后STAT1磷酸化水平增加,使JAK/STAT信號(hào)通路激活[11];橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞STAT1介導(dǎo)的信號(hào)通路在EV71感染后,會(huì)通過(guò)干擾素途徑使其激活[12]。目前對(duì)EV71感染進(jìn)程中STAT1的作用研究多處于細(xì)胞水平[13],利用STAT1基因敲除的小鼠模型進(jìn)行動(dòng)物整體水平的研究鮮有報(bào)道。本研究利用STAT1敲除的C57BL/6小鼠模型,在整體動(dòng)物水平探討STAT1基因?qū)V71病毒復(fù)制的影響,為減少病毒復(fù)制及控制感染癥狀等治療提供可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 主要試劑與儀器 Trizol試劑 (Life Technologies);cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific);實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)染料(Applied Biosystems);鼠抗EV71單克隆抗體(Millipore, MAB979);細(xì)胞CBA檢測(cè)抗體(BD)。流式細(xì)胞儀(BD FACSCanto II);激光共聚焦顯微鏡(Leica Microsystems GmbH)。

    1.1.2 病毒 病毒為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所EV71課題組利用EV71病毒FY0805病毒株,經(jīng)ICR小鼠傳代適應(yīng)株MP10(Accession number: HQ712020)[14],儲(chǔ)存滴度1×109 TCID50。

    1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)STAT1-/- C57BL/6小鼠22只,體重7~9 g,10日齡;SPF級(jí)STAT1+/- C57BL/6小鼠20只,體重7~9 g,10日齡;SPF級(jí)野生型C57BL/6小鼠20只,體重7~9 g,10日齡;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究中心研制,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2014-0004,試驗(yàn)單位使用許可證編號(hào):SYXK(京)2015-0035。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 動(dòng)物分組 LPS刺激組:STAT1-/- (n = 10), STAT1+/- (n = 8),野生型 (n = 8)。EV71感染組:STAT1-/- (n = 6),STAT1+/-(n = 6),野生型 (n = 6)。衛(wèi)星組:STAT 1-/- (n = 6),STAT1+/-(n = 6),野生型(n = 6)。

    1.2.2 LPS刺激 3周齡C57BL/6小鼠腹腔注射LPS,劑量為每克體重10 μg。注射后24 h取小鼠血清,CBA方法檢測(cè)血清IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12/IL-23p40、MIP-1α、TNF-α。

    1.2.3 EV71病毒感染及一般指標(biāo)檢測(cè) EV71感染組及衛(wèi)星組C57BL/6小鼠10日齡,腹腔注射1×107 TCID50(致死劑量),在感染后9 d內(nèi)每日觀察并記錄體重、癥狀、生存率指標(biāo)。臨床癥狀評(píng)分為:0,無(wú)癥狀;1,豎毛;2,后肢行動(dòng)遲緩;3,單側(cè)后肢癱瘓;4,全部后肢癱瘓;5,死亡。感染后3 d對(duì)衛(wèi)星組小鼠實(shí)行安樂(lè)死,取后肢腿部肌肉30 mg,TRIzol法提取全RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA,利用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法對(duì)特異性片段擴(kuò)增并定量。所用引物序列編號(hào)為EV71-S1 (5'-AGATAGGGTGGCAGATGTAATTGAAAG-3')和EV71-A1(5'-TAGCATTTGATGATGCTCCAATTTCAG-3')。

    1.2.4 HE染色及免疫熒光分析 感染3 d后,衛(wèi)星組小鼠給予安樂(lè)死,取后肢肌肉,10%福爾馬林固定48 h,脫水后石蠟包埋,HE染色觀察病理變化。免疫熒光染色利用抗EV71單克隆抗體(1∶500)作為一抗,4℃過(guò)夜,隨后0.01 mol/L PBS清洗,鼠抗兔IgG(H+L)作為二抗(1∶200)孵育,0.01 mol/L PBS清洗后附熒光抗體,在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

    2 結(jié)果

    2.1 LPS刺激后STAT1敲除小鼠血清細(xì)胞因子水平降低

    對(duì)LPS刺激組的血清細(xì)胞因子定量分析發(fā)現(xiàn),STAT1基因敲除小鼠的血清細(xì)胞因子水平出現(xiàn)不同程度降低。腹腔注射LPS 24 h后,對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子進(jìn)行定量分析的結(jié)果顯示,STAT1基因敲除小鼠血清細(xì)胞因子的分泌水平都有不同程度的降低。與野生型小鼠相比,STAT1-/-小鼠細(xì)胞因子降低水平高于STAT1+/-小鼠,具體為:IL-1α(60.69%,P < 0.01)、IL-1β(91.92%,P < 0.01)、IL-6(79.93%,P < 0.05)、IL-10(56.66%,P < 0.01)、IL-12/IL-23p40(72.58%,P < 0.01)、TNF-α(62.03%,P < 0.01)以及Mouse MIP-1α(45.09%,P < 0.01)。在所檢測(cè)細(xì)胞因子中,小鼠IL-1β的降低水平最為明顯(P < 0.01)。見(jiàn)圖1。

    2.2 EV71感染后STAT1敲除小鼠癥狀加重

    EV71感染后,與野生型STAT1+/-小鼠相比,STAT1-/-小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的臨床癥狀、更高的死亡率以及更高的病毒載量。結(jié)果表明,EV71感染后,野生型小鼠在感染后6 d出現(xiàn)死亡,而STAT1-/-小鼠在感染4 d后出現(xiàn)死亡情況,死亡時(shí)間提前。感染6 d后STAT1-/-小鼠全部死亡,生存率為零,與其他組小鼠相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)(圖2A)。對(duì)感染EV71后小鼠出現(xiàn)的癥狀表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)分并統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),STAT1-/-小鼠在感染3 d后癥狀急劇惡化(斜率增加),與其他組相比癥狀表現(xiàn)更為嚴(yán)重(圖2B)。伴隨癥狀加重,STAT1-/-小鼠在感染3 d后的體重明顯減輕,其他兩組小鼠隨時(shí)間變化體重逐漸增加(圖2C)。對(duì)肌肉病毒載量檢測(cè)結(jié)果顯示,STAT1-/-小鼠的肌肉病毒載量明顯高于野生型小鼠與STAT1+/-小鼠,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。見(jiàn)圖2D。

    2.3 EV71感染后STAT1敲除小鼠組織損傷加重

    利用HE染色對(duì)小鼠后肢肌肉的病理變化進(jìn)行觀察,利用免疫熒光技術(shù)對(duì)不同組小鼠后肢肌肉中EV71抗原的表達(dá)量進(jìn)行了對(duì)比。400倍鏡下對(duì)EV71抗原熒光染色結(jié)果顯示,EV71抗原在小鼠后肢肌肉中有聚集現(xiàn)象,與野生型組相比,這種現(xiàn)象在STAT1-/-小鼠中更加明顯(圖3B),據(jù)此推測(cè)EV71在STAT-/-小鼠后肢肌肉中復(fù)制水平增高。與野生型及STAT1+/-相比,STAT1-/-小鼠表現(xiàn)出大片炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與組織纖維化(圖3A),組織損傷情況更為嚴(yán)重。見(jiàn)圖3。從生存率、病毒載量、HE染色等檢測(cè)指標(biāo)可見(jiàn),STAT1基因敲除小鼠抵抗EV71病毒感染復(fù)制的能力存在嚴(yán)重缺陷,可能是導(dǎo)致EV71病毒感染加重的原因。

    3 討論

    通過(guò)LPS刺激對(duì)免疫相關(guān)的細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析,在LPS刺激后STAT1-/-小鼠免疫相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平降低,與之前報(bào)道的結(jié)論[15]。本研究證實(shí)STAT1基因敲除可以對(duì)C57BL/6小鼠的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響。STAT1作為一種轉(zhuǎn)錄因子,可以通過(guò)與其它的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后,激活或抑制[16],其表達(dá)調(diào)控過(guò)程比較復(fù)雜。STAT1的作用包括誘導(dǎo)CXCL9、P21WAF1/CIP1、IFI205等基因的表達(dá)[17],直接誘導(dǎo)MCP1等趨化因子產(chǎn)生[18],以及與NF-κB協(xié)同參與免疫調(diào)節(jié)[19]等等。LPS刺激后,STAT1-/-小鼠與STAT1+/-小鼠的白介素、TNF-α、MIP-1α等細(xì)胞因子水平下調(diào),且STAT1-/-小鼠下調(diào)的程度高于STAT1+/-小鼠,證明STAT1參與了小鼠免疫應(yīng)答。

    有研究報(bào)道,IL-1β基因轉(zhuǎn)錄可以通過(guò)JAK/STAT信號(hào)途徑進(jìn)行調(diào)控[20]。在本實(shí)驗(yàn)中,STAT1-/-小鼠的血清IL-1β因子在LPS刺激下其分泌水平下調(diào)了90%以上,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01),推測(cè)可能是由于STAT1信號(hào)通路的影響引起IL-1β轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)所導(dǎo)致的。

    本實(shí)驗(yàn)證實(shí),STAT1基因敲除可以導(dǎo)致小鼠對(duì)EV71的敏感性增高。EV71病毒感染STAT1基因敲除小鼠后,其生存率、體重水平明顯降低,癥狀嚴(yán)重程度及病毒載量顯著增高,肌肉病理?yè)p傷更加嚴(yán)重,免疫熒光染色結(jié)果也可以觀察到EV71抗原在STAT1-/-小鼠肌肉的聚集水平升高。在整體動(dòng)物水平上印證了之前報(bào)道過(guò)的關(guān)于EV71感染實(shí)驗(yàn)的結(jié)論[13]。

    STAT1在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中扮演重要的角色,STAT-/-小鼠模型的構(gòu)建,對(duì)研究機(jī)體免疫功能提供了強(qiáng)有力的研究工具?,F(xiàn)已證實(shí)STAT1基因的缺失導(dǎo)致小鼠對(duì)EV71的敏感性增高。本實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物整體水平上探索了STAT1在抗EV71感染中的作用,可以為今后減少病毒復(fù)制及控制感染癥狀等治療提供可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] Lu J,Zeng H,Zheng H,et al. Hand,foot and mouth disease in Guangdong,China,in 2013:new trends in the continuing epidemic [J]. Clin Microbiol Infect,2014,20(7):442-445.

    [2] Teng S,Wei Y,Zhao SY,et al. Intestinal detoxification time of hand-foot-and-mouth disease in children with EV71 infection and the related factors [J]. World J Pediatr,2015, 11(4):380-385.

    [3] Shen J,Zhao C,Cao P,et al. Relationship between serologic response and clinical symptoms in children with enterovirus 71-infected hand-foot-mouth disease [J]. Int J Clin Exp Pathol,2015,8(9):11608-11614.

    [4] Huang HI,Chang YY,Lin JY,et al.Interactome analysis of the EV71 5' untranslated region in differentiated neuronal cells SH-SY5Y and regulatory role of FBP3 in viral replication [J]. Proteomics,2016,16(17):2351-2362.

    [5] 隋美麗,李懿,劉新奎,等.手足口病流行病學(xué)-病原學(xué)及重癥化機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2017, 12(1):92-98.

    [6] Catalfamo M,Cecile LS,Luckey MA,et al. Overexpression of total STAT1 during lymphopenia-induced proliferation leads to decrease CD4 T cell survival [J]. J Immunol,2016, 196(1 Supplement):55-56.

    [7] Hsu KS,Zhao X,Cheng X,et al. Dual regulation of Stat1 and Stat3 by the tumor suppressor protein PML contributes to IFNα-mediated inhibition of angiogenesis [J]. J Biol Chem,2017:jbc.M116.771071.

    [8] Lee SH,Kwak CH,Lee SK,et al. Anti-inflammatory effect of ascochlorin in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophage cells is accompanied with the down-regulation of iNOS,COX-2 and proinflammatory cytokines through NF-κB,ERK1/2,and p38 signaling pathway [J]. J Cell Biochem,2016,117(4):978-987.

    [9] Luu K,Greenhill CJ,Majoros A,et al. STAT1 plays a role in TLR signal transduction and inflammatory responses [J]. Immunol Cell Biol,2014,92(9):761-769.

    [10] Zou R,Zhang G,Li S,et al. A functional polymorphism in IFNAR1 gene is associated with susceptibility and severity of HFMD with EV71 infection [J]. Sci Rep,2015, 2015:5.

    [11] 李圓圓,史偉峰,史梅,等. JAK/STAT信號(hào)通路對(duì)腸道病毒71型感染的調(diào)控作用[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2015,33(9):683-686.

    [12] Wang LC,Chen SO,Chang SP,et al. Enterovirus 71 proteins 2A and 3D antagonize the antiviral activity of Gamma interferon via signaling attenuation [J]. J Virol,2015, 89(14):7028-7037.

    [13] Pathinayake PS,Hsu ACY,Wark PAB. innate immunity and immune evasion by Enterovirus 71 [J]. Viruses,2015,7(12):6613-6630.

    [14] Xiu J,Zhu H,Xu Y,et al. Necrotizing myositis causes restrictive hypoventilation in a mouse model for human enterovirus 71 infection [J]. Virol J,2013,10(1):215.

    [15] Lee HH,Shin JS,Lee WS,et al. Biflorin,isolated from the flower buds of Syzygiumaromaticum L.,suppresses LPS-induced inflammatory mediators via STAT1 inactivation in macrophages and protects mice from endotoxin shock [J]. J Nat Products,2016,79(4):711-720.

    [16] Kim S,Koga T,Isobe M,et al. Stat1 functions as a cytoplasmic attenuator of Runx2 in the transcriptional program of osteoblast differentiation [J]. Genes Development,2003,17(16):1979-1991.

    [17] Chaudhuri A,Yang B,Gendelman HE,et al. STAT1 signaling modulates HIV-1-induced inflammatory responses and leukocyte transmigration across the blood-brain barrier [J]. Blood,2008,111(4):2062-2072.

    [18] Matikainen S,Pirhonen J,Miettinen M,et al. Influenza A and sendai viruses induce differential chemokine gene expression and transcription factor activation in human macrophages [J]. Virology,2000,276(1):138-147.

    [19] Swierkot J,Nowak B,Czarny A,et al. The activity of JAK/STAT and NF-κB in patients with rheumatoid arthritis [J]. Advances Clin Expe Med,2016,25(4):709-717.

    [20] Lee C,Lim HK,Sakong J,et al. Janus kinase-signal transducer and activator of transcription mediates phosphatidic acid-induced interleukin (IL)-1β and IL-6 production [J]. Mol Pharmacol,2006,69(3):1041-1047.

    (收稿日期:2017-01-27 本文編輯:蘇 暢)

    猜你喜歡
    炎癥因子病毒感染
    預(yù)防諾如病毒感染
    丙型肝炎病毒感染和2型糖尿病的相關(guān)性
    豬細(xì)小病毒感染的防治
    豬瘟病毒感染的診治
    烏司他丁對(duì)急腹癥患者圍術(shù)期炎癥因子的影響
    胸腔鏡微創(chuàng)手術(shù)對(duì)早期周圍型肺癌患者術(shù)后炎癥反應(yīng)和免疫功能的影響
    胸腹腔鏡微創(chuàng)手術(shù)與傳統(tǒng)開(kāi)胸手術(shù)對(duì)食管癌患者術(shù)后肺功能、炎癥因子水平的影響
    阿托伐他汀強(qiáng)化降脂對(duì)急性腦梗死患者療效與炎癥因子的影響
    血必凈治療重癥肺炎的效果觀察及對(duì)炎癥因子和氧化、抗氧化因子的影響
    氨氯地平聯(lián)合阿托伐他汀對(duì)高血壓合并高血脂患者內(nèi)皮功能的影響
    人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 老熟女久久久| 中国三级夫妇交换| 亚洲一码二码三码区别大吗| 岛国毛片在线播放| 老司机影院毛片| 黄频高清免费视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 精品免费久久久久久久清纯 | 精品一品国产午夜福利视频| 晚上一个人看的免费电影| 中文字幕av电影在线播放| 大陆偷拍与自拍| 水蜜桃什么品种好| 国产成人免费观看mmmm| 一区二区三区精品91| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 一本色道久久久久久精品综合| 国产97色在线日韩免费| 久久久久久久精品精品| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产在线一区二区三区精| 午夜福利乱码中文字幕| 成人毛片60女人毛片免费| 叶爱在线成人免费视频播放| 中文字幕人妻熟女乱码| 成人三级做爰电影| 大片电影免费在线观看免费| 欧美老熟妇乱子伦牲交| videos熟女内射| 丝袜喷水一区| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲熟女毛片儿| 中文字幕色久视频| 热99久久久久精品小说推荐| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 中文字幕高清在线视频| 国产成人免费观看mmmm| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲第一av免费看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久久久网色| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久99热这里只频精品6学生| 久久综合国产亚洲精品| 又大又黄又爽视频免费| 中文天堂在线官网| 老鸭窝网址在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 国产午夜精品一二区理论片| 欧美久久黑人一区二区| 国产精品欧美亚洲77777| 日日撸夜夜添| 午夜福利视频精品| 飞空精品影院首页| 韩国高清视频一区二区三区| 蜜桃在线观看..| 成年美女黄网站色视频大全免费| 精品一区二区免费观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产99久久九九免费精品| 高清不卡的av网站| 亚洲精品国产av成人精品| www日本在线高清视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产乱来视频区| 午夜福利视频在线观看免费| a级片在线免费高清观看视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 在线精品无人区一区二区三| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲成人av在线免费| 波多野结衣一区麻豆| 男女国产视频网站| 操美女的视频在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 成人国语在线视频| 男女下面插进去视频免费观看| 女性生殖器流出的白浆| 国产一区二区 视频在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲伊人色综图| 丝瓜视频免费看黄片| 国产xxxxx性猛交| 免费少妇av软件| 天美传媒精品一区二区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 视频区图区小说| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲人成电影观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 老司机影院成人| 国产精品无大码| 国产av精品麻豆| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲一码二码三码区别大吗| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲成人av在线免费| 五月天丁香电影| 久久久精品94久久精品| 最黄视频免费看| 亚洲精品一二三| 999精品在线视频| 国产爽快片一区二区三区| www日本在线高清视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产 精品1| 亚洲第一av免费看| 女性生殖器流出的白浆| 成人国产麻豆网| 天堂8中文在线网| 97人妻天天添夜夜摸| 国产成人av激情在线播放| 午夜福利影视在线免费观看| 新久久久久国产一级毛片| 伊人亚洲综合成人网| 久久久久久人人人人人| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 精品福利永久在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 一区二区三区激情视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 午夜福利乱码中文字幕| 最新的欧美精品一区二区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲三区欧美一区| 一个人免费看片子| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| av电影中文网址| 免费看av在线观看网站| 91成人精品电影| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲精品自拍成人| 夫妻午夜视频| 久久久久精品性色| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲成人av在线免费| 久久国产精品大桥未久av| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产精品偷伦视频观看了| 视频在线观看一区二区三区| 午夜av观看不卡| 亚洲精品自拍成人| 免费观看av网站的网址| 热99国产精品久久久久久7| 久久热在线av| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 啦啦啦在线免费观看视频4| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 丁香六月欧美| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲国产日韩一区二区| 成人黄色视频免费在线看| 不卡视频在线观看欧美| 精品福利永久在线观看| 午夜久久久在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| a 毛片基地| 国产深夜福利视频在线观看| 国产探花极品一区二区| 观看av在线不卡| 9色porny在线观看| 免费看av在线观看网站| 丝袜在线中文字幕| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 十八禁网站网址无遮挡| av在线老鸭窝| 乱人伦中国视频| 美女午夜性视频免费| 欧美激情高清一区二区三区 | 捣出白浆h1v1| 免费av中文字幕在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品亚洲成a人片在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 国产极品粉嫩免费观看在线| 丰满迷人的少妇在线观看| a 毛片基地| 国产亚洲精品第一综合不卡| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 韩国精品一区二区三区| 成人亚洲精品一区在线观看| 精品久久久久久电影网| 亚洲四区av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 十八禁网站网址无遮挡| 高清黄色对白视频在线免费看| 日本一区二区免费在线视频| 精品一区在线观看国产| 亚洲国产精品一区三区| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲伊人久久精品综合| 一级片'在线观看视频| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲av中文av极速乱| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 嫩草影视91久久| 国产又爽黄色视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产成人欧美在线观看 | 毛片一级片免费看久久久久| 中文欧美无线码| 国产又爽黄色视频| 久久这里只有精品19| 欧美成人精品欧美一级黄| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲av在线观看美女高潮| 91老司机精品| 国产淫语在线视频| 亚洲国产欧美网| 国产亚洲最大av| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品久久久av美女十八| 搡老岳熟女国产| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产精品欧美亚洲77777| 精品一区二区免费观看| 成人毛片60女人毛片免费| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 91精品三级在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 国产淫语在线视频| 亚洲图色成人| 悠悠久久av| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲四区av| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 午夜老司机福利片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产欧美亚洲国产| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲一区中文字幕在线| 咕卡用的链子| 美女福利国产在线| 国产在视频线精品| svipshipincom国产片| 一本色道久久久久久精品综合| 国产男人的电影天堂91| av网站在线播放免费| 777米奇影视久久| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久久国产一区二区| 国产精品人妻久久久影院| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 高清视频免费观看一区二区| 久久久久久久国产电影| 韩国av在线不卡| 妹子高潮喷水视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲图色成人| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久久久久久久久免费av| 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 看非洲黑人一级黄片| 91aial.com中文字幕在线观看| bbb黄色大片| svipshipincom国产片| 中文字幕高清在线视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 中文字幕人妻熟女乱码| 777米奇影视久久| 日韩制服骚丝袜av| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲免费av在线视频| 又大又黄又爽视频免费| 色综合欧美亚洲国产小说| 男女高潮啪啪啪动态图| 一二三四中文在线观看免费高清| 一二三四中文在线观看免费高清| 男女边摸边吃奶| 色吧在线观看| 色播在线永久视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 少妇人妻精品综合一区二区| 18禁动态无遮挡网站| 日本欧美视频一区| 美女高潮到喷水免费观看| 交换朋友夫妻互换小说| 午夜av观看不卡| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲国产精品一区三区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 免费观看a级毛片全部| 免费不卡黄色视频| 男女边摸边吃奶| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产一区二区激情短视频 | 啦啦啦在线观看免费高清www| 在线观看国产h片| 久久久久久久久免费视频了| 午夜激情av网站| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 深夜精品福利| 久久免费观看电影| 亚洲av福利一区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久韩国三级中文字幕| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲综合色网址| 人人妻人人澡人人看| 少妇人妻久久综合中文| xxx大片免费视频| 我的亚洲天堂| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 纯流量卡能插随身wifi吗| h视频一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级| 老熟女久久久| 欧美变态另类bdsm刘玥| 色94色欧美一区二区| 婷婷色综合大香蕉| 精品卡一卡二卡四卡免费| 飞空精品影院首页| tube8黄色片| 午夜福利免费观看在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲综合精品二区| 国产淫语在线视频| 韩国高清视频一区二区三区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| av视频免费观看在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 中文字幕最新亚洲高清| 久久久精品区二区三区| 国产成人一区二区在线| 大话2 男鬼变身卡| 国产麻豆69| 我的亚洲天堂| 国产 精品1| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲精品国产区一区二| 99re6热这里在线精品视频| 1024视频免费在线观看| av福利片在线| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品 欧美亚洲| 啦啦啦在线免费观看视频4| 秋霞在线观看毛片| 中文字幕亚洲精品专区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 大片免费播放器 马上看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 老汉色∧v一级毛片| 一级爰片在线观看| 国产探花极品一区二区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 午夜久久久在线观看| 国产99久久九九免费精品| 黄频高清免费视频| 日本vs欧美在线观看视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 天天影视国产精品| 欧美97在线视频| 黄色一级大片看看| 男女边摸边吃奶| 亚洲成国产人片在线观看| 91精品国产国语对白视频| 麻豆乱淫一区二区| 男女午夜视频在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 视频在线观看一区二区三区| 日日撸夜夜添| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 老司机亚洲免费影院| 国产精品蜜桃在线观看| 久久狼人影院| 国产免费福利视频在线观看| 免费不卡黄色视频| 中文字幕av电影在线播放| 欧美精品亚洲一区二区| 色视频在线一区二区三区| 不卡av一区二区三区| 久久97久久精品| 亚洲精品在线美女| 久久精品久久久久久久性| 涩涩av久久男人的天堂| 老汉色∧v一级毛片| 人妻 亚洲 视频| 黄色一级大片看看| 国产精品成人在线| 国产男女内射视频| 99久久综合免费| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 十八禁高潮呻吟视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 日本欧美国产在线视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲图色成人| 成年av动漫网址| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲精品乱久久久久久| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日韩一区二区三区影片| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产精品av久久久久免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久久ye,这里只有精品| 欧美日韩精品网址| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 黄色视频不卡| 操出白浆在线播放| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 嫩草影视91久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲一区二区三区欧美精品| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 少妇人妻久久综合中文| 久久 成人 亚洲| 亚洲精品一区蜜桃| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲av男天堂| 国产精品女同一区二区软件| 国产黄色视频一区二区在线观看| 999久久久国产精品视频| 十八禁网站网址无遮挡| 观看美女的网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产成人精品福利久久| 亚洲国产av新网站| av电影中文网址| 国产爽快片一区二区三区| 十八禁网站网址无遮挡| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲精品国产av蜜桃| 老司机影院毛片| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 在线观看国产h片| 一级a爱视频在线免费观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 五月开心婷婷网| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产成人免费无遮挡视频| tube8黄色片| 精品福利永久在线观看| 天美传媒精品一区二区| 精品人妻在线不人妻| 亚洲熟女精品中文字幕| 97人妻天天添夜夜摸| 成人免费观看视频高清| 精品久久久久久电影网| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 日日撸夜夜添| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲精品视频女| 日韩大片免费观看网站| 精品国产国语对白av| 乱人伦中国视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 人体艺术视频欧美日本| 免费观看a级毛片全部| 精品第一国产精品| 一级黄片播放器| 丝袜喷水一区| 国产一区二区激情短视频 | 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 嫩草影院入口| 悠悠久久av| 欧美激情 高清一区二区三区| 成人亚洲欧美一区二区av| 精品国产乱码久久久久久男人| 69精品国产乱码久久久| 两个人看的免费小视频| 一级a爱视频在线免费观看| 精品亚洲成a人片在线观看| www.av在线官网国产| 91国产中文字幕| 精品第一国产精品| 国产日韩欧美视频二区| 成人免费观看视频高清| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一区二区三区激情视频| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲美女视频黄频| 国产片特级美女逼逼视频| 国产探花极品一区二区| 成人国语在线视频| 国产乱来视频区| 亚洲成人av在线免费| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 成年人免费黄色播放视频| 777米奇影视久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美最新免费一区二区三区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产日韩欧美视频二区| 大陆偷拍与自拍| 欧美久久黑人一区二区| 一级爰片在线观看| 美女大奶头黄色视频| 免费观看性生交大片5| 亚洲欧美成人精品一区二区| 成人国产av品久久久| 热99久久久久精品小说推荐| 国产 一区精品| 久热爱精品视频在线9| 欧美xxⅹ黑人| 一区二区av电影网| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 一本大道久久a久久精品| 精品国产露脸久久av麻豆| 中文字幕高清在线视频| 久久久久久久久久久免费av| 久久97久久精品| 啦啦啦 在线观看视频| 91老司机精品| 宅男免费午夜| 国产精品一区二区在线不卡| 久久久欧美国产精品| 男女边吃奶边做爰视频| 国产免费又黄又爽又色| 狂野欧美激情性xxxx| 丁香六月天网| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| av线在线观看网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 久久精品久久久久久久性| 久久精品亚洲av国产电影网| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产黄色免费在线视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品久久久久成人av| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久精品国产综合久久久| 欧美日韩综合久久久久久| 好男人视频免费观看在线| 亚洲成色77777| 久久韩国三级中文字幕| 国产在线免费精品| 热re99久久国产66热| 久久国产精品大桥未久av| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 丝袜美腿诱惑在线| 中文字幕精品免费在线观看视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 无限看片的www在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 2021少妇久久久久久久久久久| 在线看a的网站| 最近的中文字幕免费完整| 国产深夜福利视频在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 在线观看人妻少妇| 在线观看三级黄色| 午夜免费观看性视频| 欧美另类一区| 亚洲视频免费观看视频| 青春草亚洲视频在线观看| 在线精品无人区一区二区三| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲成人手机| 国产伦人伦偷精品视频| 9热在线视频观看99| 国产黄色免费在线视频| 亚洲成人一二三区av| 国产极品粉嫩免费观看在线| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 在线天堂最新版资源| 老司机影院成人| 亚洲精品视频女| 亚洲精品国产区一区二| bbb黄色大片| tube8黄色片| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲第一青青草原| 免费观看性生交大片5| 国产高清不卡午夜福利| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品嫩草影院av在线观看|