實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎大鼠模型的制備與評(píng)價(jià)

張明　原曉晶　敖強(qiáng)

[摘要] 目的 探索實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎（EAN）動(dòng)物模型的建立和相關(guān)指標(biāo)的評(píng)價(jià)。 方法 將20只體重140～160 g的 Lewis雌性大鼠隨機(jī)分為EAN組（n = 10）和對(duì)照組（n = 10），并對(duì)各組從1～10進(jìn)行編號(hào)。EAN組采用P0180-199多肽免疫，對(duì)照組注射生理鹽水；免疫后觀察42 d，記錄行為學(xué)變化并評(píng)分；免疫后第18天檢測(cè)兩組大鼠神經(jīng)肌肉動(dòng)作電位、坐骨神經(jīng)電鏡組織學(xué)及免疫組織化學(xué)、腓腸肌HE染色等指標(biāo)。 結(jié)果 EAN組高峰期坐骨神經(jīng)復(fù)合動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），振幅明顯低于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。電鏡結(jié)果顯示EAN組大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)腫脹、蜂窩改變、脫失，軸突變細(xì)或消失。HE染色結(jié)果顯示EAN組大鼠腓腸肌纖維變細(xì)、胞漿淡染等炎癥退行性改變。免疫組化結(jié)果顯示坐骨神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)以水腫、脫失為主者炎癥因子Iba-1（巨噬細(xì)胞）、CD3（T 細(xì)胞）增多；坐骨神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)以脫失為主者神經(jīng)軸蛋白NF200減少；坐骨神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)以蜂窩狀改變、脫失為主者神經(jīng)髓鞘蛋白S100減少。 結(jié)論 采用P0180-199誘導(dǎo)的自身免疫性神經(jīng)炎模型發(fā)病率高，容易復(fù)制，病理改變接近臨床特發(fā)性神經(jīng)炎。本研究EAN發(fā)病高峰期的各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)為該模型進(jìn)一步的病生理過(guò)程探討提供了依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎；模型；脫髓鞘

[中圖分類號(hào)] R745.430.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）05（c）-0026-05

[Abstract] Objective To explore the establishment of experimental autoimmune neuritis （EAN） rat model and the evaluation of related indexes. Methods Twenty female Lewis rats weighing 140-160 g were randomly divided into EAN group （n = 10） and control group （n = 10）， and the number of each group was 1-10. The EAN group was immunized with P0180-199 peptide. The control group was injected with saline. After 42 days of immunization， the behavioral changes were recorded and scored. At the eighteenth days after immunization， the nerve-muscle action potential， sciatic nerve electronic microscope and immunohistochemistry and HE staining of gastrocnemius muscle and other indicators of the rats in the two groups were detected. Results The sciatic nerve conduction velocity in the peak of the compound action potential in the EAN group was lower than that of control group， with statistically significant difference （P < 0.05）， and the amplitude was obviously lower than that of control group， with highly statistically significant difference （P < 0.01）. The results of electron-microscope showed swell， honeycomb changes and miss out of myelin sheath， with an attenuation or disappearance of axon in the EAN group. The results of HE staining showed thinning of gastrocnemius-myofibers and stained cytoplasm and other degenerative changes in the EAN group. The results of immunohistochemistry showed that inflammatory factors Iba-1 （macrophage） and CD3 （T cells） were increased in those with swell and miss out of myelin sheath. The axonal protein NF 200 was decreased in those with miss out of myelin sheath. The myelin protein S100 was decreased in those with honeycomb changes and miss out of myelin sheath. Conclusion The autoimmune neuritis model induced by the P0180-199 has high incidence and easy copy， and the pathological changes are close to clinical idiopathic neuritis. In this study， the evaluation indexes of EAN during peak hours provide a basis for the further study of the physiological process of this disease.

[Key words] Experimental autoimmune neuritis； Model； Demyelination

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎（experimental autoimmune neuritis，EAN）是國(guó)際上公認(rèn)的吉蘭-巴雷綜合征（Guillian-Barre syndrome，GBS）的經(jīng)典動(dòng)物模型，該動(dòng)物模型的建立對(duì)GBS自身免疫性機(jī)制的假說(shuō)起到了很大的支持作用[1-4]。Waksman等在1955年首次使用周圍神經(jīng)勻漿在兔子身上建立了人類GBS模型[5]。其后，研究者們通過(guò)純化的外周神經(jīng)組織勻漿、髓鞘蛋白或合成多肽，來(lái)誘導(dǎo)各種易感動(dòng)物模型，也有研究者將具有抗原特異性T細(xì)胞系靜脈注入動(dòng)物體內(nèi)，來(lái)誘導(dǎo)具有抗原特性的EAN模型[6-7]，其中最為廣泛應(yīng)用的是通過(guò)外周神經(jīng)勻漿、髓鞘蛋白或合成多肽誘導(dǎo)的Lewis大鼠模型，例如采用P0180-199配以不完全弗氏佐劑免疫[8-9]。EAN典型病理表現(xiàn)是T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，外周神經(jīng)組織水腫及脫髓鞘[10-12]，坐骨神經(jīng)及腰髓神經(jīng)根病理改變最明顯，而頸叢神經(jīng)及頸髓神經(jīng)根則不明顯[7]。1975年Allt[13]通過(guò)電鏡對(duì)兔EAN模型外周神經(jīng)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)了髓鞘的兩種變化：髓鞘蜂窩改變和髓鞘脫失。對(duì)于坐骨神經(jīng)組織水腫的病理改變，Izumo等[14]曾通過(guò)神經(jīng)內(nèi)膜的白蛋白和纖維蛋白原免疫組化的檢測(cè)予以證實(shí)，但沒(méi)有更進(jìn)一步細(xì)致的研究。本研究觀察Lewis雌性大鼠EAN模型行為學(xué)、外周神經(jīng)電生理、組織病理學(xué)等各方面的變化，并重點(diǎn)研究外周神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)變化及分類，探討其與炎癥因子、髓鞘蛋白、軸突蛋白間的聯(lián)系，進(jìn)而探討疾病形成機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由于自身免疫性神經(jīng)炎是一種短時(shí)程自限性疾病，雌性Lewis大鼠性情比較溫順，對(duì)于給藥注射免疫應(yīng)急反應(yīng)良好，所以采用健康純系雌性Lewis大鼠20只，6～8周齡，體重140～160 g，并委托清華大學(xué)動(dòng)物平臺(tái)購(gòu)自北京維通利華（Vital River）公司[合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0007]，晝夜12 h交替光照，自由攝食飲水，在室溫（20±2）℃條件下飼養(yǎng)，隔日更換墊料。實(shí)驗(yàn)過(guò)程由清華大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 儀器與試藥

P0180-199（SSKRGRQTPVLYAMLDHSRS）多肽購(gòu)自安徽瀚海博興生物技術(shù)有限公司；不完全氟氏佐劑（Incomplete Freund's Adjuvant，IFA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；結(jié)核分枝桿菌（H37Ra）購(gòu)自美國(guó)DIfco公司。臺(tái)式離心機(jī)（5424）購(gòu)自Eppendorf公司；電生理儀（RM-6240BD/CD生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)2.02版）購(gòu)自成都儀器廠；透射電子顯微鏡（JEM-1200EX）購(gòu)自NIKON公司（日本）；激光共聚焦顯微鏡（FV10i-oil）購(gòu)自O(shè)lympus公司（日本）。

1.3 造模與分組

健康純系Lewis雌性大鼠20只，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成兩組，每組10只，EAN組（P0180-199），對(duì)照組（生理鹽水）。將200 μg P0180-199、1 mg H37Ra、100 μL生理鹽水、100 μL IFA混合液充分乳化，作為一只大鼠的注射用量，注射入雙后肢足底皮下（每只足底100 μL）。對(duì)照組注射生理鹽水100 μL。老鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，然后在兩側(cè)腳掌部位用1 mL注射器分別打入100 μL以上混合好的造模試劑和對(duì)照組等量的生理鹽水。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)主要看大鼠形態(tài)學(xué)上的變化，足底發(fā)紅腫脹，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)潰瘍，尾巴下垂甚至拖地，后肢對(duì)于外界刺進(jìn)反應(yīng)遲緩等因素結(jié)合考慮。

1.4 臨床評(píng)分

免疫當(dāng)天即第0天開始每天對(duì)兩組大鼠進(jìn)行稱重、行為學(xué)評(píng)分記錄，一直到免疫第42天時(shí)結(jié)束。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，正常：0分；尾巴拖地或尾尖上翹：1分；翻正反射受損：2分；中度癱瘓：3分；重度癱瘓：4分；四肢癱瘓或死亡：5分[8]。癥狀介于中間時(shí)評(píng)分值±0.5分。

1.5 神經(jīng)電生理

免疫第18天時(shí)每組大鼠各取5只，稱重，腹腔注射1%戊巴比妥鈉按照3 mg/100 g，進(jìn)行麻醉，放置刺激電極、無(wú)關(guān)電極及記錄電極。采用電生理儀檢測(cè)并記錄神經(jīng)-肌肉動(dòng)作電位（compound muscle action potentials，CMAPs）。將檢測(cè)數(shù)據(jù)代入公式：CCV（m/s）=刺激電極與記錄電極間的距離/傳導(dǎo)時(shí)間，計(jì)算測(cè)定部位的MNCV。

1.6 組織學(xué)觀察

免疫第18天時(shí)取大鼠腓腸肌標(biāo)本，進(jìn)行HE染色：冰凍切片固定15～30 s，稍水洗3～5 s；蘇木精液染色（60℃）8 min；流水洗去蘇木精液5 min；1%鹽酸乙醇5～10 s，流水沖洗30 s；促藍(lán)液返藍(lán)5～10 s，流水沖洗15～30 s；伊紅染色50 s，蒸餾水稍洗4～6 s；脫水，透明，中性樹膠封固，光鏡觀察。

1.7 透射電鏡觀察神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)

免疫第18天時(shí)電生理檢測(cè)后處死大鼠，避開刺激電極接觸部位，雙側(cè)坐骨神經(jīng)各取1 cm長(zhǎng)神經(jīng)，并固定于2.5%戊二醛中。PBS沖洗后經(jīng)系列脫水，無(wú)水乙醇，15 min，95%丙酮15 min；無(wú)水丙酮10 min，5 min換液1次。包埋：將組織放入包埋劑氧化丙烯（1∶1）溶液中1 h，純包埋劑中3 h。超薄切片后用醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色。透射電子顯微鏡觀察、攝片。

1.8 免疫組織化學(xué)

免疫第18天時(shí)從大鼠坐骨神經(jīng)根部取約1 cm長(zhǎng)神經(jīng)做免疫組化。免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記大鼠坐骨神經(jīng)CD3（T細(xì)胞）、Iba-1（巨噬細(xì)胞）、S100（雪旺細(xì)胞）、NF200（軸突細(xì)胞）。免疫熒光染色后用激光共聚焦顯微鏡分析照相。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型鼠發(fā)病及評(píng)分情況

EAN組大鼠從免疫第1天開始出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，包括精神不振、皮毛不潔、雙后足紅腫、體重下降等，免疫第7天時(shí)兩組所有大鼠均出現(xiàn)尾巴拖地行為，即行為學(xué)評(píng)分1分，提示造模成功。第16～17天癱瘓達(dá)到高峰，第18天后逐漸緩解，高峰持續(xù)約10 d，隨后臨床評(píng)分有所下降。EAN組和對(duì)照組臨床評(píng)分結(jié)果見圖1。

2.2 神經(jīng)電生理結(jié)果

EAN組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度為（19.69±4.47）m/s，低于對(duì)照組[（30.98±2.71）m/s]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；EAN組坐骨神經(jīng)動(dòng)作電位振幅為（2.12±0.83）mV，明顯低于對(duì)照組[（12.18±1.71）mV]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖2。

2.3 組織學(xué)觀察結(jié)果

對(duì)照組大鼠腓腸肌表現(xiàn)為胞膜完整，胞質(zhì)染色均勻，胞核位于細(xì)胞邊緣，肌纖維間的空隙較小。EAN組大鼠腓腸肌可見胞膜不完整，胞質(zhì)染色變淺且不均勻，胞核位于細(xì)胞中央甚至消失，肌纖維變細(xì)、排列雜亂，空隙增大。見圖3。

2.4 電鏡結(jié)果

對(duì)照組：神經(jīng)纖維髓鞘和軸索結(jié)構(gòu)正常，圓心軸索周圍有層狀髓鞘板層結(jié)構(gòu)包饒。EAN組：髓鞘板層腫脹；蜂窩狀改變；髓鞘剝脫。見圖4～5。

2.5 免疫熒光化學(xué)結(jié)果

對(duì)照組：髓鞘緊密包饒?jiān)谳S突外層，軸突結(jié)構(gòu)明顯，有散在的炎癥因子。EAN組：①髓鞘腫脹。髓鞘結(jié)構(gòu)變粗，有較多炎癥因子。②髓鞘剝脫。髓鞘結(jié)構(gòu)明顯減少；軸突變細(xì)、減少，有較多炎性因子。③髓鞘蜂窩狀改變。髓鞘結(jié)構(gòu)呈蜂窩狀，炎癥因子明顯少。見圖6～8（封三、封四）。

3 討論

本研究采用大鼠進(jìn)行模型試驗(yàn)，相對(duì)于家兔實(shí)驗(yàn)容易操作，給藥劑量容易把控，在模型建立成功的基礎(chǔ)上家兔對(duì)于疾病的耐受較差，容易導(dǎo)致死亡。評(píng)價(jià)方法方面大鼠在對(duì)于變態(tài)反應(yīng)性方面更加明顯，拖尾程度也是重要的參考標(biāo)準(zhǔn)之一。本研究使用P0180-199誘導(dǎo)Lewis雌性大鼠成功的造模，對(duì)以往文獻(xiàn)中使用P0180-199造模的過(guò)程加以驗(yàn)證[8，15]。采用單盲法觀察，六級(jí)評(píng)分法作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[16-17]。EAN組大鼠免疫第1天開始出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，包括精神不振、皮毛不潔、雙后足紅腫、體重下降等，類似于GBS發(fā)病前的病毒感染癥狀[18]，與免疫原引起全身免疫反應(yīng)有關(guān)；免疫第7天時(shí)兩組大鼠均出現(xiàn)尾巴拖地行為，即行為學(xué)評(píng)分1分，提示造模成功。第16～17天癱瘓達(dá)到高峰，第18天后逐漸緩解，高峰持續(xù)約10 d，隨后臨床評(píng)分有所下降。

電生理檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EAN組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，振幅也明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。傳導(dǎo)速度反映的是傳導(dǎo)最快神經(jīng)纖維的速度[19]，與神經(jīng)軸數(shù)量無(wú)關(guān)，間接反映了神經(jīng)脫髓鞘的病變程度。振幅主要與軸突數(shù)量有關(guān)，數(shù)量越多，振幅就越高[20]。

HE染色結(jié)果顯示，EAN組腓腸肌可見胞膜不完整，胞質(zhì)染色變淺且不均勻，胞核位于細(xì)胞中央甚至消失，肌纖維變細(xì)，排列雜亂，空隙增大，而臨床癥狀表現(xiàn)為后肢腫脹，潰爛，不能自力行走，或拖著后肢緩慢行走，運(yùn)動(dòng)量顯著降低，說(shuō)明在運(yùn)動(dòng)減少后肌肉出現(xiàn)明顯的退行性改變，因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)功能障礙運(yùn)動(dòng)量減少可能引起肌肉的廢用性萎縮[21]。

透射電鏡神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，在EAN組大鼠癥狀達(dá)到高峰期時(shí)出現(xiàn)了四種病理結(jié)果： 髓鞘腫脹；髓鞘剝脫；髓鞘蜂窩狀改變；軸突變細(xì)或消失，對(duì)Allt[13]電鏡病理結(jié)果進(jìn)行了補(bǔ)充和完善。雖然有關(guān)于通過(guò)免疫組織化學(xué)觀察到EAN模型髓鞘腫脹的報(bào)道[14]，但目前尚未見到使用電鏡觀察到這種病理現(xiàn)象的相關(guān)報(bào)道。免疫組化結(jié)果顯示，炎癥因子Iba-1和 CD3在髓鞘腫脹中表達(dá)最多，髓鞘剝脫中次之，而在蜂窩狀改變中的表達(dá)量最少，接近正常，說(shuō)明髓鞘腫脹、剝脫與免疫反應(yīng)中T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的攻擊有密切關(guān)系，而髓鞘蜂窩狀的改變與之關(guān)系不大。這對(duì)EAN神經(jīng)病理生理的進(jìn)一步研究有促進(jìn)作用。

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（收稿日期：2017-02-04 本文編輯：張瑜杰）