腦梗死與纖維蛋白原基因單倍型的相關(guān)性分析

歐寧江+董良哲+歐炎萍+陳絢+李國輝+李軍+蔡永林+湯敏中

[摘要] 目的 探討纖維蛋白原（Fg）基因多態(tài)性及其單倍型與腦梗死的關(guān)系。 方法 選取梧州市紅十字會醫(yī)院2014年1月～2015年11月確診腦梗死患者255例作為病例組，選取同期262例健康體檢者作為正常對照組，運用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)進行βBcl-1 G/A和αTaq-1位點基因分型，運用Taqman實時熒光定量PCR探針法進行448G/A、-148C/T、- 455G/A、- 854G/A、rs6050進行基因分型，運用核苷酸序列測定對1211A/G、1202C/T進行分析，采用Haploview軟件進行基因單倍型的構(gòu)建及分析，用Clauss法測定血漿Fg水平。 結(jié)果 9個纖維蛋白原基因位點中，-455G/A多態(tài)性的基因型頻率和等位基因頻率在病例組和對照組之間的差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），448G/A、-148C/T、-854 G/A核苷酸多態(tài)性的基因型頻率、等位基因頻率在病例組和對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。-455A攜帶者患腦梗死的相對危險度比非攜帶者大5.203倍。1211A/G、1202C/T均為野生型，沒有發(fā)現(xiàn)突變位點。單倍型分析結(jié)果顯示-455G/A與-148C/T及448G/A三個位點存在緊密連鎖，其構(gòu)成的單倍型與腦梗死的發(fā)生呈正相關(guān)，其中單倍型ATA、ATG有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 Fg基因與腦梗死發(fā)生的存在顯著的單倍型相關(guān)性，F(xiàn)gβ-455G/A、-148C/T、448G/A 可能是人群中與腦梗死關(guān)聯(lián)的危險因素。

[關(guān)鍵詞] 纖維蛋白原；基因多態(tài)性；腦梗死；連鎖不平衡；單倍型

[中圖分類號] R743.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（b）-0068-05

[Abstract] Objective To discuss the relationship between fibrinogen （Fg） gene polymorphism and its haplotype with cerebral infarction. Methods From January 2014 to November 2015， in Wuzhou Red Cross Hospital， 255 patients with cerebral infarction were selected as case group， and at same time， 262 healthy persons were selected as control group. βBcl-1 G/A and αTaq-1 site gene typing were taken by polymerase chain reaction （PCR） -restricted fragment length polymorphism analysis technology， Taqman real-time fluorescence quantification PCR probe method was applied to take 448G/A， -148C/T， -455G/A， -854G/A， rs6050 for gene typing， 1211A/G， 1202C/T were analyzed by nucleotide sequence determination， the establishment and analysis of gene haplotype were made by Haploview software， and finally Clauss method was taken to measure blood-plasma Fg level. Results In 9 Fg genetic locus， the difference of genotype frequency and allele frequency of -455G/A polymorphism between case group and control group was statistical significance （P < 0.01）， the differences of genotype frequency and allele frequency of 448G/A， -148C/T， -854G/A nucleotide polymorphism between case group and control group were no statistical significance （P > 0.05）. The relative risk of -455A carriers suffering from cerebral infarction was 5.203 times higher than that of non-carriers. Both 1211A/G， 1202C/T were wild types， mutation sites were not found. Haplotype analysis result showed that close linkage was in 3 sites that-455G/A， -148C/T， 448G/A， haplotype formed by it and occurrence of cerebral infarction had significant positive correlation， and haplotype ATA and ATG had statistically significant differences （P < 0.01）. Conclusion Fg gene and cerebral infarction occurrence had significant haplotype correlation， Fgβ-455G/A， -148C/T， 448G/A may be the risk factors of people associated with cerebral infarction.

[Key words] Fibrinogen； Gene polymorphism； Ischemic stroke； Linkage disequilibrium analysis； Haplotype

腦血管病是人類主要的病殘和死亡原因，流行病學(xué)顯示中青年腦血管病發(fā)病率有逐年遞增的趨勢，2/3的腦血管病是由于動脈粥樣硬化而致的缺血性腦血管病。近年來，大量的研究表明血漿纖維蛋白原（Fg）是血栓性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要獨立危險因素，F(xiàn)g基因多態(tài)性可導(dǎo)致個體血漿Fg水平的差異，并可能與缺血性疾病的發(fā)生有關(guān)。本文采用病例對照的研究方法對腦梗死患者Fg基因的9個多態(tài)性位點進行檢測，并采用單倍型分析的方法進一步探討Fg遺傳標志物與腦梗死的關(guān)系及其臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取梧州市紅十字會醫(yī)院2014年1月～2015年11月確診腦梗死患者255例作為病例組，選取同期262例健康體檢者作為正常對照組。病例組：男148例，女107例，年齡28～98歲，平均（68.2±11.4）歲，均符合全國第四屆腦血管疾病會議修訂的診斷標準，所有病例均經(jīng)影像學(xué)確診，體檢及實驗室檢查無其他心腦血管疾病。正常對照組：男141例，女121例，年齡35～80歲，平均（64.0±10.2）歲，無心腦血管、肝、腎、甲狀腺疾病及糖尿病史，采血前1個月無服藥史。

1.2 檢測方法

1.2.1 標本采集 晨起空腹抽取靜脈血1.8 mL于109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝管中，混勻，在2 h內(nèi)經(jīng)離心分離血漿，收集白細胞富集層血細胞，置-20℃保存。

1.2.2 Fg水平檢測 使用希森美康CS-5100全自動血凝儀和西門子試劑，采用Clauss法，樣本采集后4 h內(nèi)完成檢測。

1.2.3 DNA制備 取血細胞200 μL，按TIANamp Blood DNA Kit（離心柱型）血液基因組DNA提取試劑盒說明書（Tiangen Biotech[Beijing]CO.LTD）提取基因組DNA，置-20℃保存。

1.2.4 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 各引物序列及內(nèi)切酶、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）編號（ID）詳見表1。

1.2.5 PCR擴增 PCR反應(yīng)總體系為40 μL，其中包含5×PCR緩沖液8 μL，10mmol/L dNTP 0.8 μL，25 mmol/L MgCl2 0.8 μL，上游引物、下游引物各0.8 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，DNA 50 ng（5 μL），去離子水23.6 μL。Bcl-1 G/A擴增循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性3 min ，然后按95℃ 15 s、62℃ 15s、72℃ 60 s共5循環(huán)，接著95℃ 15 s、58℃ 15 s、72℃ 60 s共26循環(huán)，最后72℃延長7 min。αTaq-1擴增循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性7 min，然后按94℃ 55 s、54℃ 50 s、72℃ 50 s共5循環(huán)，接著94℃ 55 s、58℃ 50 s、72℃ 50 s共27循環(huán)，最后72℃延長5 min。1211A/G和1202C/T擴增循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，然后按95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s共30循環(huán)，最后72℃延長，1 0 min。PCR擴增后取2 μL PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，110 V 30 min，在紫外燈下鑒定。使用美國ABI公司Veriti 96cellThemal Cycler PCR擴增儀，北京六一儀器廠DYY-6C型電泳儀，美國BIO-RAD Molecular Imager凝膠成像儀。

1.2.6 限制性酶切PCR 擴增產(chǎn)物 酶切反應(yīng)總體系為20 μL，其中包括酶切緩沖液2 μL，內(nèi)切酶0.5 μL，PCR 產(chǎn)物10 μl，去離子水7.5 μL。Bcl-1G/A酶切反應(yīng)參數(shù)：50℃ 15 min。αTaq-1酶切反應(yīng)參數(shù)：65℃ 60 min。隨后取5 μL酶切產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，100 V 30 min ，在紫外燈下鑒定。

1.2.7 Taqman探針檢測程序 本實驗采用Taqman MGB探針實時熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）探針法進行基因分型，檢測位點包括448G/A、-148C/T、-455G/A、-854G/A、rs6050，總反應(yīng)體系為11 μL，其中包括2×緩沖液5 μL，40×Probes0.25 μL，DNA1 μL（10 ng/μL），去離子水4.75 μL。使用ABI7500基因擴增儀，SNP genotyping程序進行檢測（檢測時長90 min）。

1.2.8 基因測序 基因位點1202C/T和1211A/G的擴增產(chǎn)物與引物一起送華大基因生物科技（深圳）有限公司進行基因雙向序列測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行分析，用基因記數(shù)法計算各組基因型頻率和等位基因頻率。采用Haploview 4.2軟件進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗（Hardy-Weinberg，HW）。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗

9個多態(tài)性的檢測分析發(fā)現(xiàn)Fgβ448G/A、-148C/T、- 455G/A、-854G/A基因位點符合H-W平衡，因此隨后的多態(tài)性分析及單倍型分析均基于這4個位點進行。在梧州人群中1211A/G、1202C/T均為野生型，不具有位點多態(tài)性，所以不再作進一步分析。

2.2 4個位點SNPs基因型和等位基因頻率的分布

β-455G/A多態(tài)性的基因型頻率、等位基因頻率在病例組和對照組之間的差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），比值比（OR）分別為5.20和1.64，95%置信區(qū)間（95%CI）分別為2.43～11.13、1.21～2.22，其余3個位點多態(tài)性的基因型頻率、等位基因頻率在病例組和對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表2～5。

2.3 PCR擴增產(chǎn)物的酶切電泳結(jié)果

βBcl-1 G/A、αTaq-1位點PCR產(chǎn)物的酶切電泳結(jié)果詳見圖1～2。

2.4 4個位點突變基因型血漿Fg水平的比較

血漿Fg水平在不同基因型分組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表6。

2.5 單倍型分析

單個位點分析時β-455G/A多態(tài)性與腦梗塞關(guān)聯(lián)，且與-148C/T和448G/A存在緊密連鎖，連鎖不平衡參數(shù)D'分別為：-148C/T和448G/A （1.0），448G/A與-455G/A（0.977），-148C/T與-455G/A（0.984）。見圖3（封三）。3個基因多態(tài)性位點構(gòu)建的主要單倍型與腦梗塞的發(fā)生呈正相關(guān)，其中單倍型ATA、ATG差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表7。

3 討論

人群Fg基因多態(tài)性頻率的分布存在種族、地區(qū)差異，一個集合了Pubmed、Embase以及4個中國數(shù)據(jù)庫的總共45篇文獻meta分析[1]結(jié)果顯示，F(xiàn)gβ-455G/A基因型頻率（AA+GA，GG）與IS風險關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計學(xué)意義（OR=1.52，95%CI：1.28～1.80）。Martiskainen等[2]歷時12.5年對486例芬蘭絕經(jīng)后婦女（55～71歲）腦卒中病例隨訪發(fā)現(xiàn)，攜帶-455A與腦卒中發(fā)作后的生存風險相關(guān)，而Golenia等[3]的研究顯示β-455G/A基因多態(tài)性不是波蘭人IS發(fā)生的相關(guān)風險因素。因此，我們選擇可能影響血漿Fg水平或功能的9個位點，對梧州地區(qū)部分人群進行Fg基因多態(tài)性及單倍型相關(guān)性分析，以研究Fg基因多態(tài)性位點與腦血管疾病的關(guān)系，了解不同基因型個體的遺傳易感性。

本研究在廣西壯族自治區(qū)梧州人群當中共檢出7個多態(tài)性位點，對于其中不符合H-W平衡的位點（βBcl-1G/A、αTaq-1、rs6050），不再繼續(xù)對檢測數(shù)據(jù)進行分析。Fgα鏈1211A/G、1202C/T均為野生型，其突變多見于遺傳性異常纖維蛋白缺陷癥的報道[4-5]，表現(xiàn)為纖維蛋白原功能或量的異常。Chudakova等[6]報道在-455位點攜帶A等位基因者，血漿Fg測定值較高。本研究數(shù)據(jù)顯示-455（GA+AA）組Fg血漿水平（3.20 g/L）比-455（GG）組（2.98 g/L）略高，但沒有顯著差異（P = 0.257），與國內(nèi)相關(guān)報道也存在差距[7]。這可能與Fg的檢測方法學(xué)差異有關(guān)，但仍提示在臨床上對于攜帶-455A者，應(yīng)密切監(jiān)測其血漿Fg水平，以便及時采取有效的診治措施，預(yù)防缺血性心腦血管疾病的發(fā)生。448G/A、-148C/T、-455G/A、-854G/A均位于Fg的編碼基因FGB啟動區(qū)，近年來研究認為，位于啟動子區(qū)的SNPs可能直接影響該基因的表達水平。分析各多態(tài)性位點的等位基因分布情況，我們發(fā)現(xiàn)，本研究隊列中病例組-455A基因頻率（0.368）與報道相近，略高于山東青島地區(qū)（0.304）[8]、廣東湛江地區(qū)（0.302）[9]、新疆維吾爾族（0.293）和漢族（0.232）[10]、河北唐山地區(qū)（0.248）[11]，對照組-455A頻率0.267，略高于天津地區(qū)（0.185）[12]、北京地區(qū)（0.207）[13]，而與廣東地區(qū)廣州籍人（0.276）[14]接近；無論從基因型頻率和等位基因頻率的分布來看，-455A攜帶者患腦梗死的相對危險度比非攜帶者高（P < 0.01），OR值分別為5.20和1.67，與文獻報道其它區(qū)域人群的研究結(jié)果相近[7]。病例組中其余位點的最小等位基因（MAF）-148T（0.284），與河北唐山地區(qū)（0.307）[11]和廣東（0.303）[15]接近而低于湖南漢族（0.325）[16]；448A（0.274）略高于于湖南郴州地區(qū)（0.204）[17]，-854A（0.053）的頻率也與上海地區(qū)（0.049）[18]接近。

關(guān)于其作用機制，De Maat等[19]發(fā)現(xiàn)-455G/A位點的AA基因型患者冠狀動脈粥樣硬化的進展很快，推測該基因型通過增高血漿Fg水平而導(dǎo)致冠狀動脈疾病的進展。Martiskainen等[20]發(fā)現(xiàn)，-455A等位基因多存在于多病灶性（病灶≥3個）小動脈粥樣硬化性腦梗死的個體，而G/A基因多態(tài)性在大動脈粥樣硬化性腦梗死中未顯示出統(tǒng)計學(xué)意義。Ajjan等[21]發(fā)現(xiàn)，將Bβ448位的Arg突變?yōu)長ys后，形成的纖維蛋白更細，孔徑更小，且由其形成的凝塊更堅固且不易溶解。單倍型分析可以直接提示基因在染色體上的連鎖關(guān)系，通過單倍型分析可以發(fā)現(xiàn)與疾病易感性相關(guān)的核苷酸多態(tài)性[7]，本文數(shù)據(jù)顯示，-455G/A、-148C/T、448G/A呈緊密連鎖，β-455G/A、-148C/T和448G/A基因多態(tài)性位點構(gòu)建的主要單倍型與腦梗死的發(fā)生呈正相關(guān)，其中病例組的ATA單倍型頻率（63.3%）顯著低于對照組（71.8%）（P < 0.01），而病例組的ATG單倍型頻率（9.2%）則顯著高于對照組（0.8%）（P < 0.01）。研究數(shù)據(jù)顯示梧州人群中，F(xiàn)g基因單倍型與腦梗死呈現(xiàn)獨特的單倍型相關(guān)，攜帶ATG單倍型的個體（OR=12.61，P < 0.01）其發(fā)病風險性顯著高于攜帶單一多態(tài)性位點突變的個體（OR=5.20，P < 0.01）。

因此，本研究組認為，進行疾病等位基因多態(tài)性位點及單倍型表達的研究有助于對其遺傳特性的分析?？梢钥隙ǖ氖?，F(xiàn)g基因多態(tài)性與環(huán)境因素的協(xié)同作用，使某些基因型個體更容易受環(huán)境因素的影響，從而增加血栓性疾病發(fā)生的危險。因此，選擇性多位點Fg基因多態(tài)性的聯(lián)合檢測，對于早期發(fā)現(xiàn)缺血性心腦血管疾病的易感個體并探索個體化的干預(yù)治療具有十分重要的意義。

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（收稿日期：2017-02-17 本文編輯：蘇 暢）