國(guó)內(nèi)花卉花香基因研究進(jìn)展

毛立彥+韋勇杰+覃茜+賓振鈞+龍凌云+謝振興+郝小玲+於艷萍

摘 要：花香是花卉“形、色、香”三要素之一，是評(píng)價(jià)花卉品質(zhì)的重要依據(jù)，并有可能在花卉植物的抗逆性中起著關(guān)鍵作用。近20年來，國(guó)內(nèi)對(duì)花香的研究大多集中于花香成分分析，對(duì)于花香基因研究起步晚，文章綜述了國(guó)內(nèi)在花香基因克隆、分離及轉(zhuǎn)基因方面的研究進(jìn)展，同時(shí)展望了我國(guó)今后花香基因的研究方向。

關(guān)鍵詞：花香 基因 克隆 基因分離 轉(zhuǎn)基因

花香是由植物散發(fā)的一系列低分子量揮發(fā)物所致，不同花卉植物散發(fā)出的揮發(fā)物種類，含量不同，比例不同都會(huì)導(dǎo)致最終形成的香味也不同。因此，不同花卉植物往往具有自己的獨(dú)特香味。花香對(duì)于植物繁衍和生長(zhǎng)過程起著重要作用，通過花香可以吸引昆蟲幫助其授粉，也可以吸引食草動(dòng)物的天敵，從而減少對(duì)自己的傷害。另外花香也是植物應(yīng)激反應(yīng)的重要信號(hào)物質(zhì)[1]。從花香植物中提取香精、香料作為化妝品和輕工業(yè)的原料是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的重要問題。影響花香的因素主要有植物基因型，花的發(fā)育階段、植物開花時(shí)一系列激素水平及環(huán)境因素，其中植物基因型是花香化合物種類、含量的決定因素[2]。國(guó)內(nèi)對(duì)于花香基因的研究剛剛起步，主要集中于花香相關(guān)基因克隆、花香基因工程等方面。本文根據(jù)國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)資料對(duì)國(guó)內(nèi)花香基因研究進(jìn)展進(jìn)行了簡(jiǎn)要概述，旨在為花卉花香的理論研究提供參考。

1 花香化合物種類及相關(guān)基因

花香化合物主要包含3類揮發(fā)性物質(zhì)即脂肪酸衍生物，萜類化合物和苯丙酸類化合物/苯環(huán)型化合物，其中脂肪酸衍生物起源于丙二酸途徑，萜類化合物主要包括單萜和倍半萜，起源于甲羥戊酸途徑，苯丙酸類化合物/苯環(huán)型化合物起源于莽草酸途徑[3]根據(jù)花香物質(zhì)的合成途徑，研究者們?cè)谙膳?、煙草、月季、矮千牛、金魚草等模式植物中篩選出13個(gè)香味化合物合成關(guān)鍵酶的基因，詳見表1。

隨著分子生物學(xué)研究的深入和進(jìn)步，在幾種模式植物的基礎(chǔ)上研究者們不斷采用多種分子生物學(xué)手段從其它花卉植物中分離、克隆相關(guān)花香基因，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行了研究。

2 花香基因分離、克隆和表達(dá)分析

由于花香是花卉植物的三要素之一，因此運(yùn)用基因工程手段對(duì)無香味花卉進(jìn)行花香花卉優(yōu)選育種是提高花卉品質(zhì)的重要手段。對(duì)于花香基因的轉(zhuǎn)基因研究要先從花香基因的分離、克隆開始。國(guó)內(nèi)相對(duì)于國(guó)外花香基因工程研究起步晚，現(xiàn)在大多集中于此階段。其中在模式植物矮千牛上，張海英克隆出了花香基因BSMT3，并對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和原核表達(dá)研究[4]，肖志娜從矮千?；ò曛泻Y選出了控制乙烯傳導(dǎo)途徑的ERF因子，最終得出phERF6，phERF25，phERF30均能抑制花香基因的表達(dá)[5]。陳陳采用RACE手段獲得了玫瑰單萜類花香化合物合成相關(guān)基因RrDXR和RrAAT基因，并對(duì)其在玫瑰不同發(fā)育時(shí)期和花器官不同部位進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)規(guī)律研究[6]，在接下來的兩年中分別從玫瑰中克隆出了與單萜類合成相關(guān)的RrLIS基因[7]和與2-苯丙醇生物合成相關(guān)的RrAADC，RrPAR基因，并對(duì)其在花中的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行了分析[8]，陳功對(duì)玫瑰進(jìn)行鹽脅迫研究發(fā)現(xiàn)，雖然鹽脅迫條件下花香基因RrDXR、RrDXS2和RrAAT的表達(dá)上調(diào)，但由于這些基因?qū)τ谥参锏哪婢硲?yīng)激反應(yīng)相關(guān)，并未引起花香物質(zhì)的增多和花香味的加濃[9]。通過對(duì)幾種模式花卉植物的花香物質(zhì)合成酶基因的分離克隆進(jìn)一步加強(qiáng)了我國(guó)在花香基因利用方面的研究。

經(jīng)過多年努力，隨著國(guó)際花香基因研究突破，我國(guó)花香基因分離、克隆研究起點(diǎn)高，很快突破到了除模式花卉植物的其他物種，如蘭花、桂花、百合、梅花、蠟梅等。在蘭花花香基因研究中，2006年王健等用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)分離出跟春蘭相關(guān)的香味基因片段[10]。樊榮輝在小蒼蘭中分離出了LIS基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和在花朵中的時(shí)空表達(dá)研究[11]，周銀在蕙蘭中分離出控制花香合成的基因CfAOC，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析[12]。

在桂花花香研究中，張園利用cDNA-AFLP技術(shù)從桂花中分離出6個(gè)可能與其香味物質(zhì)合成途徑相關(guān)的酶，其中AACT、CCD4為兩個(gè)萜類化合物基因，2OGox2，CFAT和C4H1為三個(gè)苯丙烷類化合物代謝途徑相關(guān)酶基因，LOX為脂肪酸衍生物合成途徑相關(guān)酶，但其全長(zhǎng)有待進(jìn)一步研究[13]。陳蓉[14]與鄭玉娟[15]分別從四季桂和月月桂中分別克隆出GES、ADH和AACT基因全長(zhǎng)，并對(duì)其在花中的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行了分析，陳麗莉在四季桂花瓣中分離出DXPS基因，并研究了其時(shí)空表達(dá)[16]，以上為我國(guó)桂花香氣的利用奠定了基礎(chǔ)。

在百合上研究者們分別先后克隆出花香物質(zhì)合成酶基因LrBSMT、LiLis[17]、LiMys[18]、LIFPPS[19]和調(diào)控基因LoCOP1和LoSPA[20]，為百合花香基因合成和調(diào)控機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

在水仙研究中研究者先后利用RACE和抑制削減雜交文庫等分子生物學(xué)手段從水仙中分離出控制萜類化合物合成的DXPS、DXR[21]和HMGS[22]基因及控制苯丙氨酸代謝的SAMT[23]基因，這些基因的成功分離為下一步研究花香調(diào)控機(jī)理及花香基因工程研究都具重要意義。

在夜來香的花香基因研究中，花香基因科研工作者先后采用RT-PCR和RACE結(jié)合技術(shù)分離出于花香物質(zhì)合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子：NAC、MYB和GCS[24]及花香不同花香代謝途徑的關(guān)鍵酶基因LIS和FPPS[25]和SAMT[26]，為夜來香花香基因的轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)提供了材料。

作為我國(guó)名花的蠟梅，擁有怡人芬芳，經(jīng)研究表明其主要花香成分為萜類和苯環(huán)類揮發(fā)物，通過RT-PCR和RACE聯(lián)合技術(shù)從蠟梅中分離出SAMT和FPPS兩個(gè)基因，并利用原核表達(dá)技術(shù)驗(yàn)證了其功能，實(shí)時(shí)定量辦法測(cè)定了其在花中的時(shí)空表達(dá)[27]。在此基礎(chǔ)上，葉蕾[28]克隆得到了兩個(gè)可能與蠟梅花香調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子：CpODO1，CpODO2，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)分析，陳金豆進(jìn)一步探究了CpODORANT1 和 Cp ODORANT2基因的功能，證明其確實(shí)與花香物質(zhì)表達(dá)量相關(guān)[29]。此外，在四大君子之一的梅花上，研究者們先通過生物信息學(xué)手段對(duì)于丁子香酚基因相關(guān)的基因PmOMT基因的結(jié)構(gòu)[30]，進(jìn)一步成功分離出3個(gè)丁子香酚合酶基因即PmEGS1、PmEGS2、PmEGS3，并測(cè)定了其在花中的時(shí)空表達(dá)[31]。

茉莉花是我國(guó)江浙一帶的食賞兩用型多功能花卉，其香氣濃郁，是著名的花茶原料。為了解茉莉花的香氣形成機(jī)理，科研工作者們先后從其花瓣中克隆分離出FPPS、DXS、HMGR、PAL、SAMT基因，并獲得其全長(zhǎng)，運(yùn)用熒光定量法分析其在花中的時(shí)空表達(dá)[32]，張芊在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用cDNA-AFLP技術(shù)分析得到85個(gè)可能與萜類和苯類/苯丙素類物質(zhì)代謝相關(guān)基因，進(jìn)一步篩選出確定與茉莉花香氣相關(guān)的6條基因[33]，以上對(duì)我國(guó)促進(jìn)茉莉花香氣機(jī)理研究明確了方向。

此外，張雪榮成功克隆出薰衣草中的芳樟醇合成酶基因全長(zhǎng)，并對(duì)該基因進(jìn)行了在煙草中的轉(zhuǎn)基因研究，最終在煙草中檢測(cè)到了該基因的表達(dá)[34]。郭鳳芝在玳玳華克隆出了跟脂氧化相關(guān)的酶基因HPL，該基因合成的酶催化花卉植物特異性氣味物質(zhì)的合成[35]，高耀輝在神農(nóng)香菊中克隆出DiaMYB基因[36]，張騰旬比較了百合、百里香等四種植物的TPS的結(jié)構(gòu)[37]，這些花香基因的分離、表達(dá)分析都為我國(guó)花香基因研究做出了貢獻(xiàn)。

3 花香轉(zhuǎn)基因研究

利用花香基因進(jìn)行花卉植物的定向育種中一個(gè)不可避免的步驟即進(jìn)行花香基因的轉(zhuǎn)基因，并檢測(cè)其表達(dá)。我國(guó)在這方面的研究雖然少，但也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，龐宏東等將蠟梅的SAMT基因分別轉(zhuǎn)入煙草[38]和矮千牛[39]中，最終檢測(cè)有部分的香味揮發(fā)物質(zhì)的增高，陳蓉將桂花的ADH基因成功轉(zhuǎn)入了紅檵木中并最終檢測(cè)篩選出了轉(zhuǎn)基因植株，但并未對(duì)其香味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)[14]，葉蕾將蠟梅的花香相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入擬南芥和煙草中，最終篩選出10株成功轉(zhuǎn)入的植株[28]，王佳將玫瑰的花香物質(zhì)合成基因成功轉(zhuǎn)入了矮千牛中，并誘導(dǎo)出了愈傷組織[40]，張雪榮將薰衣草的芳樟醇合酶基因成功轉(zhuǎn)入了煙草[34]，鄭鴻昌將夜來香的3個(gè)花香相關(guān)基因轉(zhuǎn)入煙草，最終篩選出了轉(zhuǎn)基因植株[24]。

4 我國(guó)花香基因研究展望

經(jīng)過多年的努力，我國(guó)在高起點(diǎn)的花香基因研究中取得了豐碩的成果，初步得到了多種植物花香產(chǎn)物代謝途徑的相關(guān)酶基因，但目前我國(guó)國(guó)內(nèi)的花香基因研究多數(shù)集中在基因分離、克隆、表達(dá)分析及功能驗(yàn)證方面，在轉(zhuǎn)基因?qū)爰盎蛘{(diào)控手段方面研究較少，因此在今后的研究中，應(yīng)不斷加強(qiáng)花香基因克隆分析，了解花香形成分子機(jī)制的同時(shí)開展已有花香基因的轉(zhuǎn)基因研究，力爭(zhēng)對(duì)不具備花香的花卉植物進(jìn)行花香基因轉(zhuǎn)入產(chǎn)生花香，定向育成多種花香、色美、形優(yōu)的優(yōu)良花卉品系，將我國(guó)的花卉育種事業(yè)提高到新的高度。

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