番茄斑萎病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

覃茜　張艷明　韋勇杰　羅清　謝振興　於艷萍

摘 要：番茄斑萎病毒能侵染多種作物產(chǎn)生嚴(yán)重病害，對(duì)其進(jìn)行鑒定和檢測(cè)尤為重要。文章從電子顯微技術(shù)、血清學(xué)技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)等三種檢測(cè)技術(shù)對(duì)番茄斑萎病毒的鑒定及檢測(cè)進(jìn)行了綜述，總結(jié)出番茄斑萎病毒檢測(cè)技術(shù)目前存在檢測(cè)成本高，試劑毒性大等問題，同時(shí)，病毒無法進(jìn)行離體培養(yǎng)，限制了研究工作的進(jìn)一步開展。最后展望了多種檢測(cè)技術(shù)在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：番茄斑萎病毒 檢測(cè)技術(shù) 研究進(jìn)展

番茄斑萎病毒病的病原為番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus， TSWV），該病毒屬于布尼亞病毒科（Bnuyaviridae），番茄斑萎病毒屬（Tospovirus），主要通過薊馬傳播危害植物，侵染后發(fā)病的癥狀多為嚴(yán)重的壞疽，或致使寄主細(xì)胞質(zhì)壁分離[1-2]。1919年該病害首次報(bào)道于澳大利亞，19世紀(jì)80、90年代曾暴發(fā)流行于美國夏威夷、意大利，危害番茄、萵筍等作物，造成毀滅性災(zāi)害，20世紀(jì)90年代末，該病迅速在日本各地傳播，現(xiàn)廣泛流行世界各地。目前，番茄斑萎病毒病因其對(duì)多種作物均能造成嚴(yán)重的危害并造成重大經(jīng)濟(jì)損失而被列為世界十大農(nóng)業(yè)病害之一，在國際上備受重視[3-4]。

Tospovirus的病毒粒子為球形，直徑80～110 nm，外層包被一層脂質(zhì)，脂質(zhì)由G1和G2兩種多糖蛋白組成，基因組由3個(gè)片段（LRNA，MRNA和SRNA）組成，屬于負(fù)單鏈RNA （-ssRNA類型）[5]。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，Tospovirus由最初確定的一個(gè)種（TSWV）增加到目前的19個(gè)種，其中確定種14個(gè)，暫定種5個(gè)。Tospovirus寄主廣泛，可侵染84個(gè)科1090種植物[6]。再加上該病毒種類繁多、侵染植株癥狀不一，故對(duì)其進(jìn)行鑒定和檢測(cè)顯得尤為重要。本文就近年來電子顯微技術(shù)、血清學(xué)技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)等檢測(cè)方法在TSWV病毒鑒定檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1 電子顯微技術(shù)

電子顯微技術(shù)是病毒檢測(cè)的常用手段，可用于病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其寄主的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化的觀察。自Kausche等1939年首次在電鏡下觀察到煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）以來，電子顯微技術(shù)就成為植物病毒研究不可或缺的常規(guī)手段之一[7]。寄主植物被TSWV侵染后，體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)典型的球狀并具包膜的植物病毒粒體，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有包含體聚集，可通過電鏡觀察感病植株組織來鑒定，這在電子顯微鑒定上有十分重要的意義[8-10]。

1.1 負(fù)染色法（Negative stain）

負(fù)染色法以快速簡便著稱，它可直接觀察病毒粒體的大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)、有無包膜等[11]。TSWV的病毒粒子聚集于延伸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池中，內(nèi)含體作為其診斷的依據(jù)[12]。經(jīng)電鏡負(fù)染色法觀察TSWV，可見該病毒粒體直徑為80～110 nm，球形，一般有1層厚度約5 nm的外膜，外膜的厚度各不相同，有的外膜消失，僅見核殼體[10]。

1.2 超薄切片法（Ultrathin Sectioning）

當(dāng)病毒侵染植物后，植物細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生具有一定分布特點(diǎn)的特征性內(nèi)含體，利用超薄切片法鑒定觀察，可診斷鑒定病毒病原和細(xì)胞病理。王健華等[7]通過對(duì)被TSWV侵染的云南烤煙進(jìn)行超薄切片制樣和染色后觀察發(fā)現(xiàn)受侵染細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)隨著侵染時(shí)間的增長受破壞程度增大。早期，負(fù)染和超薄切片電鏡還有被用于不同株系的巨細(xì)胞病毒（Cytomegaoviyns，CMV）的區(qū)分和馬鈴薯Y病毒屬的9個(gè)病毒種的鑒別等[13-14]。

1.3 免疫電鏡（Immunosorbent Electron Microscop

y，IEM）

1973年，Derrick K S將免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合到電鏡技術(shù)當(dāng)中，發(fā)明出免疫吸附電鏡技術(shù)，該技術(shù)較電鏡技術(shù)更為靈敏，現(xiàn)已成為植物病毒研究的一個(gè)重要技術(shù)[15]。后來， Louro D等人在此基礎(chǔ)上發(fā)明了懸浮樣品的膠體金標(biāo)記免疫修飾法[16]。免疫電鏡的出現(xiàn)為番茄斑萎病毒屬的鑒定提供了便利條件[8]。

2 血清學(xué)技術(shù)

檢測(cè)植物病毒最為常用和有效的手段之一是血清學(xué)技術(shù)。由于不同病毒產(chǎn)生的抗血清各不相同，因此可以用已知病毒的抗血清來鑒定未知病毒的種類[17]。

2.1 免疫膠體金技術(shù)（Immune Colloidal Gold Technique，GICT）

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，它應(yīng)用于抗原抗體。1983年，該技術(shù)首次用于檢測(cè)植物病毒。之后做了改進(jìn)，使檢測(cè)更為快速簡易。在TSWV檢測(cè)上，美國Agdia公司發(fā)明并推廣應(yīng)用了TSWV試紙，給TSWV等的檢測(cè)提供了便利[18]。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 是目前應(yīng)用最廣泛的血清學(xué)檢測(cè)法。自1977年Clark等人發(fā)明了檢測(cè)植物病毒的ELISA法[19]，它便在植物病毒檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。ELISA測(cè)定的基本原理是以酶催化的顏色反應(yīng)指示抗原抗體的結(jié)合，具有所需材料少、操作簡單方便、且多種病毒可同時(shí)測(cè)定的特點(diǎn)，已得到廣泛的推廣和應(yīng)用。2013年，劉陳晨等利用ELISA檢測(cè)重慶煙草上的番茄斑萎病毒[20]。

2.3 雙抗體夾心法（Double Antibody Sandwich，DAS-ELISA）

雙抗體夾心法建立于ELISA的技術(shù)基礎(chǔ)上，具有更高的靈敏性和更強(qiáng)的專化性。近年來，此方法被多次應(yīng)用于TSWV的檢測(cè)，如馮黎霞等通過此方法，快速地從美國進(jìn)境的生菜種子中篩選出攜帶有TSWV的樣品[21]。

2.4 三抗酶聯(lián)反應(yīng)吸附測(cè)定法（Triple Antibody Sandwich ELISA，TAS-ELISA）

早在70年代，就有先人成功應(yīng)用三抗酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法TAS-ELISA檢測(cè)病毒的例子。薊馬個(gè)體小，常規(guī)方法很難檢測(cè)單個(gè)薊馬體內(nèi)所攜帶的病毒，但是Roggero等卻應(yīng)用TAS-ELISA成功地檢測(cè)到西花薊馬（Frankliniella occidentalis）上的TSWV病毒[22]。

2.5 組織印跡法（Tissue blot-ELISA）

組織印跡法（Tissue blot-ELISA）是在ELISA的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的檢測(cè)技術(shù)，該方法進(jìn)行特異性反應(yīng)前，先將待檢樣品在硝酸纖維膜上進(jìn)行印跡。Whitfield等采用此方法成功檢測(cè)到鳳仙花（Impatiens balsamina）等受侵染觀賞植物中的 TSWV[23]。組織印跡法特別適用于大規(guī)模的植物病毒檢測(cè)。

3 分子生物學(xué)技術(shù)

目前病毒檢測(cè)最常用的手段是分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是快速檢測(cè)、重復(fù)性好，缺點(diǎn)是對(duì)核酸質(zhì)量要求高，儀器設(shè)備昂貴等。但是，該檢測(cè)技術(shù)也在不斷地更新發(fā)展，衍生出一系列的RT-PCR技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)等。

3.1 逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription-PCR，

RT-PCR）

RT-PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是特異強(qiáng)、快速簡便、靈敏等，它是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法。RT-PCR技術(shù)已在90年代就被成功應(yīng)用于TSWV檢測(cè)，后來Cortezi等對(duì)該技術(shù)做了改進(jìn)，使檢測(cè)更靈敏、可靠[24]。馮黎霞等人對(duì)通過DAS-ELISA篩選出攜帶TSWV的生菜種子后進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，成功的檢測(cè)到TSWV[21]。2017年，李潔等人首次利用同樣的技術(shù)對(duì)山東地區(qū)的TSWV進(jìn)行了證實(shí)[25]。

3.2 多重RT-PCR技術(shù)（Multiple RT-PCR）

多重RT-PCR技術(shù)是在RT-PCR技術(shù)上建立起來的一種檢測(cè)方法，它可以將待測(cè)病毒的多對(duì)特異性引物反應(yīng)加在同一反應(yīng)體系中。此方法特別適用于同時(shí)檢測(cè)復(fù)合侵染的多種病毒。楊英華等建立了可同時(shí)檢測(cè)包含TSWV在內(nèi)的多種病毒的多重RT-PCR方法，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間和試劑[26]。代歡歡等利用同樣的方法，將受侵染寄主植物中的TSWV、INSV和IYSV快速、同步、特異地檢測(cè)出來[27]。

3.3 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Reverse transcription-Loop mediated isothermal amplification，RT-LAMP）

RT-LAMP技術(shù)是在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增的。與常規(guī)RT-PCR相比，RT-LAMP技術(shù)具有特異性強(qiáng)，檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。2004年，Matsuura等利用高靈敏度的IC/RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)出TSWV[28]。

3.4 免疫捕捉RT-PCR（Immunocapture reverse

transcription PCR，IC-RT-PCR）

免疫捕捉RT-PCR技術(shù)是RT-PCR與ELISA相結(jié)合的一項(xiàng)新興檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)利用病毒?；钥贵w與病毒抗原相結(jié)合，在進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)前將目標(biāo)病毒在微管或微板等固相上固定好，經(jīng)洗脫處理—富集病毒—RT-PCR反應(yīng)，這種操作過程不需要提取核酸[17]。于翠等人提出以TSWV作為抗原，利用IC-RT-PCR技術(shù)運(yùn)用到檢測(cè)中，可檢測(cè)到TSWV[29]。

3.5 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)（Real-time fluorescent

PCR）

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)結(jié)合了RT-PCR和熒光的優(yōu)點(diǎn)，利用Taq聚合酶的5-端核酸酶活性來切割一個(gè)熒光探針，該熒光探針是不能延伸、雙標(biāo)記的、并且是在擴(kuò)增過程中與目標(biāo)序列退火的[30]。實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)具有快速靈敏，效率高，可實(shí)時(shí)檢測(cè)，并無需瓊脂糖電泳和EB染色，在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)可自動(dòng)完成，大大減少污染，易定量等優(yōu)點(diǎn)[31]。與步驟繁瑣且實(shí)驗(yàn)過程存在安全隱患的常規(guī)PCR等技術(shù)檢測(cè)番茄斑萎病毒相比較，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)不僅可以避免實(shí)驗(yàn)中存在的安全隱患，還縮短了檢測(cè)時(shí)間，并提高了靈敏度和準(zhǔn)確度。因此，目前學(xué)者們認(rèn)為實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是植物病原鑒定和病害診斷的革命性方式，它將成為植物病害診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法。利用該技術(shù)可以檢測(cè)在被侵染植物和個(gè)體薊馬上的TSWV。2000年，Boonham等也利用此方法，檢測(cè)西花薊馬上的TSWV [32]。

3.6 核酸分子雜交技術(shù)（Technique of nucleic acid hybridization）

利用病毒基因組序列配對(duì)雜交顯示信號(hào)檢測(cè)病毒的方法叫做核酸分子雜交技術(shù)。該技術(shù)可根據(jù)需要制備單特異性探針，也能制備檢測(cè)多種病毒的復(fù)合型探針。Aparicio[33]和Serena等[34]分別利用多價(jià)復(fù)合探針和一個(gè)DNA探針成功檢測(cè)出包括TSWV在內(nèi)的多種病毒。多價(jià)探針的應(yīng)用，有利于節(jié)省檢測(cè)時(shí)間和成本。

3.7 核酸序列依賴性擴(kuò)增技術(shù)（Nuleic and sequece based amplipicain，NASBA）

作為在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新擴(kuò)增技術(shù)，NASBA具有特異性好、靈敏度高、快速、高通量等優(yōu)點(diǎn)，適用于檢測(cè)實(shí)際樣品。該技術(shù)在1990年被Guatelli首次提出 [35]。2016年，吳興海等人利用NASBA技術(shù)成功檢測(cè)出TSWV，建立了可快速檢測(cè)TSWV的NASBA技術(shù)[36]。

4 問題與展望

番茄斑萎病毒能侵染多種植物產(chǎn)生病害，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)影響極大，國內(nèi)外十分重視對(duì)該病毒的檢測(cè)。番茄斑萎病毒的檢測(cè)技術(shù)也隨著科學(xué)的進(jìn)步而不斷的發(fā)展著。目前，該病毒的檢測(cè)技術(shù)在不斷地提高，經(jīng)過反復(fù)研究及改進(jìn)，使其檢測(cè)技術(shù)更簡便，檢測(cè)時(shí)間和成本也逐漸減少，而檢測(cè)的靈敏度和精確度也在不斷地提高。雖然，番茄斑萎病毒的檢測(cè)技術(shù)在不斷進(jìn)步，但是，目前番茄斑萎病毒的檢測(cè)技術(shù)仍存在一些問題：一是檢測(cè)所需藥品、儀器價(jià)格昂貴；二是檢測(cè)所需藥品毒性大，不利于研究；三是病毒本身不能離體培養(yǎng)，這就給研究帶來了很大阻力。

病毒的檢測(cè)是研究的基礎(chǔ)，要在研究及防治番茄斑萎病毒引起的植物病害獲得突破，就要從病毒檢測(cè)入手。雖然植物病毒檢測(cè)比較困難，但是隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，植物病毒檢測(cè)技術(shù)取得了很大的進(jìn)展。利用以上各種方法檢測(cè)植物病毒各有優(yōu)劣，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該結(jié)合實(shí)際，合理選擇檢測(cè)方法，才能更順利的開展實(shí)驗(yàn)。多種檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，是綜合優(yōu)化各種技術(shù)手段的最佳選擇番茄斑萎病毒的檢測(cè)在不斷進(jìn)步著，相信控制該病的發(fā)生指日可待。

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