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    利用正交設(shè)計優(yōu)化茄子的SRAP體系

    2017-07-01 08:04余扣花王益奎莫永誠甘桂云李文嘉
    關(guān)鍵詞:正交設(shè)計茄子

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    摘 要:以Solanum melongena 自交系01為試驗材料,利用正交設(shè)計L16(45)在5因素4水平上對茄子SRAP反應(yīng)體系穩(wěn)定性的Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶及模板DNA等外部條件進行了優(yōu)化試驗,并對所穩(wěn)定的體系進行驗證。得出最佳的體系的引物的濃度為0.4 mmol/L、dNTPs的濃度為0.2 mmol/L、Mg2+濃度為2.0 mmol/L、模板DNA為40 ng、Taq酶濃度為0.25U/μL。

    關(guān)鍵詞:茄子 正交設(shè)計 SRAP

    茄子(Solanum.melongena L.)作為中國重要的蔬菜作物,具有悠久的栽培史,中國擁有豐富的茄子資源[1]。隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展,SRAP標記技術(shù)在茄子種質(zhì)資源上及分子育種方面利用越來越廣泛。Sequence-Related Amplified-Poly- morphism(SRAP)標記在2001年開發(fā)出來后,該技術(shù)操作簡便、重復(fù)性好,易于分離條帶和進行檢測等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于茄子遺傳多樣性分析、構(gòu)建遺傳圖譜、雜種優(yōu)勢預(yù)測等方面[2]。為了更快捷的利用SRAP標記對茄子進行科學研究。本試驗運用正交設(shè)計的方法對SRAP反應(yīng)體系進行優(yōu)化。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗所用18份茄子及茄亞屬材料包括Solanum melongena系列:自交系01、180、273、航茄1號、138、130、越南砧木、茄崎茄、CQ、25;Solanum integrifolium系列:BH、Z5、Z7、Z2;Solanum indicum s101;Solanum sisymbriifolium s102;Solanum torvum s103;Solanum surattense Burm s104均由廣西農(nóng)科院蔬菜研究所提供。PCR擴增所使用的Taq聚合酶、dNTPs、Mgcl2購自上海生物工程有限公司,SRAP引物由金開瑞生物科技有限公司合成。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 茄子基因組DNA的提取

    基因組DNA提取采用改良CTAB法[3]。將提取的DNA用紫外分光光度計與1.5 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,OD260/OD280是否在1.8~2.0的區(qū)間,瓊脂糖電泳無拖尾和蛋白質(zhì)殘留,將DNA定量濃度為50 ng/μL,-40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 SRAP反應(yīng)體系優(yōu)化的正交設(shè)計

    采用L16(45)進行正交試驗設(shè)計,對主要影響SRAP反應(yīng)體系的Mg2+、Taq酶、模板DNA、dNTPs以及引物濃度進行5因素4水平篩選,共16個處理,方案如表1。每個處理設(shè)置3次重復(fù)。除表中變化因素外,每個反應(yīng)中添加2 μL 10 × PCR buffer,用ddH2O補足20 μL反應(yīng)體系。

    1.2.3 PCR擴增與電泳檢測

    以01基因組DNA作為模板,em3me1為引物進行SRAP反應(yīng)體系的建立與正交試驗,em3和me1的引物序列分別為5'-GACTGCGTACGAATTGAC-3'和5'-TGAGTCCAAACCGGATA-3'。PCR擴增在Applied Biosystems(美國)的4375786擴增儀上進行,選用SRAP-PCR基本的反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性45 s,35 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共5個循環(huán);94 ℃變性45 s,50 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共30個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。擴增結(jié)束后,加入2 μL10 × Loading buffer,混合均勻后取1.2 μL產(chǎn)物進行7 %聚丙烯酰胺凝膠電泳,穩(wěn)定電壓220V電泳50 min。電泳結(jié)束后用1 %的AgNO3進行銀染10 min,然后在顯影液(12 g/L NaOH、0.2 %甲醛、0.3 g/L硼砂)顯影至金黃色,相機拍照保存結(jié)果。

    1.2.4 優(yōu)化體系的驗證

    用正交試驗后優(yōu)化所得的最佳反應(yīng)體系,對18份茄亞屬單株進行DNA的SRAP擴增,重復(fù)3次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SRAP擴增條帶的直觀分析

    按照表1設(shè)計對16個處理進行了PCR擴增,見圖1,根據(jù)條帶的數(shù)量,清晰度,及背景顏色進行打分:條帶豐富,清晰度高,背景顏色淺的打9分,反之,打1分[5]。對3次重復(fù)分別進行計分,得分見表1,從結(jié)果可以看出,3次結(jié)果一致性高,重復(fù)性好。假設(shè)各因素不存在交互作用的情況下,對3次結(jié)果進行直觀分析:計算各因素同一水平對應(yīng)的K值、平均值k和極差R,結(jié)果見表2。

    極差R大小反映了各因素對正交體系的影響,R值越大,對體系影響越大;每個因素水平下的k大小反映了各水平對體系的影響情況,k值越大,反應(yīng)水平越好[6]。由表2 可知,對茄子SRAP正交反應(yīng)體系影響由大到小依次為:Mg2+>引物>DNA模板>dNTPs>Taq酶。

    通過電泳得到茄子SRAP正交反應(yīng)最佳體系為:Mg2+濃度為2.0 mmol/L,引物濃度為0.4 mmol/L,DNA模板40 ng,dNTPs的濃度為0.2 mmol/L,Taq酶濃度為0.25 U/μl。

    2.2 最佳反應(yīng)體系的驗證

    用引物em2me6(5'-GACTGCGTACGAATTT GC-3'和5'-TGAGTCCAAACCGGTAA- 3')對18份茄亞屬單株DNA用上述最佳SRAP反應(yīng)體系進行擴增,結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示不僅茄子材料擴增的條帶清晰、多態(tài)性好,對茄亞屬材料也能擴增出清晰度高、多態(tài)性好的條帶,說明該穩(wěn)定反應(yīng)體系廣泛適用于茄亞屬的SRAP擴增。

    3 討論

    由于PCR-SRAP反應(yīng)體系是多因素共同作用的反應(yīng)體系,每個因素的不同水平對SRAP反應(yīng)結(jié)果都會產(chǎn)生影響,最優(yōu)的反應(yīng)體系對試驗的后續(xù)進行至關(guān)重要,關(guān)系著整個試驗的成敗[7]。因此,優(yōu)化茄子SRAP反應(yīng)體系,更好的利用SRAP分子標記在開展茄子研究工作中奠定基礎(chǔ)。本試驗中,Mg2+濃度對反應(yīng)體系影響最大,當Mg2+濃度為3.0 mmol/L時,擴增條帶不穩(wěn)定,條帶數(shù)量增多,當Mg2+濃度為1.5 mmol/L時,擴增條帶少,條帶不清晰,此結(jié)果與鄒小云[4]研究結(jié)果一致。dNTPs濃度在各水平均為顯著差異,當在0.2 mmol/L與0.3 mmol/L水平上整體反應(yīng)評分較高這與陳書霞[8]和王芳[2]研究結(jié)果基本一致。當濃度為0.1 mmol/L時,條帶增多,且相對比較清晰,這與陳書霞研究結(jié)果有一定差異,可能是各因素相互影響的原因。引物在各水平上表現(xiàn)出顯著性差異,濃度為0.2 mmol/L時,擴增條帶變少,主要擴增出幾條主帶,當濃度為0.8 mmol/L時,擴增條帶明顯增多。DNA做為反應(yīng)的模板,濃度升高擴增出的非特異性條帶增多,一般DNA濃度適合范圍較寬,在20~60 ng,均能擴增出清晰條帶。這與何建文[9]和任羽[10]等研究結(jié)果基本一致。

    優(yōu)化茄子SRAP反應(yīng)體系,對更好的利用SRAP分子標記研究茄子遺傳多樣性及分子育種,減輕試驗工作量,提供更高效、準確的方法。本試驗在5個因素4水平共16個處理,優(yōu)化SRAP體系,得到最佳體系。

    參考文獻

    [1] 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所.中國蔬菜栽培學(第二版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2010.

    [2] 王芳,王嵐,周延清. 利用正交設(shè)計優(yōu)化大豆SRAP-PCR反應(yīng)體系[J]. 種子,2014 (11):78-81.

    [3] 管志坤. 茄子種質(zhì)資源遺傳多樣性SSR和SRAP分析[D]. 保定:河北農(nóng)業(yè)大學,2012.

    [4] 鄒小云,鄒曉芬, 陳倫林, 等. 花生SRAP-PCR反應(yīng)體系的正交設(shè)計優(yōu)化[J]. 分子植物育種,2010,8(4):822-826.

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    [10] 任羽,王得元, 張銀東, 等. 辣椒SRAP反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 分子植物育種,2004,2(5) :689-693.

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