自噬相關(guān)蛋白在腎透明細(xì)胞癌與癌旁組織中表達(dá)狀況對比

謝清靈+徐桂+彬堯凱+何永忠

【摘要】 目的：對比自噬相關(guān)蛋白在腎透明細(xì)胞癌與癌旁組織中表達(dá)狀況。方法：選取2016年3月20日-2017年3月20日本院收治的50例實(shí)施根治性腎切除術(shù)患者為研究對象，手術(shù)過程中切取患者兩部分組織，一部分為癌變組織，一部分為癌旁組織（即正常組織），且將其制作為標(biāo)本，對其進(jìn)行免疫組化染色測定、組織芯片制作、IMAGE PRO PLUS6.0軟件測量，并對自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：從免疫組化染色評分角度分析，腫瘤組織的ATG7（1.36±0.58）、LC3（2.05±0.36）、Beclin 1（0.55±0.32）水平均低于正常組織[（2.63±0.78）、（3.48±0.45）、（2.47±0.69）]，而ULK1（3.69±0.45）、P62（3.54±0.37）、P-mTOR（2.99±0.85）均高于正常組織[（2.69±0.35）、（2.31±0.45）、（2.05±0.36）]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），腫瘤組織和正常組織的ATG5值分別為（2.67±0.54）、（2.45±0.66），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；從IMAGE PRO PLUS6.0軟件測量結(jié)果角度分析，腫瘤組織的ATG7（0.029±0.010）、LC3（0.021±0.010）、Beclin 1（0.003±0.006）、P-mTOR（0.038±0.019）均低于正常組織[（0.034±0.020）、（0.043±0.015）、（0.023±0.016）、（0.031±0.013）]，而P62（0.029±0.018）、ULK1（0.032±0.014）均高于正常組織（0.020±0.009、0.025±0.010），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），腫瘤組織和正常組織的ATG5值分別為（0.034±0.020）、（0.043±0.010），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；根據(jù)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化的相關(guān)性分析結(jié)果，P-mTOR、LC3、P62的表達(dá)與ATG7的表達(dá)水平變化有關(guān)，Beclin 1的表達(dá)與其他蛋白不相關(guān)，ULK1的表達(dá)變化與ATG7和P62相關(guān)。結(jié)論：自噬的表達(dá)水平在腎透明細(xì)胞癌中表現(xiàn)為下調(diào)狀態(tài)，而其下調(diào)可受到ATG7、LC3、Beclin 1、ULK1、P62、P-mTOR等多種自噬相關(guān)蛋白協(xié)同影響。

【關(guān)鍵詞】 自噬相關(guān)蛋白； 腎透明細(xì)胞癌； 癌旁組織； 對比

Expression of Autophagy Related Proteins in Renal Clear Cell Carcinoma and Adjacent Tissues/XIE Qing-ling，XU Gui-bin，YAO Kai，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（17）：001-004

【Abstract】 Objective：To explore the expression of autophagy related protein in renal cell carcinoma and adjacent tissues.Method：From March 2016 to March 2017，50 cases with radical nephrectomy were selected as the experimental object.During the operation，part of cancerous tissue and adjacent tissues（normal tissue） of patients were cut out to make specimens which were processed by immunohistochemical staining，made to tissue microarray and measured by IMAGE PRO PLUS6.0 software.Correlation analysis of autophagy related protein expression were conducted.Result：According to the immunohistochemical staining score，ATG7（1.36±0.58），LC3（2.05±0.36），Beclin 1（0.55±0.32） of cancerous tissue were lower than ATG7（2.63±0.78），LC3（3.48±0.45），Beclin 1（2.47±0.69） of adjacent tissues，ULK1 （3.69±0.45），P62（3.54±0.37），P-mTOR（2.99±0.85） of cancerous tissue were higher than ULK1（2.69±0.35），P62（2.31±0.45），P-mTOR（2.05±0.36） of adjacent tissues，the differences had statistical significance（P<0.05），ATG5 of tumor tissues and normal tissues were （2.67±0.54），（2.45±0.66），the difference had no statistical significance（P>0.05）.By the measurement results of IMAGE PRO PLUS6.0 software，ATG7（0.029±0.010），LC3（0.021±0.010），Beclin 1（0.003±0.006），P-mTOR（0.038±0.019） of cancerous tissue were lower than ATG7（0.034±0.020），LC3（0.043±0.015），Beclin 1（0.023±0.016），P-mTOR（0.031±0.013） of adjacent tissues，and P62（0.029±0.018），ULK1（0.032±0.014） of cancerous tissue were higher than P62（0.020±0.009），ULK1（0.025±0.010） of adjacent tissues，the differences had statistical significance（P<0.05），ATG5 of tumor tissue and normal tissue were （0.034±0.020），（0.043±0.010），the difference had no statistical significance（P>0.05）.From the perspective of correlation analysis，the expression of P-mTOR，LC3，P62 was related to the expression level of ATG7.The expression of Beclin 1 was not related to other proteins.The expression of ULK1 was correlated with ATG7 and P62.Conclusion：The expression level of autophagy is down regulated in renal clear cell carcinoma，and its down-regulation may be affected by ATG7，LC3，Beclin 1，ULK1，P62，P-mTOR and other autophagy related proteins.

【Key words】 Autophagy related protein； Renal clear cell carcinoma； Para-carcinoma tissue； Contrast

First-authors address：The Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510700，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.17.001

腎細(xì)胞癌屬于惡性腫瘤之一，在泌尿科較為常見。自噬主要是指細(xì)胞通過雙層膜或單層膜包裹等待降解物形成自噬體，隨后形成自噬溶酶體，并進(jìn)行多種酶的降解和消化，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境和實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)成分的更新，其主要標(biāo)志物為微管相關(guān)蛋白1輕鏈3，常參與自噬體的形成[1]。近年來，腫瘤和自噬的關(guān)系廣泛受到專家重視，且有研究表明，自噬在腫瘤形成中起到重要作用，且部分學(xué)者認(rèn)為BECLIML在自噬中屬于抑癌基因[2]。而本文旨在探索自噬相關(guān)蛋白在腎透明細(xì)胞癌與癌旁組織中表達(dá)的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次的探索對象為50例實(shí)施根治性腎切除術(shù)患者，所有患者均在2016年3月

20日-2017年3月20日期間收治。在患者手術(shù)中選取一塊正常腎組織和一塊腎癌組織，并將其制作成標(biāo)本，進(jìn)行免疫組化染色。其中癌旁組織設(shè)定為正常對照，所有患者年齡24～58歲，平均（38.47±3.47）歲，男35例，女15例；TNM分期：Ⅳ期5例，Ⅲ期16例，Ⅱ期14例，I期15例；FUHRMAN 分級：低分化18例，中分化20例，高分化12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均簽署書面同意書；（2）癌旁組織距癌組織邊緣>2 cm；（3）術(shù)前未進(jìn)行過免疫、化療、放療；（4）經(jīng)病理檢查，患者均確診為腎透明細(xì)胞癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）心功能不全患者；（2）依從性較差患者；（3）手術(shù)禁忌證患者；（4）先天性語言功能障礙或聽力功能障礙患者；（5）危重癥患者；（6）資料不全患者。

1.2 方法 （1）生化試劑：由美國ABCAM公司提供一抗，包括ATG7（ab52472）、ATG5（ab64227）、ULK1（ab65056）、Beclin 1（ab51031）、LC3（ab48394）、P62（ab56416）、P-mTOR（ab51044）。其中P62屬于自噬特異性底物，P-mTOR的活性負(fù)性調(diào)節(jié)自噬，以上兩類蛋白的自噬負(fù)和表達(dá)相關(guān)，而ATG7、ATG5、ULK1、Beclin 1、LC3屬于自噬通路蛋白，其表達(dá)的高低能夠反映出自噬含量。由北京中杉金橋公司提供二抗、DAB、檢測試劑盒PV6000，且實(shí)施二步法檢測。（2）免疫組化染色和組織芯片：采用QUICK RAY組織芯片制備儀（由韓國UNITMA公司提供）制作組織芯片。首先使用梯度乙醇脫蠟水化后，在雙氧水（3%）中孵育30 min，且封閉內(nèi)源性過氧化物酶。二抗室溫孵育30 min；一抗在溫度為4 ℃環(huán)境下過夜，蘇木精復(fù)染，DAB染色。

1.3 觀察指標(biāo)與評定標(biāo)準(zhǔn) 使用兩種方法對結(jié)果進(jìn)行判定：（1）使用IMAGE PRO PLUS6.0軟件對組織染色程度進(jìn)行測量，同時再進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；（2）由醫(yī)生對標(biāo)本進(jìn)行染色結(jié)果判定，且根據(jù)標(biāo)本染色程度，進(jìn)行0～4分的標(biāo)準(zhǔn)打分，判定依據(jù)為顏色深淺。對比癌組織和正常組織的免疫組化染色評分以及IMAGE PRO PLUS6.0軟件測量結(jié)果。分析自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化的相關(guān)性分析P值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)和相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常組織和癌組織免疫組化染色評分比較 腫瘤組織的ATG7、LC3、Beclin 1水平均低于正常組織，ULK1、P62、P-mTOR均高于正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而ATG5含量對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 正常組織和癌組織免疫組化染色I(xiàn)MAGE PRO PLUS6.0軟件測量結(jié)果比較 腫瘤組織和正常組織ATG7、LC3、Beclin 1、ULK1、P62、P-mTOR含量對比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而ATG5含量對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.3 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化相關(guān)性分析 Beclin 1

的表達(dá)與其他蛋白不相關(guān)，ULK1的表達(dá)變化與ATG7和P62相關(guān)，P-mTOR、LC3、P62的表達(dá)與ATG7的表達(dá)水平變化有關(guān)。

3 討論

在腫瘤進(jìn)展、發(fā)生過程中，為了維護(hù)細(xì)胞增殖，需大量的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。而自噬便屬于腫瘤細(xì)胞代謝應(yīng)激和抵抗缺氧的原因，在腫瘤缺乏營養(yǎng)素時，通過增強(qiáng)自噬，無法觀察到較高的血管化區(qū)域[3]，反而言之，自噬的激活能夠產(chǎn)生腫瘤生長必須的底物和能量，其可利于腫瘤細(xì)胞的繁殖、生存。同時腫瘤的缺氧化狀態(tài)，可導(dǎo)致預(yù)后較差，且促使血管的凋亡，形成腫瘤組織[4]。腫瘤的中心缺氧，還可促進(jìn)侵襲細(xì)胞存活，誘導(dǎo)自噬。常規(guī)情況下，在BH3區(qū)域中，BCL-2和BCL-XL形成復(fù)合物，當(dāng)機(jī)體處于缺氧狀態(tài)，可促使Beclin 1轉(zhuǎn)化為BNIP3，從而釋放Beclin 1誘導(dǎo)自噬激活，克服缺氧[5]。

自噬能夠維持基因穩(wěn)定性，給予細(xì)胞提供額外的ATP，及時清除受損細(xì)胞和回收失活蛋白[6]。當(dāng)機(jī)體代謝壓力達(dá)到一定程度時，可過度激活自噬，從而促使細(xì)胞凋亡、死亡，此點(diǎn)能夠證實(shí)，對于腫瘤細(xì)胞而言，自噬具有較為重要的意義，大部分腫瘤細(xì)胞均存在凋亡障礙，由此說明，下調(diào)的自噬能夠營造良好的腫瘤生長環(huán)境，且本次研究中，也證實(shí)了自噬特異性底物P62的積累，能夠促進(jìn)腫瘤的生長[7]。同時本次研究還可發(fā)現(xiàn)，腎細(xì)胞中較低的自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)和較少的自噬數(shù)量，能夠表明自噬在腎透明細(xì)胞癌中的發(fā)展、發(fā)生意義，提示自噬水平在腫瘤組織中下調(diào)[8]。

目前臨床上，對于自噬的調(diào)控機(jī)制尚未闡述清楚，部分學(xué)者認(rèn)為調(diào)節(jié)自噬的閥門為mTOP復(fù)合物活性[9]。Beclin 1被臨床學(xué)者認(rèn)為其是自噬體起始的階段成分之一，屬于一種腫瘤抑制因子，有研究表明，自噬體的形成是由于Beclin 1的嚴(yán)重缺乏。本次研究中發(fā)現(xiàn)，Beclin 1和mTOP在腫瘤組織表達(dá)中均存在改變現(xiàn)象，其提示著自噬水平下調(diào)[10]。而本次研究也發(fā)現(xiàn)ATG7和LC3也發(fā)生一定意義的改變，其主要提示著機(jī)體存在潛在的調(diào)控位點(diǎn)[11]。無論是遺傳性腎癌還是散發(fā)性腎癌，VHL（VON HIPPEL-LINDAU）基因突變起到較為重要作用，VHL基因突變是導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子的聚集，而mTOR通路上調(diào)的主要原因?yàn)槿毖跽T導(dǎo)因子聚集，因此腎癌自噬調(diào)低的主要原因?yàn)閂HL基因突變[12]。

自噬在腫瘤治療中存在較多爭議，有研究報道，自噬通過基因敲除和藥物抑制，能夠改善化療藥物耐受性，助于疾病的恢復(fù)，在機(jī)體內(nèi)存在長期影響性，但此項(xiàng)結(jié)果有待進(jìn)一步考察[13]。近年來，臨床發(fā)現(xiàn)多種mTOR抑制劑已開始廣泛應(yīng)用于臨床，且常用于治療晚期腎癌患者，其主要療效為通過調(diào)節(jié)自噬來達(dá)到治療效果[14]。通過分析多項(xiàng)研究報道，發(fā)現(xiàn)目前已有多項(xiàng)化合物已被證實(shí)，能夠促使腫瘤自噬性細(xì)胞的凋亡，包括一種特異性對VHL缺乏腎腫瘤的小分子化合物，其促使自噬性細(xì)胞死亡稱為潛在治療方案，但具體療效，還有待證實(shí)[15]。

在腎癌患者中，自噬相關(guān)基因的表達(dá)與癌癥分期、分級有關(guān)，主要體現(xiàn)為LC3含量的表達(dá)，有研究報道，在卵巢癌患者中，LC3的表達(dá)與病理分級和病理類型物統(tǒng)計學(xué)意義，其證明在不同腫瘤類型中，自噬的表達(dá)存在差異性的[16]。而本次研究中，LC3蛋白表達(dá)量與分期、分級存在差異性，從分期角度分析，轉(zhuǎn)移性腎癌患者和進(jìn)展性腎癌患者比局限性腎癌患者的LC3蛋白更低，其證實(shí)了自噬活體的降低與腎透明細(xì)胞癌的侵襲、發(fā)生、發(fā)展起到一定作用性，總而言之，自噬的抑制能夠作為進(jìn)展期腎癌的一個標(biāo)志物[17-18]。

本次實(shí)驗(yàn)主要結(jié)合了免疫組織化學(xué)技術(shù)和組織芯片，從而證實(shí)了自噬相關(guān)蛋白和腫瘤組織變化有關(guān)，其中ATG7、LC3、Beclin 1呈現(xiàn)為下調(diào)趨勢[19]，P62、P-mTOR在腫瘤組織中呈現(xiàn)為上調(diào)，結(jié)合電鏡，可了解到腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量少于正常組織[20]，而此種下調(diào)與多種自噬相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)，結(jié)果提示自噬在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)水平下調(diào)，同時為潛在、新型的治療方式提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[21]。

總而言之，Beclin 1、ULK1、ATG7、P-mTOR、LC3、P62是影響自噬相關(guān)蛋白下調(diào)的主要原因，而自噬蛋白在腎透明細(xì)胞癌中具有重要利用價值，且主要呈現(xiàn)為下調(diào)狀。

參考文獻(xiàn)

[1]朱少群，鐘美花.磁共振成像技術(shù)在18例臂叢神經(jīng)損傷診斷中的應(yīng)用[J].中國民族民間醫(yī)藥，2016，25（4）：115，117.

[2]唐怡.ART1調(diào)節(jié)饑餓誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞自噬及其對癌細(xì)胞增殖凋亡影響的研究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2015.

[3]宋孟锜，薛寅凱，孫運(yùn)秀，等.自噬相關(guān)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-β在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2014，31（5）：1108-1110.

[4]吳楠，閔鶴鳴，屈惠瑩，等.自噬基因pULK、PI3KC3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究[J].天津醫(yī)藥，2015，56（6）：635-638，706.

[5]趙亞通，劉超，龐志剛，等.叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞家族1及自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ在肝癌組織的表達(dá)及意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2016，33（2）：492-494.

[6]沈蕓，向陽，肖長紀(jì)，等.轉(zhuǎn)錄因子c-Jun對甲氨蝶呤耐藥絨毛膜癌細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白LC3的調(diào)節(jié)作用[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2014，8（7）：531-535.

[7]郭凱，黃波，王曉東，等.自噬相關(guān)蛋白在肺鱗癌和腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究[J].天津醫(yī)藥，2014，74（6）：536-539.

[8]邵樂寧，楊曉東，邢春根，等.腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞自噬狀態(tài)對人大腸癌細(xì)胞凋亡的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2014，31（7）：1504-1507.

[9]陳佳，王琪，張瑋，等.下調(diào)MTRR基因表達(dá)對順鉑耐藥的卵巢上皮性癌細(xì)胞自噬和凋亡的影響及機(jī)制研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2016，51（4）：285-292.

[10]劉永青.自噬在天然小分子化合物促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞死亡中的作用及其機(jī)制研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2015.

[11]許赤，蔡惠寧，李翠平，等.RNA干擾技術(shù)下調(diào)營養(yǎng)缺乏自噬因子1表達(dá)對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響[J].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2016，6（2）：80-85.

[12]斯慶圖娜拉.聯(lián)合自噬抑制劑增加PI3K/mTOR抑制劑NVP-BEZ235誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2015，85（10）：1632-1635.

[13]薛妮娜.新型HSP90抑制劑篩選及抗胰腺癌增殖作用和分子機(jī)制研究；SHP90抑制劑誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞IGF-1Rβ自噬性降解的分子機(jī)制研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2015.

[14]宋建，梁素美，高俊，等.自噬基因LC3B在肺鱗癌中的表達(dá)意義及與窖蛋白-1的關(guān)系[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2013，78（22）：10 029-10 034.

[15]馬泰.細(xì)胞自噬在肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性死亡中的作用及對藥物敏感性的影響[D].合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2013.

[16]馮仰偉.自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3和增殖細(xì)胞核抗原Ki-67在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)及意義[D].泰山：泰山醫(yī)學(xué)院，2015.

[17]張澤兵，全海英，張桐菲，等.自噬在Tca83細(xì)胞中的作用及自噬相關(guān)基因的表達(dá)[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012，47（z1）：233-238.

[18]朱興春，劉青松，楊慧敏，等.末端結(jié)合蛋白1（EB1）在宮頸組織中的表達(dá)及其對自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響[J].復(fù)旦學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2014，41（5）：641-646.

[19]范大為，劉凱，袁成剛，等.Beclin-1與EZH2在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義[J].新醫(yī)學(xué)，2016，47（5）：329-334.

[20]倪曉辰，趙志紅，馬永良，等.檜木醇誘導(dǎo)人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究[J].中國腫瘤臨床，2015，45（1）：43-46.

[21]張琦，Shuhui Si，Sue Schoen，等.自噬對Folliculin基因缺陷的腎癌細(xì)胞放療敏感性的影響[J].泌尿外科雜志（電子版），2015，52（3）：16-22，54.

（收稿日期：2017-04-11） （本文編輯：鄧朝陽）