途徑優(yōu)化強(qiáng)化枯草芽胞桿菌合成肝素前體

張琳培，王浩，周正雄，堵國成，陳堅(jiān)，康振

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途徑優(yōu)化強(qiáng)化枯草芽胞桿菌合成肝素前體

張琳培1,2，王浩1,2，周正雄1,2，堵國成1,2，陳堅(jiān)1,2，康振1,2

1 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122 2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122

張琳培, 王浩, 周正雄, 等. 途徑優(yōu)化強(qiáng)化枯草芽胞桿菌合成肝素前體. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(6): 936–945.Zhang LP, Wang H, Zhou ZX, et al. Optimization of heparosan synthetic pathway in Bacillus subtilis 168. Chin J Biotech, 2017, 33(6): 936–945.

肝素前體是化學(xué)酶法合成肝素的起點(diǎn)，肝素前體的微生物高效合成具有重要意義。在已構(gòu)建的產(chǎn)肝素前體的枯草芽胞桿菌((1.71±0.08) g/L) 中，分析了UDP-葡萄糖醛酸 (UDP-GlcUA) 途徑中關(guān)鍵酶基因 (、、) 以及UDP-乙酰氨基葡糖 (UDP-GlcNAc) 途徑中關(guān)鍵酶基因 (、、) 的過量表達(dá)對(duì)肝素前體產(chǎn)量及其分子量的影響。在此基礎(chǔ)上，通過共表達(dá)、、、和基因，搖瓶中肝素前體產(chǎn)量提高至(2.89±0.11) g/L，分子量為(75.90±1.18) kDa。通過在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，肝素前體的產(chǎn)量最終積累到(7.25±0.36) g/L，分子量為(46.66±2.71) kDa，為工業(yè)化生產(chǎn)肝素奠定了基礎(chǔ)。

肝素前體，枯草芽胞桿菌，途徑優(yōu)化，產(chǎn)量，分子量

肝素 (Heparin，HP) 作為一種高度硫酸化的糖胺聚糖[1]，在胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、病毒或細(xì)菌感染及細(xì)胞分化等方面發(fā)揮重要作用[2]，臨床上也可作為抗凝與抗血栓藥物[3]。肝素主要通過動(dòng)物提取法獲得[2,4]，然而該方法存在種間疾病感染[5]和過硫酸軟骨素污染[6-7]等風(fēng)險(xiǎn)，且提取過程往往造成環(huán)境污染[3]。另外，通過化學(xué)法也可從頭合成低分子量的肝素[8]，但因原料昂貴、步驟繁多和產(chǎn)量極低等缺點(diǎn)難以進(jìn)行大規(guī)模制備[9-10]。近年來，以肝素前體為合成起點(diǎn)進(jìn)行硫酸化的化學(xué)酶法逐漸受到研究者的重視[1,11]，因此，在微生物中實(shí)現(xiàn)肝素前體的高產(chǎn)成為了重要環(huán)節(jié)。

肝素前體 (Heparosan) 由葡萄糖醛酸 (GlcUA) 和N-乙酰氨基葡糖 (GlcNAc) 通過β-1,4和α-1,4糖苷鍵交替連接形成[12-13]，在大腸桿菌K5和多殺巴斯德菌中天然存在[14-15]。此外，Zhang等在.BL21 (DE3) 中實(shí)現(xiàn)了肝素前體的高效異源合成[16]，而我們團(tuán)隊(duì)通過共表達(dá)來自K5的與合酶基因，首次在食品級(jí)微生物枯草芽胞桿菌中獲得了肝素前體[5]，有效避免了致病性菌株生產(chǎn)肝素前體的風(fēng)險(xiǎn)。

目前，一些團(tuán)隊(duì)致力于代謝工程改造提高肝素前體產(chǎn)量?；诓溉閯?dòng)物糖胺聚糖的生物合成，認(rèn)為UDP-葡萄糖脫氫酶催化的UDP-Glc到UDP-GlcUA的反應(yīng)為限速步驟[17]，Zhang等發(fā)現(xiàn)過表達(dá)該酶使產(chǎn)量和分子量均提高[16]，而Roman團(tuán)隊(duì)卻在.K5中得到產(chǎn)量降低、分子量不變的不同結(jié)論[18]。Lidholt等還發(fā)現(xiàn)只增加UDP-GlcNAc使肝素前體合成速率降低、分子量減小，但當(dāng)UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc處于平衡時(shí)，合成速率與分子量再次增大[19]。雖然肝素前體的生物合成與分子量調(diào)控機(jī)制尚不清楚，但兩前體物同合酶的結(jié)合具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，因此它們的濃度與比例將成為關(guān)鍵因素[17]。

為探究合成途徑中除UDP-葡萄糖脫氫酶以外的其他關(guān)鍵酶及代謝流量對(duì)產(chǎn)物合成與分子量的影響，并獲得肝素前體的高產(chǎn)菌株，本研究在之前工作的基礎(chǔ)上[5]進(jìn)行代謝改造，強(qiáng)化UDP-GlcUA途經(jīng)和UDP-GlcNAc途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，并進(jìn)一步通過3 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，使肝素前體積累量最終提高至7.25 g/L，分子量為46.66 kDa。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

所用菌株和質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存，詳見表1。

1.1.2 酶、引物、DNA marker及相關(guān)試劑盒

DNA聚合酶購自寶賽生物 (杭州) 有限公司；DNA marker購自TaKaRa (大連)；PCR引物 (表2) 由生工生物工程 (上海) 有限公司合成；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自生工生物工程 (上海) 有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 篩選培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基

向LB培養(yǎng)基 (蛋白胨 10 g/L，氯化鈉 10 g/L，酵母粉 5 g/L) 中添加無水硫酸鎂溶液和木糖溶液，使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為1.5 g/L和20 g/L，自然pH。制備固體平板時(shí)添加瓊脂20 g/L。

1.2.2 改良發(fā)酵培養(yǎng)基

蔗糖 50 g/L (搖瓶培養(yǎng)) 或15 g/L (3 L罐培養(yǎng))，酵母粉 20 g/L，蛋白胨 2 g/L，硫酸鎂 1.5 g/L，50 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH為7.0[5]。

表1 本文所用的質(zhì)粒與菌株

表2 本文所用的引物

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

挑取生長良好的單菌落接種于含25 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，根據(jù)需要添加50mg/mL卡那霉素，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h。

1.3.2 搖瓶培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)液按10%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL (搖瓶容量為500 mL) 改良發(fā)酵培養(yǎng)基中，根據(jù)需要添加50mg/mL卡那霉素，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h。在接種后第2 h添加木糖溶液使其終濃度為20 g/L進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.3.3 3 L罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)

將重組菌單菌落接種至150 mL (搖瓶容量為500 mL) 種子培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h，將種子培養(yǎng)液按10%的接種量轉(zhuǎn)接至含1.35 L改良發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中，并添加50mg/mL卡那霉素。在接種后第2 h添加木糖溶液使終濃度為20 g/L進(jìn)行誘導(dǎo)。使用5 mol/L NaOH溶液控制pH為7.0，溫度為37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速在接種后8 h內(nèi)為600 r/min，8 h后為800 r/min，通氣量為2.0 vvm。補(bǔ)料料液為800 g/L的蔗糖母液，當(dāng)發(fā)酵液中蔗糖濃度低于5 g/L時(shí)開始補(bǔ)料，維持殘?zhí)菨舛仍??5 g/L。在8?12 h期間流加速度分別為7.5、7.5、15、10 g/(L?h)，此后保持5 g/(L?h) 的流速至發(fā)酵結(jié)束。

1.4 方法

1.4.1 枯草芽胞桿菌的轉(zhuǎn)化及重組子的鑒定

枯草芽胞桿菌的轉(zhuǎn)化采用電轉(zhuǎn)方式，轉(zhuǎn)化后涂布于含50mg/mL卡那霉素的篩選平板，挑選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

引物見表2。質(zhì)粒pP43-D、pP43-DB、pP43-DBA、pP43-U、pP43-UM、pP43-UMS、pP43-DU和pP43-DU-PBMS分別用引物P43-F/ tuaD-R、tuaD-F/gtaB-R、gtaB-F/pgcA-R、P43-F/ glmU-R、glmU-F/glmM-R、glmM-F/glmS-R、tuaD-F/glmU-R和glmU-F/gtaB-R進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.2 菌體生長密度測(cè)定

取1 mL發(fā)酵液在12 000 r/min下離心2 min。用蒸餾水重懸菌體，以蒸餾水調(diào)零，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長為600 nm處的吸光值，根據(jù)吸光度有效值范圍 (0.25?0.80) 適當(dāng)稀釋菌液。

1.4.3 肝素前體的純化與定量檢測(cè)

取樣的發(fā)酵液在10 000 r/min下離心5 min分離上清液和菌體。向上清液中加入3倍體積的無水乙醇，混勻后于4 ℃放置1 h。此后在 5 000 r/min下離心10 min，收集沉淀。向沉淀中加入等體積的蒸餾水，于4 ℃放置使沉淀重新溶解，該純化步驟重復(fù)3次，獲得肝素前體的水溶液。采用硫酸咔唑比色法定量測(cè)定肝素前體，具體參見文獻(xiàn)[20]。利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)波長為530 nm處的吸光值，根據(jù)吸光度有效值范圍 (0.25?0.80) 適當(dāng)稀釋樣品溶液。

1.4.4 肝素前體分子量的測(cè)定

肝素前體的質(zhì)量平均分子量 (w)、數(shù)量平均分子量 (n) 和多分散性系數(shù)p(p=w/n) 采用高效排阻色譜聯(lián)合多角度激光散射法 (HPSEC-MALLS) 測(cè)定。分析條件：流動(dòng)相為0.1 mol/L的硝酸鈉溶液，采用凝膠色譜柱Ultrahydrogel Linear (300 mm×7.8 mm；Waters Co., Milford, MA, USA)，流速0.5 mL/min，柱溫50 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)器為多角度激光散射檢測(cè)器 (Wyatt Technology DAWN HELEOS，Santa Barbara，CA，USA) 和示差折光檢測(cè)器 (Optilab Rex，Wyatt Technology Co.,USA)。

1.4.5 蔗糖的定量檢測(cè)

取1 mL發(fā)酵液在4 ℃、12 000 r/min下離心2 min，保留上清液，經(jīng)0.22mm過濾器過濾后，采用HPLC定量檢測(cè)蔗糖[5]。分析條件：流動(dòng)相為乙腈水溶液 (70∶30，/)，色譜柱為NH2柱 (4 mm×250 mm)，流速1.0 mL/min，柱溫32 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器 (Shimadzu RID-10 A)。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)肝素前體途徑優(yōu)化重組菌的構(gòu)建

圖1A中，從葡萄糖到兩種前體物UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc的代謝途經(jīng)基因均為.168內(nèi)源性基因[21]，但.168缺少以兩種前體物合成肝素前體所需的糖基轉(zhuǎn)移酶基因和[22-23]，我們之前已通過基因組整合共表達(dá)和，實(shí)現(xiàn)了枯草芽胞桿菌生產(chǎn)肝素前體[5]。

但是，UDP-GlcUA途徑中的6-磷酸葡萄糖 (Glc-6-P) 和UDP-GlcNAc途徑中的6-磷酸果糖 (Fru-6-P) 還分別參與磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑[21]，消耗部分原料。同時(shí)兩前體物UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc既要合成目標(biāo)產(chǎn)物，也要參與合成細(xì)胞壁，供給菌體生長的需要[17]，因而制約了肝素前體的積累。為進(jìn)一步提高肝素前體產(chǎn)量，過量表達(dá)合成途徑的關(guān)鍵酶基因，強(qiáng)化UDP-GlcUA途徑和UDP-GlcNAc途徑代謝流，使前體物充足。

圖1 肝素前體合成途徑優(yōu)化

將曾構(gòu)建的8個(gè)過表達(dá)途徑基因的重組質(zhì)粒 (圖1B，表1) 轉(zhuǎn)化產(chǎn)肝素前體的.E168H[5]，經(jīng)PCR驗(yàn)證，獲得了相應(yīng)的8株重組菌 (表1)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 PCR驗(yàn)證重組枯草芽胞桿菌

2.2 優(yōu)化肝素前體合成途徑基因?qū)Ξa(chǎn)量的影響

將8株重組菌與對(duì)照菌.E168H進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，第48 h產(chǎn)量結(jié)果如圖3所示。

從圖3A看出，與對(duì)照株相比，單獨(dú)上調(diào)基因的表達(dá)顯著增加了肝素前體的產(chǎn)量，達(dá)到 (2.65±0.13) g/L，證明了UDP-葡萄糖脫氫酶 (編碼) 催化的UDP-葡萄糖 (UDP-Glc) 到UDP-GlcUA的反應(yīng)為肝素前體合成的一個(gè)重要限速步驟[16-17]。進(jìn)一步過表達(dá)和基因上調(diào)UDP-Glc和UDP-GlcUA的供應(yīng)，產(chǎn)量略有降低，為 (2.32±0.05) g/L，這一結(jié)果可能是由于和基因的共同強(qiáng)化引起Glc-6-P儲(chǔ)量減少，繼而導(dǎo)致UDP-GlcNAc途徑代謝流向UDP-GlcUA途徑轉(zhuǎn)化，使KfiA轉(zhuǎn)運(yùn)酶獲得UDP-GlcNAc成為限速因素，降低了肝素前體合成的起始速率[18]。同時(shí)，兩前體物存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，UDP-GlcUA過量時(shí)作為競(jìng)爭(zhēng)抑制劑占據(jù)UDP-GlcNAc與KfiA酶的結(jié)合位點(diǎn)，使產(chǎn)量降低[17]。而進(jìn)一步強(qiáng)化UDP-GlcUA的上游合成途徑，同時(shí)過表達(dá)、和基因，產(chǎn)量((2.37±0.02) g/L) 較過表達(dá)和時(shí)沒有明顯變化，即對(duì)肝素前體產(chǎn)量無正向作用，該現(xiàn)象與另一種糖胺聚糖——透明質(zhì)酸的合成調(diào)控一致[24]，表明Glc-6-P為磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)受到嚴(yán)格調(diào)控。

圖3 產(chǎn)肝素前體枯草芽胞桿菌的搖瓶培養(yǎng)

對(duì)于合成另一前體物的UDP-GlcNAc途徑，單獨(dú)上調(diào)基因的表達(dá)，肝素前體產(chǎn)量達(dá)到(2.06±0.10) g/L，說明UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶 (編碼的雙功能酶) 催化的1-磷酸氨基葡糖 (GlcN-1-P) 到UDP-GlcNAc的反應(yīng)為肝素前體合成的另一限速步驟。然而，過表達(dá)和時(shí)，產(chǎn)量無明顯變化((1.98±0.04) g/L)，說明6-磷酸氨基葡糖 (GlcN-6-P) 的合成受嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步強(qiáng)化基因后，產(chǎn)量恢復(fù)到 (2.30±0.22) g/L，這一結(jié)果證明酰胺轉(zhuǎn)移酶 (編碼) 是肝素前體合成的又一重要途徑酶。

另外，為了研究同時(shí)提高兩條代謝通路流量對(duì)肝素前體產(chǎn)量的影響，過量表達(dá)了兩個(gè)限速酶基因和，產(chǎn)量為 (2.52±0.06) g/L。而同時(shí)上調(diào)所有基因、、、和的表達(dá)，促使肝素前體的積累量達(dá)到最大，為 (2.89±0.11) g/L，提高了69.01%，說明兩前體物UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc的比例平衡對(duì)加快肝素前體的聚合速度非常有利[17,19]。并且，從圖3B中看出，與對(duì)照株相比，重組質(zhì)粒pP43-DU-PBMS的轉(zhuǎn)入并沒有成為菌體生長的負(fù)擔(dān)，菌體量反而稍有提高，不同于細(xì)胞生長和肝素前體合成具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的說法[16-17]，這可能是由于增大途徑代謝流獲得了充足的UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc，在滿足細(xì)胞壁形成需要后更多地用于目標(biāo)產(chǎn)物的合成。

2.3 優(yōu)化肝素前體合成途徑基因?qū)Ψ肿恿康挠绊?/p>

已有報(bào)道一些因素如代謝流分布、前體物濃度及比例等對(duì)肝素前體的分子量有影響[17-19]，因此對(duì)上述8株重組菌和對(duì)照菌所產(chǎn)肝素前體的分子量進(jìn)行了MALLS-SEC分析，結(jié)果如表3所示。

過表達(dá)和共表達(dá)-均使w增大，分別為 (67.70±1.29) kDa和 (71.40±1.82) kDa，說明UDP-GlcUA途徑代謝流的增加對(duì)延長肝素前體多糖鏈有利，這不同于在野生菌株.K5中提高UDP-葡萄糖脫氫酶的活性，而肝 素前體分子量未受影響[18]，可能是.與.對(duì)UDP-GlcUA的合成具有不同的調(diào)控機(jī)制。進(jìn)一步過表達(dá)基因?qū)е铝藈的降低((53.65±2.06) kDa)，反映出該基因?qū)μ擎溠由煊胸?fù)面影響。

過表達(dá)和組合過表達(dá)、均能明顯促進(jìn)w的提高((61.12±0.98)?(73.83±1.65) kDa)，表明UDP- GlcNAc的濃度與肝素前體分子量存在正相關(guān)性，這一現(xiàn)象雖與Lidholt得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相反[19]，但與透明質(zhì)酸的分子量調(diào)控相似[24-26]。

此外，共表達(dá)和基因，使w提高至 (58.79±0.80) kDa，而組合共表達(dá)時(shí)，w達(dá)到最大，為 (75.90±1.18) kDa，證明前體物UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc的量和比例是除肝素前體合酶固有性質(zhì)和外部環(huán)境以外的影響肝素前體分子量的一大重要因素[17,19]。另外還發(fā)現(xiàn)，8株重組菌合成的肝素前體，其多分散性系數(shù) (p，表3) 在1.09?1.42之間，尤其是當(dāng)前體物平衡時(shí)，產(chǎn)物分子量分布范圍更集中 (1.09?1.16)，說明可通過途徑優(yōu)化實(shí)現(xiàn)更統(tǒng)一分子量的肝素前體的生產(chǎn)。

2.4 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)的研究

根據(jù)搖瓶發(fā)酵結(jié)果，將重組菌.E168H/pP43-DU-PBMS在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大培養(yǎng)。為保證碳源的充足，實(shí)現(xiàn)菌體高密度發(fā)酵，當(dāng)殘?zhí)呛康陀? g/L時(shí)，流加800 g/L的蔗糖母液，維持殘?zhí)菨舛仍??5 g/L之間。結(jié)果如圖4所示，可以看出大量的肝素前體的積累主要集中于菌體生長的穩(wěn)定期，即細(xì)胞生長與產(chǎn)物生成非偶聯(lián)。在發(fā)酵64 h時(shí)，肝素前體的產(chǎn)量達(dá)到最高，為 (7.25±0.36) g/L，是搖瓶水平的2.51倍，此后產(chǎn)量保持穩(wěn)定，相比于之前研究中過表達(dá)時(shí)重組菌在3 L罐上發(fā)酵72 h時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高((5.82±0.17) g/L)[5]，本菌株表現(xiàn)出了更高的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度。產(chǎn)物的w為 (46.66±2.71) kDa (表3)，較搖瓶培養(yǎng)時(shí)降低，可能因?yàn)閿嚢铇獧C(jī)械剪切力的作用使糖鏈切斷，但p值1.28卻顯示3 L罐發(fā)酵仍較好地保持了相對(duì)集中的分子量分布。

表3 本研究中肝素前體的分子量

aThe weight-average molecular mass (w);bThe number-average molecular mass (w);cPolydispersity index (p).

圖4 重組菌B. subtilis E168H/pP43-DU-PBMS在3 L罐中的補(bǔ)料分批培養(yǎng)

3 結(jié)論

肝素前體作為一種化學(xué)酶法合成肝素的骨架，其產(chǎn)量的提高具有重要意義。在產(chǎn)肝素前體的枯草芽胞桿菌中進(jìn)行合成途徑優(yōu)化，通過組合過表達(dá)UDP-GlcUA途徑和UDP-GlcNAc途徑中的關(guān)鍵酶基因，構(gòu)建了8株重組菌。其中，共表達(dá)、、、和基因時(shí)，肝素前體的產(chǎn)量最高，搖瓶水平為 2.89 g/L，且分子量為75.90 kDa，說明肝素前體的生物合成與分子量調(diào)控依賴于兩前體物的充足與比例平衡。進(jìn)一步通過3 L罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)，肝素前體最終積累至7.25 g/L，分子量為46.66 kDa。本研究為高產(chǎn)肝素前體提供了新策略，并可將此策略應(yīng)用于強(qiáng)化其他多糖如透明質(zhì)酸、軟骨素等的生物合成。

[1] Laremore TN, Zhang FM, Dordick JS, et al. Recent progress and applications inglycosaminoglycan and heparin research. Curr Opin Chem Biol, 2009, 13(5/6): 633–640.

[2] Bhaskar U, Sterner E, Hickey AM, et al. Engineering of routes to heparin and related polysaccharides. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93(1): 1–16.

[3] Liu YF, Liu L, Chen JH, et al. Effects of carbon sources and feeding strategies on heparosan production byK5. Bioprocess Biosyst Eng, 2012, 35(7): 1209–1218.

[4] Liu HY, Zhang ZQ, Linhardt RJ. Lessons learned from the contamination of heparin. Nat Prod Rep, 2009, 26(3): 313–321.

[5] Jin P, Zhang LP, Yuan PH, et al. Efficient biosynthesis of polysaccharides chondroitin and heparosan by metabolically engineered. Carbohydr Polym, 2016, 140: 424–432.

[6] Guerrini M, Beccati D, Shriver Z, et al. Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in heparin associated with adverse clinical events. Nat Biotechnol, 2008, 26(6): 669–675.

[7] Laurencin CT, Nair L. The FDA and safety—beyond the heparin crisis. NatBiotechnol, 2008, 26(6): 621–623.

[8] Xu YM, Masuko S, Takieddin M, et al. Chemoenzymatic synthesis of homogeneous ultralow molecular weight heparins. Science, 2011, 334(6055): 498–501.

[9] Bauer KA, Hawkins DW, Peter PC, et al. Fondaparinux, a synthetic pentasaccharide: the first in a new class of antithrombotic agents—the selective factor Xa inhibitors. Cardiovasc Ther, 2002, 20(1): 37–52.

[10] BoltjeTJ, Buskas T, Boons GJ, et al. Opportunities and challenges in synthetic oligosaccharide and glycoconjugate research. Nat Chem, 2009, 1(8): 611–622.

[11] Zhang ZQ, McCallum SA, Xie J, et al. Solution structures of chemoenzymatically synthesized heparin and its precursors. J Am Chem Soc, 2008, 130(39): 12998–13007.

[12] Li YH, Yu H, Thon V, et al. Donor substrate promiscuity of the N-acetylglucosaminyltransferase activities ofheparosan synthase 2 (PmHS2) andK5 KfiA. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(3): 1127–1134.

[13] Restaino OF, Bhaskar U, Paul P, et al. High cell density cultivation of a recombinantstrain expressing a key enzyme in bioengineered heparin production. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(9): 3893–3900.

[14] Wang ZY, Ly M, Zhang FM, et al.K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Biotechnol Bioeng, 2010, 107(6): 964–973.

[15] Barreteau H, Richard E, Drouillard S, et al. Production of intracellular heparosan and derived oligosaccharides by lyase expression in metabolically engineeredK-12. Carbohydr Res, 2012, 360: 19–24.

[16] Zhang CY, Liu L, Teng LP, et al. Metabolic engineering ofBL21 for biosynthesis of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Metab Eng, 2012, 14(5): 521–527.

[17] Wang ZY, Dordick JS, Linhardt RJ.K5 heparosan fermentation and improvement by genetic engineering. Bioeng Bugs, 2011 2(1): 63–67.

[18] Roman E, Roberts I, Lidholt K, et al. OverexpressionofUDP-glucose dehydrogenaseinresultsin decreased biosynthesis of K5 polysaccharide. Biochem J, 2003, 374(3): 767–772.

[19] Lidholt K, Riesenfeld J, Jacobsson KG, et al. Biosynthesis of heparin. Modulationofpolysaccharidechainlength in acell-freesystem. Biochem J, 1988, 254(2): 571–578.

[20] Bitter T, Muir HM. A modified uronic acid carbazole reaction. Anal Biochem, 1962, 4(4): 330–334.

[21] Widner B, Behr R, Von Dollen S, et al. Hyaluronic acid production in. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(7): 3747–3752.

[22] Sugiura N, Baba Y, Kawaguchi Y, et al. Glucuronyltransferase activity of KfiC fromstrain K5 requires association of KfiA: KfiC and KfiA are essential enzymes for production of K5 polysaccharide, N-acetylheparosan. J Biol Chem, 2010, 285(3): 1597–1606.

[23] Hodson N, Griffiths G, Cook N, et al. Identification that KfiA, a protein essential for the biosynthesis of theK5 capsular polysaccharide, is anα-UDP-GlcNAc glycosyltransferase: the formation of a membrane-associated K5 biosynthetic complex requires KfiA, KfiB, and KfiC. J Biol Chem, 2000, 275(35): 27311–27315.

[24] Jin P, Kang Z, Yuan PH, et al. Production of specific-molecular-weight hyaluronan by metabolically engineered168. Metab Eng, 2016, 35: 21–30.

[25] Chen WY, Marcellin E, Steen CA, et al. The role of hyaluronic acid precursor concentrations in molecular weight control in. Mol Biotechnol, 2014, 56(2): 147–156.

[26] Chen WY, Marcellin E, Hung J, et al. Hyaluronan molecular weight is controlled by UDP-N-acetylglucosamine concentration in. J Biol Chem, 2009, 284(27): 18007–18014.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Optimization of heparosan synthetic pathway in168

Linpei Zhang1,2, Hao Wang1,2, Zhengxiong Zhou1,2, Guocheng Du1,2, Jian Chen1,2, and Zhen Kang1,2

1,,,214122,,School of BiotechnologyJiangnan UniversityWuxiJiangsuChina

Heparosan is the start point for chemoenzymatic synthesis of heparin and it isof great significance to efficiently synthesize heparosan in microorganisms. The effects of overexpressing key enzyme genes of the UDP-glucuronic acid (UDP-GlcUA) pathway (,and) or the UDP-N-acetyl-glucosamine (UDP-GlcNAc) pathway (,and) on the heparosan production and molecular mass were analyzed in the constructed heparosan-producing((1.71±0.08) g/L). On this basis, heparosan production was increased to (2.89±0.11) g/L with the molecular mass of (75.90±1.18) kDa through co-overexpressing the,,,andgenes in shake flask cultivation. In the 3 L fed-batch fermentation, heparosan production was improved to (7.25±0.36) g/L with the molecular mass of (46.66±2.71) kDa, providing the potential for heparosan industrial production.

heparosan,, pathway optimization, production, molecular mass

10.13345/j.cjb.160453

November 18, 2016; Accepted: December 23, 2016

Zhen Kang. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918309; E-mail: zkang@jiangnan.edu.cn Guocheng Du. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918309; E-mail: gcdu@jiangnan.edu.cn

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