循環(huán)長鏈非編碼RNA作為生物標志物在腫瘤分子診斷中的應(yīng)用

江楠，田海華,2，潘金昌，龔朝輝

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循環(huán)長鏈非編碼RNA作為生物標志物在腫瘤分子診斷中的應(yīng)用

江楠1，田海華1,2，潘金昌1，龔朝輝1

1 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，浙江寧波 315211 2 寧波市康寧醫(yī)院檢驗科，浙江寧波 315201

江楠, 田海華, 潘金昌, 等. 循環(huán)長鏈非編碼RNA作為生物標志物在腫瘤分子診斷中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(6): 910–922.Jiang N, Tian HH, Pan JC, et al. Circulating long noncoding RNAs as biomarkers in tumor diagnosis. Chin J Biotech, 2017, 33(6): 910–922.

長鏈非編碼RNA (Long noncoding RNA，lncRNA) 被發(fā)現(xiàn)廣泛參與基因表達、表觀遺傳調(diào)控和X染色體失活等重要生命過程，還與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。lncRNA可能以微泡、外泌體或蛋白質(zhì)復(fù)合物形式進入人體循環(huán)系統(tǒng)中，形成循環(huán)lncRNA穩(wěn)定而廣泛存在于血液、尿液等體液中。文中簡要回顧了近來關(guān)于循環(huán)lncRNA的來源，以及作為生物標志物的檢測方法，著重總結(jié)分析了循環(huán)lncRNA作為潛在腫瘤生物標志物在肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌等常見惡性腫瘤中的早期診斷價值。與傳統(tǒng)生物標志物相比，循環(huán)lncRNA具有作為新型生物標志物的獨特優(yōu)勢和臨床應(yīng)用價值。

循環(huán)長鏈非編碼RNA，腫瘤，生物標志物，分子診斷

據(jù)美國2016年癌癥統(tǒng)計報告，癌癥已經(jīng)成為全美以及全球主要的公共健康問題，在未來幾年內(nèi)很可能會超過心臟病成為排列第一的致死原因[1]。癌癥致死的原因是多方面的，而早期診斷是提前發(fā)現(xiàn)并進行干預(yù)的關(guān)鍵，目前臨床上使用的X射線檢查、超聲檢查、計算機斷層掃描 (Computed tomography，CT)、核磁共振成像 (Magnetic resonance imaging，MRI) 和內(nèi)腔鏡檢查等手段能從不同角度對腫瘤進行早期的診斷，在一定程度上提高了腫瘤的早期診斷率，但仍存在許多不同程度的局限性。自1978年Herberman提出腫瘤標志物的概念后，目前已發(fā)現(xiàn)了100多種腫瘤標志物，為腫瘤的早期診斷提供了新的途徑[2]。隨著腫瘤分子生物學(xué)和組學(xué)技術(shù)的不斷進展，腫瘤標志物的研究已成為癌癥診斷領(lǐng)域的熱點。近幾年，研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA (Long noncoding RNA，lncRNA) 在許多生物進程中起到重要作用，包括基因調(diào)控[3]、細胞周期檢驗點[4]、細胞遷移[5]等，也在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。同時，利用基于腫瘤患者外周血的循環(huán)核酸檢測逐步引起人們的重視，循環(huán)lncRNA在腫瘤早期臨床診斷和治療中的應(yīng)用越來越廣泛。本文就近年來循環(huán)lncRNA作為生物標志物在腫瘤診斷中的應(yīng)用進展作簡要綜述。

1 循環(huán)lncRNA的來源

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸且自身不編碼蛋白的RNA分子，它起初被認為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，并不具有生物學(xué)功能[6-7]。然而在近幾年的研究中發(fā)現(xiàn)，lncRNA可以通過多種機制在多種層面上影響基因的表達水平，且越來越多的研究表明lncRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色。在20世紀八九十年代就有研究報道了循環(huán)RNA的存在[8-9]，為后來的循環(huán)lncRNA研究奠定了基礎(chǔ)。由于RNA不穩(wěn)定，容易被血液中的核糖核酸酶降解，人們對lncRNA是如何分泌入血液并穩(wěn)定存在的機制目前還未完全了解。綜合已有的研究分析，循環(huán)lncRNA的來源可能通過如下途徑 (圖1)：1) 來源于活細胞，即循環(huán)lncRNA可能來自于活細胞的主動分泌過程，其中比較多的是以外泌體 (Exosomes) 和微泡 (Microvesicles) 形式存在。雖然血液中存在核糖核酸酶，但是lncRNA仍能夠穩(wěn)定存在，主要是由于外泌體或者微泡等的保護。Dong等[10]檢測了血液中外泌體、凋亡小體和微泡中的RNA含量，發(fā)現(xiàn)血液中l(wèi)ncRNA主要分布在外泌體之中，這也說明lncRNA可能是通過這種細胞外囊泡的形式分泌入血。同時，循環(huán)lncRNA也可能是通過類似其他非編碼RNA入血的方式，比如微RNA (MicroRNA，miRNA) 可以通過與Ago2蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，而穩(wěn)定存在于血液循環(huán)中[11]，這表明lncRNA可通過與其他分泌物一同結(jié)合而進入循環(huán)系統(tǒng)。2) 來源于凋亡或者壞死的細胞。腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶中存在一類具有轉(zhuǎn)移傾向的腫瘤細胞，通過上皮-間葉轉(zhuǎn)換過程，而使其更容易侵入血管內(nèi)皮而進入血液循環(huán)，稱之為循環(huán)腫瘤細胞 (Circulating tumor cell，CTC)[12]。CTCs入血之后存活時間一般不會超過24 h。進入血液的腫瘤細胞往往保留有起源組織的特異性標志物，即上皮標志物。通過對癌癥患者及對照組的外周血進行分析，發(fā)現(xiàn)在癌癥患者血液中上皮特異性蛋白的mRNA存在的百分比為36%?100%，由此表明循環(huán)RNA可能來自于這些侵入血管內(nèi)的循環(huán)腫瘤細胞[13]。同樣可能來自細胞凋亡或者其他形式的細胞死亡的血漿游離DNA (Cell-free DNA，cfDNA) 也為循環(huán)lncRNA來自于凋亡或者壞死細胞提供可能[14]。

2 循環(huán)lncRNA作為腫瘤標志物

目前臨床上常用的腫瘤標志物主要是腫瘤抗原和異位激素等。比如，常見的癌胚抗原 (CEA) 用于預(yù)警結(jié)直腸癌和乳腺癌[15]，甲胎蛋白 (AFP)用于預(yù)警胃癌、腸癌等，這些傳統(tǒng)生物標志物在腫瘤早期診斷中應(yīng)用廣泛[16]。然而，傳統(tǒng)標志物存在諸多不足，其中包括特異性和靈敏度不高，同一種標志物可以預(yù)示多種癌癥風(fēng)險的可能，也存在較大的漏診和誤診的幾率。自lncRNA被發(fā)現(xiàn)以來，人們通過定量RT-PCR技術(shù)在血漿、血清、尿液等人體體液中檢測到lncRNA[17-19]。因此，循環(huán)lncRNA成為新的腫瘤標志物的關(guān)注焦點[20]。較早發(fā)現(xiàn)的lncRNA H19與多種腫瘤有密切關(guān)系，在32對相互匹配的胃癌患者和健康人群的血液樣本中檢測發(fā)現(xiàn)，H19顯著地高表達于胃癌癌癥患者中，且和患者生存率等病理因素存在著較為明顯的關(guān)系[21]。作為一種生物標志物，循環(huán)lncRNA可以穩(wěn)定存在于循環(huán)系統(tǒng)中，具有免受核酸酶降解的特性[22]。同時，循環(huán)lncRNA可在血液、尿液等體液中檢測出來。因此，循環(huán)lncRNA的來源簡單豐富，取材方便，適用于早期檢查診斷，具有較高的診斷價值。

圖1 循環(huán)長鏈非編碼RNA的來源

3 循環(huán)lncRNA的檢測

檢測循環(huán)lncRNA的常用方法有微陣列芯片 (Microarray)、RNA 測序 (RNA sequencing)、Northern印跡雜交 (Northern blotting) 和定量RT-PCR (Quantitative RT-PCR) 等。lncRNA微陣列芯片是將已知序列的lncRNA利用微處理技術(shù)，固定在玻璃或薄膜芯片上，對患者和健康對照樣本進行l(wèi)ncRNA表達譜分析，通過生物信息學(xué)的方法篩選出具有表達差異的lncRNA，并可通過定量RT-PCR或Northern blotting技術(shù)對候選lncRNA進行驗證，確定其表達水平。利用芯片檢測的優(yōu)勢是可以平行地、大量地、全面地分析，具有高度自動化、規(guī)模化及微型化的特性，但是微陣列分析的成本費用較高，同時生成的數(shù)據(jù)量非常龐大且數(shù)據(jù)形態(tài)比一般實驗數(shù)據(jù)更加復(fù)雜，后續(xù)需要進行大量的數(shù)據(jù)分析來提高其檢測的準確性[23]。lncRNA測序 (lncRNA-Seq) 是一種使用特定方法降低樣本中rRNA的豐度，然后對富集到的RNA進行文庫構(gòu)建、測序及分析，從而快速、全面、準確地獲得與特定生物學(xué)過程 (例如發(fā)育、疾病等) 相關(guān)lncRNA信息的研究方法。該方法可以更加高效地獲取lncRNA序列，且突破了常規(guī)lncRNA芯片檢測技術(shù)的使用范圍限制[24-25]。但RNA-Seq成本較高，對RNA純度要求高、文庫構(gòu)建步驟繁瑣。Northern 印記雜交 (Northern blotting) 是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，利用RNA探針進行檢測的方法。它具有靈敏性高的特點，不僅可用于檢測lncRNA在血樣中的表達水平，還可結(jié)合使用RNA marker檢測lncRNA的分子大小，這對于排除其他小分子RNA的污染有重要意義。Northern 印跡雜交也可作為lncRNA定量的方法，其缺點是對RNase污染敏感，任一步操作不當(dāng)都會嚴重影響實驗結(jié)果。另外，Northern印跡雜交對樣品的需求量較高，需要微克級樣品才能避免假陰性，有時樣品量達到40 μg以上才會出現(xiàn)明顯雜交信號[26-27]。定量RT-PCR也是現(xiàn)在用來檢測lncRNA的一種常用檢測手段，同時也是驗證芯片技術(shù)等的準確性的金標準。因其較為簡便的步驟和低廉的成本從而得到了大量的應(yīng)用[28]?？傊陨细鞣N常見檢測方法各有優(yōu)缺點，通常在實踐中根據(jù)不同的目的選擇不同的方法來檢測lncRNA表達情況 (表1)。

表1 循環(huán)lncRNA主要研究技術(shù)及優(yōu)缺點

4 循環(huán)lncRNA與腫瘤診斷

由于循環(huán)lncRNA可被精確檢測，因此循環(huán)系統(tǒng)lncRNA可作為一種新型生物標志物用于腫瘤診斷。目前通過檢測循環(huán)lncRNA表達情況，已在多種腫瘤的臨床診斷中得到應(yīng)用。

4.1 肺癌

肺癌的發(fā)病率和致死率居各惡性腫瘤之首。相當(dāng)一部分患者被確診時已是晚期，預(yù)后較差，5年生存率不足15%。目前肺癌的早期診斷技術(shù)正在不斷取得進展，其中發(fā)掘新型腫瘤標志物刻不容緩。循環(huán)lncRNA作為一種微創(chuàng)的生物標志物，已在肺癌中得到驗證。Weber等[29]在45例非小細胞肺癌 (Non-small cell lung cancer，NSCLC) 患者和25例健康志愿者血液樣本中檢測lncRNA MALAT 1的表達來確定其作為循環(huán)標志物的價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在NSCLC患者中顯著高表達，受試者工作特征曲線 (Receiver operating characteristic curve，ROC) 分析ROC曲線下的面積 (Area under ROC curve，AUC) 值為0.79，這表明循環(huán)MALAT1作為NSCLC診斷的價值較高，其微創(chuàng)性和較高的特異性都表明MALAT1作為腫瘤標志物的應(yīng)用價值。Hu等[30]通過檢測NSCLC患者血漿中異常表達的lncRNA來篩選新的標志物。首先通過在20例肺癌患者和20例健康志愿者的樣本中篩選出了6個與組織中特異性表達一致的候選lncRNA，在擴大樣本庫中再一次進行檢測驗證，其中3個仍有顯著意義，分別為lncRNA SPRY4-IT1、ANRIL和NEAT1。進一步分析對其診斷的價值，分別得到其AUC值分別為0.603、0.798和0.693，同時聯(lián)合檢測上述3種lncRNA呈現(xiàn)出更高的敏感性和特異性，其AUC為0.876。這些結(jié)果表明上述3種lncRNA有望成為診斷NSCLC的新型標志物。Tang等[31]首先通過基因芯片技術(shù)篩選出8個在NSCLC患者中特異性表達的lncRNA，同時設(shè)置訓(xùn)練集 (Training set) 包括20例肺癌患者和20例健康志愿者樣本，利用定量RT-PCR技術(shù)進行驗證，獲得3個有意義的lncRNA (RP11-397D12.4、AC007403.1和ERICH1-AS1)。進一步在包括232例肺癌患者和135例健康志愿者血液樣本的驗證集 (Validation set) 中進行表達水平檢測，均為顯著高表達。隨后為了檢驗這3種lncRNA的診斷價值，分別進行了ROC曲線和AUC值的分析，均顯示其有較好的特異性和敏感性。Tang等還對這3種lncRNA進行了雙盲檢測，在50例癌癥樣本和50例健康志愿者中準確率高達89%。這樣避免了主觀意識對客觀結(jié)果的干擾，提高了準確率。Wang等[32]發(fā)現(xiàn)lncRNA UCA1在NSCLC患者癌組織中顯著高表達于癌旁組織，進一步檢測該基因在癌癥患者血漿中的表達，發(fā)現(xiàn)在患者中顯著性地高表達，并且通過對比發(fā)現(xiàn)60例癌癥患者的血漿中l(wèi)ncRNA表達和癌組織中的表達關(guān)系十分緊密 (=0.881)，AUC值為0.886，這些結(jié)果表明UCA1有作為循環(huán)標志物的價值。Liang等[33]通過前期研究發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS5在NSCLC組織當(dāng)中出現(xiàn)差異性表達，之后通過檢測lnRNA GAS5在90例NSCLC患者和30例健康志愿者血漿樣本中的表達發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)顯著下調(diào)，并且lncRNA GAS5與NSCLC腫瘤分期存在非常大的關(guān)系 (=0.024)，Ⅲ和Ⅳ期的表達量要明顯低于Ⅰ和Ⅱ期。GAS5的AUC值為0.832 (<0.000 1；敏感性為82.2%；特異性為72%)，表明其可以用于區(qū)別NSCLC患者和普通人群，同時將其和目前常用的癌胚抗原 (CEA) 結(jié)合使用后，AUC值高達0.909。這些都說明GAS5具有成為NSCLC生物標志物的潛在價值。綜上所述，循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的差異表達lncRNA與肺癌患者的各種病理因素相關(guān)，有望作為肺癌診斷的新型生物標志物。

4.2 乳腺癌

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率近年來急劇上升[34]。循環(huán)lncRNA在乳腺癌診斷中的應(yīng)用已有探索。Xu等[35]通過在68例乳腺癌患者和68例健康正常人血清樣本中使用定量RT-PCR方法檢測lncRNA RP11-445H22.4的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該lncRNA在乳腺癌患者的血清中顯著高表達。為了更好地探究該lncRNA的臨床價值，研究人員進一步比較了lncRNA與常見腫瘤血清標志物AFP、CEA、CA125和CA153等的ROC和AUC值，結(jié)果表明lncRNA RP11-445H22.4的敏感性和特異性最高。除此之外，通過與傳統(tǒng)超聲波的診斷方法進行比較，lncRNA也有更為顯著的敏感性。這些結(jié)果表明lncRNA RP11-445H22.4有可能成為新的潛在的乳腺癌生物標志物。Miao等[36]在78對乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織中檢測lncRNA MALAT1的表達，發(fā)現(xiàn)在癌組織中顯著高表達，而且lncRNA MALAT1在乳腺癌組織中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但和患者的年齡、腫瘤大小、細胞分化、組織學(xué)分型、雌激素受體 (ER)和雄激素受體 (PR) 等無關(guān)。同時，在乳腺癌患者的血清樣本中，lncRNA MALAT1的表達顯著高于良性乳腺疾病，ROC曲線分析AUC值為0.833，分析表明其敏感性和特異性可以將乳腺癌和其他良性疾病區(qū)分開，這表明lncRNA MALAT1可作為診斷用標志物篩選乳腺癌患者。Zhang等[37]用同樣的方法先在癌組織和癌旁組織中確定lncRNA H19的差異性表達后，再在102例乳腺癌患者血清樣本和96例健康對照當(dāng)中檢測其表達，發(fā)現(xiàn)其顯著高表達 (<0.05)，其AUC為0.81，高于CEA和CA153兩個傳統(tǒng)乳腺癌循環(huán)標志。除此之外，實驗還發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在手術(shù)后的血清樣本中的表達要顯著低于術(shù)前水平 (=0.000 6)，表明H19除了具有成為乳腺癌標志物外還能用于預(yù)后檢測。以上研究表明，循環(huán)lncRNA已在乳腺癌中得到初步應(yīng)用，顯示了較大的應(yīng)用潛力。

4.3 胃癌

胃癌發(fā)病率和致死率占惡性腫瘤的第二位，診斷延誤和有限的治療手段讓胃癌一直成為臨床上的一個重要挑戰(zhàn)。Hashad等[21]通過研究發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在胃癌中有特異性的表達。經(jīng)過檢測32例胃癌患者和32例年齡和性別都相匹配的健康志愿者血液樣本之后，發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在胃癌患者中顯著高表達，并且與性別和年齡都無關(guān)。結(jié)合目前常用的腫瘤血清標志物CEA分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA H19的表達水平與CEA的水平有關(guān)，同時經(jīng)過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)lncRNA H19作為生物標志物要優(yōu)于CEA。聯(lián)合分析CEA和lncRNA H19用于胃癌診斷，其AUC值進一步提高到80.4%。這些結(jié)果表明lncRNA H19是一個非常有價值的潛在的新型胃癌標志物，并且和CEA進行聯(lián)合診斷將取得更好的效果。Jin等[38]通過對173例胃癌患者 (其中包括100例早期胃癌患者，62例接受過外科手術(shù)患者和11例復(fù)發(fā)患者的血液樣本檢測)，以及30例腸息肉、30例非典型增生或腸上皮化生病人和110例年齡和性別都相匹配的健康志愿者血液樣本檢測lncRNA HULC表達，發(fā)現(xiàn)相較于正常健康人和患有腸息肉等普通胃部疾病的患者，胃癌患者HULC呈顯著高表達。在血清中，HULC的表達從早期癌癥狀態(tài)到癌癥階段出現(xiàn)了動態(tài)改變。進一步地將HULC (AUC=0.888) 和CEA (AUC=0.694)、CA72-4 (AUC=0.514) 等其他常用血清標志物相比較，發(fā)現(xiàn)HULC具有更有效的診斷能力。Dong等[39]通過以“癌癥”為關(guān)鍵詞在LncRNA-Disease關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫中篩選出65個癌癥相關(guān)lncRNA，再通過NCBI網(wǎng)站中的Refseq database進一步篩選了其中的39個lncRNA。然后篩選出在40對癌組織和癌旁組織中出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的差異性表達的lncRNA，再將這些lncRNA在10例胃癌患者血液樣本和10例健康志愿者血液樣本中進行檢測，最終得到lncRNA CUDR、LSINCT-5和PTENP1三個顯著下調(diào)且聯(lián)合使用時有最好診斷能力 (AUC=0.92) 的lncRNA。與常用血液胃癌標志物CEA和CA19-9相比有較好的診斷價值，說明血清中這3種lncRNA有希望成為比CEA和CA19-9更好的胃癌診斷標志物。綜上所述，在胃癌診斷當(dāng)中，循環(huán)lncRNA在大量研究中已展現(xiàn)其應(yīng)用價值，并且在多指標聯(lián)合診斷中可以發(fā)揮更大的功效，為未來胃癌的創(chuàng)新診斷方式研究提供了新的手段。

4.4 肝癌

肝細胞癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC) 是世界范圍內(nèi)的常見癌癥，也是致死率位居第二的癌癥。Wang等[40]通過分析血液中特異性表達的lncRNA，發(fā)現(xiàn)在肝癌患者中顯著高表達于乙肝患者和健康人群，通過對其診斷價值分析得出lncRNA uc003wbd和AF085935可以用于區(qū)分肝癌與乙肝和健康人，這表明上述兩個lncRNA有較大診斷價值。同時，Lu等[41]通過在137例HCC患者、104例乙肝患者和138例健康志愿者總共379例血清樣本中檢測lncRNA uc003wbd和lncRNA-AF085935的表達，發(fā)現(xiàn)HCC患者和乙肝患者的血清樣本中l(wèi)ncRNA都是顯著高表達于健康志愿者組，同時HCC組中的表達也顯著高于乙肝患者組。進一步ROC曲線分析，表明在HCC患者和乙肝患者的區(qū)別中，lncRNA uc003wbd的AUC值為0.70，lncRN AF085935的AUC值為0.86。而在區(qū)別HCC患者和健康對照組時，上述兩個lncRNA的AUC值分別為0.86和0.96。這些結(jié)果說明這兩種lncRNA在HCC和乙肝患者中都顯著地高表達于正常人群，同時它們在HCC患者中的高表達又可用于區(qū)分HCC和乙肝。因此，這兩種lncRNA都有可能成為HCC新的血清生物標志物。Kamel等[42]通過在Database of Cancer Gene Network from Public Gene Expression Data篩選出UCA1和WRAP53兩個和HCC相關(guān)的lncRNA，然后分別在82例早期HCC患者、34例丙型肝炎患者、44例健康志愿者的血樣樣本中和20對HCC患者癌組織和癌旁組織中檢測了這兩個lncRNA的表達，結(jié)果表明上述兩個lncRNA在HCC患者血液樣本中顯著高表達，而且在癌組織中同樣也是顯著高表達，同時發(fā)現(xiàn)了lncRNA在血清樣本和癌組織中的表達存在較高的相關(guān)性 (UCA1，<0.01；WRAP53，<0.02)。Li等[43]通過在8個候選lncRNA中先進行小樣本量篩選出3個具有差異表達的lncRNA HULC和Linc00152，在肝細胞癌血清樣本中顯著高表達。之后放大樣本量再次進行表達量檢測，lncRNA HULC和Linc00152仍具有差異性，且值均小于0.000 1。兩者通過ROC分析之后得到的AUC值分別為0.78和0.85，聯(lián)合診斷后達到0.87。兩個lncRNA更是在雙盲檢測中達到81.9%的準確率。Yu等[44]的研究認為標志物如果只建立在單一的與腫瘤相關(guān)的lncRNA上，其特異性與敏感性都不是特別好。若將多種腫瘤相關(guān)lncRNA結(jié)合使用后可大大提高標志物的診斷價值，其發(fā)現(xiàn)PVT1和uc002mbe可以用于區(qū)分HCC患者和健康組，AUC值為0.764 (95%CI：0.648?0.833)，效果優(yōu)于傳統(tǒng)標志物AFP，因而具有非常高的應(yīng)用價值。以上結(jié)果表明，多種循環(huán)lncRNA均具有成為肝細胞癌新型標志物的潛力，將得到廣泛應(yīng)用。

4.5 結(jié)直腸癌

結(jié)腸直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中僅次于胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌。Yang等[45]檢測10對結(jié)腸癌及癌旁組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR的表達發(fā)現(xiàn)HOTAIR在癌組織中顯著高表達，進一步檢測lncRNA HOTAIR在47例結(jié)腸癌患者血清和40例健康志愿者血清樣本之中的相對表達，同樣發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR在結(jié)腸癌患者血清樣本中顯著高表達于健康志愿者。通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR的表達值大于13.30時，診斷結(jié)腸癌的敏感性為65.96%，特異性為85%，其AUC值為0.741。這些結(jié)果表明血清中的HOTAIR的表達有可能用于結(jié)腸癌的診斷。該研究組還進一步檢測了lncRNA HOTAIR在血清中表達的穩(wěn)定性，通過放置在室溫數(shù)天和反復(fù)凍融數(shù)次之后檢測相對表達后發(fā)現(xiàn)HOTAIR穩(wěn)定地存在于結(jié)腸癌患者血清中。這表明lncRNA在血清中有較高穩(wěn)定性，具備作為腫瘤標志物的重要特征。Kun等[46]在80對結(jié)腸癌患者的癌和癌旁組織中檢測lncRNA UCA1的相對表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在癌組織中l(wèi)ncRNA UCA1呈顯著高表達。進一步在20例結(jié)腸癌患者血清樣本和20例健康志愿者血清樣本中檢測發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌患者中UCA1顯著高表達，組織中的UCA1表達水平和血清中表達水平有明顯的相關(guān)性，并且血清中UCA1的表達在切除性手術(shù)14 d之后顯著下降，顯示其還可作為結(jié)腸癌預(yù)后的標志物。以上研究結(jié)果表明，血清中l(wèi)ncRNA的可檢測性和穩(wěn)定性都表明其具有成為結(jié)腸癌診斷用標志物的潛力。

4.6 前列腺癌

前列腺癌是一種男性十分常見的癌癥類型，在全球范圍內(nèi)發(fā)生呈上升趨勢，尤其是在亞洲國家。目前早期診斷前列腺癌主要依靠血液中前列腺特異性抗原 (PSA) 檢測。lncRNA PCA3是一個目前在前列腺癌中被較好研究過的lncRNA，在前列腺癌組織中顯著高表達，并且可以在尿液中檢測到，是較早的可以在尿液中檢測的分子診斷標志物[47]。Feibus等[48]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA PCA3在前列腺癌患者尿液中顯著高表達。同時Lee等[49]利用lncRNA PCA3作為陽性對照，GAPDH作為內(nèi)參對照，有6種lncRNA (AK024556、XLOC_07697、LOC100287482、XLOC_005327、XLOC_008559和XLOC_009911)已經(jīng)被證明在前列腺癌組織中顯著高表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)在患者尿液樣本中同樣發(fā)現(xiàn)它們呈顯著高表達。Isin等[50]研究發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21可以用來區(qū)分前列腺癌和良性前列腺增生 (BPH)。他們檢測了lincRNA-p21在30例前列腺癌患者和49例BPH患者的尿液樣本中的表達，發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21顯著高表達于前列腺癌癥患者的尿液中，進一步比較lincRNA-p21和其與常規(guī)血清標志物PSA聯(lián)合使用的ROC曲線，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測lincRNA-p21和PSA后特異性顯著增加，但敏感性沒有顯著改變。Wang等[51]同樣對尿液樣本中的lncRNA MALAT-1進行檢測，利用MALAT-1分數(shù) (MALAT-1分數(shù)= 2Ct(PSA)-Ct(MALAT-1)×1 000) 來判斷其價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在前列腺穿刺陽性的患者中MALAT-1分數(shù)顯著高于穿刺陰性患者。同時ROC曲線結(jié)果也顯示lncRNA MALAT-1有著比PSA更高的AUC值，這些都說明lncRNA MALAT-1有望成為新型的前列腺癌潛在標志物。

綜上所述，循環(huán)lncRNA在常見惡性腫瘤的早期診斷中具有廣泛的應(yīng)用價值，有可能發(fā)展成為一種新型的生物標志物 (表2)。

5 小結(jié)與展望

目前癌癥仍舊是困擾人類的重大問題，而在癌癥治療當(dāng)中早期診斷更是起到了非常大的作用，如果患者能夠在早期診斷中發(fā)現(xiàn)癌癥，許多病例完全可以被治愈。如今隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進步和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，人們越來越關(guān)注以前被稱為是基因組“垃圾”的lncRNA。同時大量研究表明lncRNA在基因表達調(diào)控以及細胞的生長、增殖、凋亡和細胞通訊之間都起到了重要的作用[52-53]，目前研究也發(fā)現(xiàn)lncRNA在多種腫瘤中有著不同程度的表達失調(diào)，并且與腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲遷移等生物學(xué)過程存在密切關(guān)系[54]。同時進入循環(huán)系統(tǒng)的lncRNA被發(fā)現(xiàn)能夠穩(wěn)定地存在于血液或其他體液 (尿液、唾液、乳汁等) 中，這樣使得lncRNA能夠方便地被檢測出來。循環(huán)lncRNA作為一種創(chuàng)傷性小、特異性和敏感性都較傳統(tǒng)腫瘤標志物高的一種分子標志物，越來越引起人們的重視。

然而目前循環(huán)lncRNA的檢測仍然存在諸多不足，尚不可直接在臨床實踐中用于各種癌癥的早期診斷。比如循環(huán)lncRNA的內(nèi)參基因沒有較為統(tǒng)一的說法，無法確定選取何種基因作為內(nèi)參是穩(wěn)定的，以及如何用合適的內(nèi)參基因來計算循環(huán)lncRNA的表達，如何提高檢測的準確性等技術(shù)問題還有待進一步研究。同時，許多循環(huán)lncRNA盡管通過前置放大之后，由于其表達水平相對于其他循環(huán)核酸較低，在循環(huán)系統(tǒng)中仍難以檢測出。因此，如何提高循環(huán)lncRNA的檢測，在方法的選擇和建立上都有待改進[55]。再者，目前發(fā)現(xiàn)存在差異性表達的循環(huán)lncRNA缺少針對特定腫瘤的特異性，如H19被發(fā)現(xiàn)在胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種癌癥中存在差異性表達。而癌癥的發(fā)生發(fā)展是多基因聯(lián)合作用的結(jié)果，僅檢測一種循環(huán)lncRNA，其特異性和靈敏性均有限，研究發(fā)現(xiàn)基于多個lncRNA的聯(lián)合檢測，以及與傳統(tǒng)血清標志物的聯(lián)合診斷應(yīng)用可以大大提高診斷價值，這將是今后重要的發(fā)展方向。隨著lncRNA的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究的不斷深入和發(fā)展，循環(huán)lncRNA用于癌癥輔助診斷的價值將得到進一步的提高。

表2 循環(huán)lncRNA在腫瘤診斷中的應(yīng)用

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Circulating long noncoding RNAs as biomarkers in tumor diagnosis

Nan Jiang1, Haihua Tian1,2, Jinchang Pan1, and Zhaohui Gong1

1 Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Medical School of Ningbo University, Ningbo 315211, Zhejiang, China 2 Department of Laboratory Medicine, Ningbo Kangning Hospital, Ningbo 315201, Zhejiang, China

Long noncoding RNAs (lncRNAs) are involved in vital life processes of gene expression, epigenetic regulation and X-chromosome inactivation. lncRNAs are also closely associated with tumor initiation and progression. Moreover, lncRNAs may enter human circulation system in the form of microvesicle or exosome, or in combination with RNA binding protein. Interestingly, the circulating lncRNAs are widely existed in body fluids, such as blood and urine. We review the origin of circulating lncRNAs, and the detection methods as potential biomarkers. We focus on the early diagnosis value of circulating lncRNAs as tumor biomarkers in lung, breast, gastric, liver, colorectal and prostate cancers. Compared with the traditional biomarkers, the circulating lncRNAs show the unique advantages and clinical values as novel biomarkers.

circulating lncRNA, tumor, biomarker, molecular diagnosis

10.13345/j.cjb.160463

November 30, 2016; Accepted: January 24, 2017

Zhaohui Gong. Tel: +86-574-87600740; Fax: +86-574-87608638; E-mail:zhaohui@ncri.org.cn

Supported by:Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No. LY15C060003), Natural Science Foundation of Ningbo City (No. 2015A610220), Sci-Tech Project of Ningbo City (No. 2014C50058), K.C.Wong Magna Fund in Ningbo University and the Key Project of Student Research Innovation Plan in Ningbo University (No. 2016002).

浙江省自然科學(xué)基金(No. LY15C060003)，寧波市自然科學(xué)基金(No. 2015A610220)，寧波市社發(fā)科技攻關(guān)項目(No. 2014C50058)，寧波大學(xué)王寬誠教育基金，寧波大學(xué)大學(xué)生科研創(chuàng)新計劃重點項目 (No. 2016002) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-02-13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170213.1503.004.html