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    藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)的發(fā)展與展望

    2017-07-01 18:50:20齊允晶王家林欒國(guó)棟談曉明呂雪峰
    生物工程學(xué)報(bào) 2017年6期
    關(guān)鍵詞:藍(lán)細(xì)菌藻株球藻

    齊允晶,王家林,欒國(guó)棟,談曉明,呂雪峰

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    藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)的發(fā)展與展望

    齊允晶1,2,王家林1,欒國(guó)棟2,談曉明2,呂雪峰2

    1 青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東青島 266042 2 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266101

    齊允晶, 王家林, 欒國(guó)棟, 等. 藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)的發(fā)展與展望. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(6): 891–909.Qi YJ, Wang JL, Luan GD, et al. Cyanobacteria cell factories for ethanol photosynthetic production: development and prospect. Chin J Biotech, 2017, 33(6): 891–909.

    生物乙醇是極具應(yīng)用潛力和代表性的生物能源產(chǎn)品之一。以藍(lán)細(xì)菌為光合平臺(tái),利用二氧化碳和太陽(yáng)能直接進(jìn)行乙醇合成可以同時(shí)起到降低二氧化碳排放和提供可再生能源的效果,具有重要的研究與應(yīng)用價(jià)值。本文回顧了藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷程和現(xiàn)狀,從途徑優(yōu)化、底盤(pán)選擇和代謝工程策略等層面對(duì)其最新進(jìn)展和所遇到的問(wèn)題進(jìn)行了總結(jié)介紹,并對(duì)該技術(shù)未來(lái)發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

    藍(lán)細(xì)菌,生物乙醇,代謝工程,細(xì)胞工廠(chǎng),乙醇耐受性

    全球性的環(huán)境污染問(wèn)題和潛在的能源危機(jī)正推動(dòng)著用于合成新一代綠色生物燃料的可持續(xù)性技術(shù)路線(xiàn)和生產(chǎn)模式的發(fā)展,以期能夠有效補(bǔ)充和替代正在被大量消耗的石化燃料[1-2]。作為最早實(shí)現(xiàn)商業(yè)化推廣和應(yīng)用的生物燃料產(chǎn)品,乙醇已經(jīng)被廣泛接受和應(yīng)用為燃油添加劑甚至替代品[3-5]。目前絕大部分的生物乙醇來(lái)源于生物煉制過(guò)程,其生產(chǎn)技術(shù)可以根據(jù)原料和底物來(lái)源劃分為3代。最初的生物乙醇合成以含糖量豐富的農(nóng)作物生物質(zhì)為原料,其中以“玉米乙醇”最具代表性,但是其“與糧爭(zhēng)地、與人爭(zhēng)糧”以及原料供應(yīng)不足的問(wèn)題引發(fā)了極大的社會(huì)爭(zhēng)議,進(jìn)而直接限制了該技術(shù)的實(shí)際可推廣性[6-7]。第二代生物乙醇以非糧生物質(zhì)為主要原料,通過(guò)對(duì)以木質(zhì)纖維素為代表的農(nóng)業(yè)廢棄物、林業(yè)廢棄物等的收集、處理和發(fā)酵進(jìn)行乙醇合成,該技術(shù)體系緩解了“糧食乙醇”在原料供應(yīng)上的天然不足,但是纖維素原料預(yù)處理過(guò)程中對(duì)能量、水和纖維素酶等的需求極大地提高了二代生物乙醇的生產(chǎn)成本,束縛了該技術(shù)的應(yīng)用潛力[8]。以真核和原核藻類(lèi)等易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)迅速的光合自養(yǎng)生物的生物質(zhì)提供底物進(jìn)行生物煉制,可以極大地降低原材料預(yù)處理的難度和耗費(fèi)進(jìn)而節(jié)省生產(chǎn)成本,被稱(chēng)之為第三代生物燃料技術(shù),表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景[9-11]。

    代謝工程與合成生物學(xué)相關(guān)理論和技術(shù)的發(fā)展,使得通過(guò)基因工程改造,利用光合生物平臺(tái)將太陽(yáng)能和二氧化碳直接轉(zhuǎn)化為生物燃料產(chǎn)品的技術(shù)逐漸成熟。與傳統(tǒng)的生物煉制過(guò)程相比,該路線(xiàn)減少了原材料預(yù)處理、底物提煉過(guò)程的損耗,降低了對(duì)培養(yǎng)體系中各種營(yíng)養(yǎng)成分的需求,也大大節(jié)省了化學(xué)品合成全過(guò)程中對(duì)淡水和用地的需求,這些優(yōu)勢(shì)使其逐漸成為科研與產(chǎn)業(yè)界關(guān)注的焦點(diǎn)[12-14]。藍(lán)細(xì)菌 (Cyanobacteria),又稱(chēng)藍(lán)藻 (Blue-green algae),是一類(lèi)能夠進(jìn)行光合作用的原核、自養(yǎng)微生物。與真核微藻相比,藍(lán)細(xì)菌具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)迅速、遺傳操作便捷等優(yōu)勢(shì),因此成為極具潛力的生物基化學(xué)品光合平臺(tái)[13,15]。在涵蓋集胞藻、聚球藻、魚(yú)腥藻等不同種屬的模式藍(lán)細(xì)菌藻株中,都已經(jīng)發(fā)展起了成熟的遺傳操作體系;而轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝物組學(xué)等各種系統(tǒng)生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用則促進(jìn)了對(duì)藍(lán)細(xì)菌在不同環(huán)境、不同培養(yǎng)條件下,生理、生化和代謝層面各種響應(yīng)機(jī)制的理解與認(rèn)識(shí)。上述研究和技術(shù)基礎(chǔ)成為助推藍(lán)細(xì)菌光合平臺(tái)基礎(chǔ)上各種生物基化學(xué)品和生物燃料產(chǎn)品合成路線(xiàn)成功開(kāi)發(fā)的強(qiáng)大動(dòng)力。

    現(xiàn)階段通過(guò)外源基因引入和天然代謝網(wǎng)絡(luò)的修飾,已經(jīng)成功在藍(lán)細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)了氫[16]、醇[17-18]、酮[19]、酸[20-21]、醛[22]、烴[23-24]、糖[25-26]等數(shù)十種天然和非天然代謝產(chǎn)物的光合合成。乙醇是最早報(bào)道的也是現(xiàn)階段最具代表性的藍(lán)細(xì)菌光合生物燃料產(chǎn)品,開(kāi)發(fā)高效的藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng),既可以促進(jìn)新的乙醇合成技術(shù)體系的發(fā)展,又對(duì)其他化學(xué)品光合平臺(tái)的構(gòu)建具有充分的示范意義。本文將對(duì)藍(lán)細(xì)菌光合生物乙醇相關(guān)技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀進(jìn)行回顧和總結(jié),并對(duì)其前景和方向進(jìn)行展望。

    1 藍(lán)細(xì)菌乙醇光合合成的核心途徑

    在對(duì)藍(lán)細(xì)菌野生型藻株的研究中發(fā)現(xiàn),其中少數(shù)藻株具有極為微弱的乙醇合成能力。1991年,Heyer等對(duì)隨機(jī)挑選的37株野生型藍(lán)細(xì)菌藻株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)并分析了其代謝產(chǎn)物,結(jié)果在其中 16株野生型藍(lán)細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)到了乙醇,最高產(chǎn)量達(dá)到0.46 mg/L[27];2010年Carrieri等發(fā)現(xiàn)鹽脅迫可以使螺旋藻發(fā)酵產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量提高120倍,達(dá)到0.75 mmol/g干重[28]。但總的來(lái)說(shuō),天然藍(lán)細(xì)菌藻株的乙醇合成能力弱而且合成條件苛刻,只能在發(fā)酵條件下產(chǎn)生,而且代謝途徑不清楚,缺乏實(shí)際改造和應(yīng)用潛力。真正具備改造和應(yīng)用潛力的藍(lán)細(xì)菌乙醇光合合成技術(shù)是隨著代謝工程和合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展而逐步成熟的,通過(guò)將異源的、高效的乙醇合成途徑通過(guò)遺傳操作導(dǎo)入藍(lán)細(xì)菌底盤(pán)細(xì)胞,并輔之以對(duì)天然代謝背景的改造,真正實(shí)現(xiàn)了藍(lán)細(xì)菌胞內(nèi)代謝流重構(gòu),將其光合作用中固定的二氧化碳導(dǎo)向乙醇合成。

    現(xiàn)階段,所有的藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)的開(kāi)發(fā)都是通過(guò)丙酮酸脫羧酶-Ⅱ型乙醇脫氫酶 (Pyruvate decarboxylase-alcohol dehydrogenase Ⅱ,Pdc-AdhII) 途徑的引入、重構(gòu)和調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的(如圖1所示)。最初的藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)采用的是來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的PdcZM-AdhIIZM途徑[17],該途徑也普遍應(yīng)用于其他微生物乙醇細(xì)胞工廠(chǎng)的構(gòu)建中[29-31]。

    圖1 藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)的設(shè)計(jì)和代謝工程改造策略

    1.1 丙酮酸脫羧酶

    丙酮酸脫羧酶 (Pyruvate decarboxylase) 是一種焦磷酸硫胺素 (Thiamine pyrophosphate,TPP) 依賴(lài)型的羧化酶,其全酶狀態(tài)由輔酶TPP、金屬離子Mg2+(或Mn2+) 以及蛋白自身構(gòu)成,作用于α-酮酸,經(jīng)脫羧反應(yīng)形成二氧化碳和相應(yīng)的醛分子。丙酮酸在脫羧過(guò)程中羰基碳原子上會(huì)產(chǎn)生電負(fù)性,導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,而輔因子TPP的存在可以與其結(jié)合,避免此種情況。丙酮酸脫羧酶廣泛存在于豆質(zhì)植物、麻黃等植物 (大豆、麻黃等)、真菌 (釀酒酵母、曲霉等) 以及細(xì)菌 (運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、醋桿菌等) 中,在動(dòng)物細(xì)胞中不存在該酶,不同來(lái)源的丙酮酸脫羧酶性質(zhì)略有不同。

    丙酮酸脫羧酶一直被認(rèn)為是同型乙醇發(fā)酵中的關(guān)鍵酶,其表達(dá)與活性極大地影響著乙醇合成的效率。現(xiàn)階段,藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)中普遍采用的基因來(lái)自于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。2002年Raj等從棕櫚發(fā)酵細(xì)菌中克隆、鑒定了一種更高效的丙酮酸脫羧酶PdcZP,相比較于來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的PdcZM,該酶在pH 6.0和7.0兩種條件下都具有更低的m、更高的比活[32]。2012年Algenol公司使用該基因pdc替換pdc,使工程藻株的乙醇產(chǎn)量提高了10%–20%[33-34]。在未來(lái),通過(guò)對(duì)微生物資源和酶資源的充分挖掘或者通過(guò)對(duì)現(xiàn)有丙酮酸脫羧酶基因進(jìn)行定向進(jìn)化改造[35]以獲得活性、穩(wěn)定性更高的丙酮酸脫羧酶基因,將有希望進(jìn)一步提高乙醇合成效率。

    1.2 Ⅱ型乙醇脫氫酶

    醇脫氫酶大量存在于植物、動(dòng)物和微生物細(xì)胞中[36],Ⅱ型醇脫氫酶是一種含鋅酶類(lèi),以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH) 為輔酶,其全酶形態(tài)為含4個(gè)亞基的四聚體,每個(gè)亞基結(jié)合 1個(gè)NADH/NADPH和1個(gè)Zn2+,催化伯醇和相應(yīng)醛之間的可逆反應(yīng)。最初,用于改造藍(lán)細(xì)菌進(jìn)行乙醇合成的Ⅱ型醇脫氫酶基因同樣來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌[17,37]。為了提高藍(lán)細(xì)菌乙醇合成效率,對(duì)乙醇脫氫酶進(jìn)行的探索和研究則更為廣泛和深入。Algenol公司的研究人員對(duì)來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的adhIadhII、來(lái)自集胞藻sp. PCC6803 (以下簡(jiǎn)稱(chēng)為集胞藻PCC6803) 的,以及來(lái)自大腸桿菌K12和嗜熱型藍(lán)細(xì)菌BP-1的兩種雙功能醛/醇脫氫酶分別與pdc串聯(lián)后由銅離子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制,在集胞藻PCC6803中表達(dá)并測(cè)定乙醇合成情況。結(jié)果證明來(lái)自PCC6803自身的基因藻株最適合用于乙醇合成,相應(yīng)工程藻株獲得了最高的乙醇產(chǎn)量[33]。

    本實(shí)驗(yàn)室此前的研究中獲得了類(lèi)似的結(jié)果,通過(guò)將對(duì)來(lái)自集胞藻、魚(yú)腥藻 (sp. PCC7120,以下簡(jiǎn)稱(chēng)為魚(yú)腥藻PCC7120)、聚球藻 (s sp. PCC7942,以下簡(jiǎn)稱(chēng)為聚球藻PCC7942) 的9種醇脫氫酶基因 (集胞藻PCC6803的、和,魚(yú)腥藻PCC7120的、、、和,聚球藻PCC7942的) 以及adhII基因分別和pdc串聯(lián)后在.中表達(dá)后,通過(guò)工程菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)醇能力進(jìn)行初篩,發(fā)現(xiàn)pdc-slr1192的組合實(shí)現(xiàn)了最高的乙醇合成速率,在集胞藻PCC6803工程藻株中將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌來(lái)源的adhII替換為,經(jīng)過(guò)20 d培養(yǎng)后的乙醇產(chǎn)量從0.4 g/L提高至0.6 g/L,約為50%的提高幅度[38]。

    相比較于異源的adhII,的優(yōu)勢(shì)可能來(lái)自于兩方面:首先,作為催化可逆反應(yīng)的酶,在乙醛和乙醇兩種底物之間親和性的差異要大于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的AdhIZM和AdhIIZM[33, 38],后者的可逆性導(dǎo)致了光照培養(yǎng)后期一部分積累的乙醇被重新轉(zhuǎn)化為乙醛進(jìn)而降低了乙醇產(chǎn)量,而使用的工程藻株則無(wú)此現(xiàn)象。另外,更傾向于以NADPH而非NADH為輔酶[39],而集胞藻PCC6803中NADPH的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)NADH[40]。上述因素意味著,使用為AdhII的集胞藻PCC6803工程藻株在乙醇光合合成過(guò)程中可以獲得更穩(wěn)定的底物和輔因子供應(yīng),因而具有更好的產(chǎn)醇潛力。

    1.3 Pdc-AdhII途徑的系統(tǒng)分析

    Pdc-AdhII途徑在藍(lán)細(xì)菌中將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛進(jìn)而轉(zhuǎn)化為乙醇,在此過(guò)程中既存在兩種酶之間的承接協(xié)作又存在外源途徑與底盤(pán)細(xì)胞之間的適配互作。長(zhǎng)遠(yuǎn)角度看,解析、優(yōu)化Pdc-AdhII途徑,明確其與底盤(pán)細(xì)胞之間的適配關(guān)系對(duì)進(jìn)一步提高乙醇光合效率有重要意義。2015年,本實(shí)驗(yàn)室采用體外重構(gòu)動(dòng)態(tài)分析的策略,對(duì)pdc-slr1192途徑進(jìn)行了系統(tǒng)分析。Luan等首先脫離復(fù)雜的胞內(nèi)環(huán)境在胞外重新構(gòu)建該途徑,以純化后的酶 (PdcZM/slr1192)、底物 (丙酮酸,pyruvate)、輔因子 (NADPH/ NADH/TPP)、金屬離子 (Mg2+) 以及中間產(chǎn)物 (乙醛,acetaldehyde) 對(duì)整個(gè)途徑的催化效率影響分別進(jìn)行定量的滴定分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PdcZM的K為0.326 μmol/L,而最大反應(yīng)速率V是 2.074 μmol/(L·s),相應(yīng)數(shù)值分別為 0.109 μmol/L和1.722 μmol/(L·s),表明影響乙醇合成的限制因素是PdcZM而非;而在總蛋白濃度設(shè)置恒定的分析中,PdcZM-slr1192的濃度比為4∶6時(shí)全途徑具有最大的乙醇合成催化活性。我們進(jìn)而在集胞藻PCC6803中構(gòu)建了PdcZM-slr1192濃度配比不同的工程菌株,通過(guò)代謝工程結(jié)合酶活與蛋白含量分析實(shí)驗(yàn),證明pdc而非的表達(dá)量和活性是現(xiàn)階段藍(lán)細(xì)菌工程藻株乙醇合成的限制性因素,而提高PdcZM活性和表達(dá)強(qiáng)度應(yīng)該是進(jìn)一步代謝工程改造的方向。此外,在體外重構(gòu)分析中,NADPH、丙酮酸、TPP、Mg2+和乙醛等組分的m值分別為0.136、6.496、0.011、0.104和0.393 mmol/L,結(jié)合藍(lán)細(xì)菌胞內(nèi)NADPH和丙酮酸等成分的實(shí)際含量分析,提高NADPH和丙酮酸的供應(yīng)量應(yīng)該是提高乙醇合成效率的重要選擇[41]。

    2 藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)的底盤(pán)細(xì)胞選擇

    藍(lán)細(xì)菌是最古老的生命體之一,其種類(lèi)繁多、分布廣泛,在海洋、淡水以及陸域等多種生態(tài)系統(tǒng)中都有分布;而不同藻屬中有單細(xì)胞、絲狀體或絲狀不分化等多種細(xì)胞形式;不同藻株在光合固碳速率、碳匯途徑、固氮能力等生理代謝特性上也有差異[42]。系統(tǒng)考慮代謝改造潛力和未來(lái)工程化應(yīng)用的需要而合理地選擇底盤(pán)細(xì)胞,對(duì)構(gòu)建高效的乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)有著重要意義。表1對(duì)不同底盤(pán)細(xì)胞基礎(chǔ)上構(gòu)建的一系列藍(lán)細(xì)菌乙醇光合工程藻株進(jìn)行了總結(jié)。

    表1 代表性的藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)

    2.1 聚球藻sp. PCC7942和集胞藻PCC6803

    利用藍(lán)細(xì)菌進(jìn)行乙醇光合合成最初是在聚球藻PCC7942實(shí)現(xiàn)的。1999年,Deng等將pdc-adhII途徑克隆在穿梭載體pCB4上導(dǎo)入集胞藻PCC7942,采用啟動(dòng)子 (編碼藍(lán)細(xì)菌自身核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶基因的啟動(dòng)子) 控制表達(dá),在培養(yǎng)4周后工程藻株的乙醇產(chǎn)量達(dá)到0.23 g/L,這也是最早的通過(guò)代謝工程手段實(shí)現(xiàn)的藍(lán)細(xì)菌化學(xué)品光合合成的報(bào)道[17]。雖然聚球藻PCC7942后來(lái)廣泛應(yīng)用于異丁醛、異丁醇[22]、正丁醇[18]、2,3-丁二醇[43]、蔗糖[25]、異丙醇[44]、1,3-丙二醇[45]和丙酮[46]等多種化學(xué)品的光合合成,但藍(lán)細(xì)菌光合合成乙醇的研究卻主要集中于另一種模式藻株集胞藻PCC6803中。

    相比較于PCC7942,集胞藻PCC6803細(xì)胞內(nèi)染色體高拷貝的特性[47]意味著相同的表達(dá)元件在PCC6803中可能會(huì)有更高強(qiáng)度、更穩(wěn)定的表達(dá),而現(xiàn)在普遍應(yīng)用的編碼AdhII的基因也來(lái)自于集胞藻PCC6803,其催化反應(yīng)與宿主的適配性可能也優(yōu)于聚球藻PCC7942。2009年,Dexter等將pdc-adhII途徑整合至PCC6803基因組上,使用光誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子控制表達(dá),經(jīng)過(guò)6 d培養(yǎng)后乙醇產(chǎn)量即達(dá)到0.46 g/L,約為此前聚球藻PCC7942工程藻株產(chǎn)量的2倍,而平均合成速率提高8倍,表明PCC6803可能比PCC7942更適于作為乙醇光合工程藻株構(gòu)建的底盤(pán)細(xì)胞[37]。同年,Algenol公司采用集胞藻PCC6803內(nèi)源的基因代替adhII,采用銅離子誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子控制整條途徑表達(dá),工程藻株培養(yǎng)37 d后乙醇產(chǎn)量達(dá)到3.6 g/L[33]。2014年Dienst等采用高拷貝質(zhì)粒將同樣的PpetJ-pdc-slr1192途徑導(dǎo)入集胞藻PCC6803,模擬光暗12 h交替的培養(yǎng)條件,工程藻株產(chǎn)率達(dá)到至287 mg/(L·d),經(jīng)過(guò)18 d培養(yǎng)后積累了4.7 g/L的乙醇[48]。Algenol公司以集胞藻PCC6803為底盤(pán)細(xì)胞還嘗試了大量不同啟動(dòng)子對(duì)pdc-slr1192途徑的表達(dá)效果及對(duì)乙醇合成能力的影響,其中采用銅離子誘導(dǎo)型時(shí),工程藻株經(jīng)過(guò)30 d培養(yǎng)產(chǎn)量達(dá)到 7.1 g/L[33],實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定的乙醇光合合成。本實(shí)驗(yàn)室在2012年的研究中發(fā)現(xiàn),通過(guò)在集胞藻PCC6803基因組上將啟動(dòng)子控制的pdc-途徑增加一個(gè)拷貝(Prbc-pdc-),可以使乙醇產(chǎn)量大幅提高,在26 d培養(yǎng)后從2 g/L的水平提高至5.5 g/L,產(chǎn)率達(dá)到212 mg/(L·d)[38];在后續(xù)的工作中我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)在基因組上引入第3個(gè)-pdc-拷貝,乙醇產(chǎn)量可以進(jìn)一步提高至8.8 g/L (未發(fā)表 數(shù)據(jù))。

    2.2 聚球藻PCC7002

    聚球藻PCC7942和集胞藻PCC6803的生理和代謝背景相對(duì)清晰,遺傳操作工具發(fā)展成熟,但是這兩種藻株存在共同的問(wèn)題是其對(duì)溫度、高光、高鹽、酸堿變化等環(huán)境脅迫的耐受性較差,生長(zhǎng)速度也較慢,上述因素限制了已有的藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)的規(guī)?;彤a(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用的前景。相比較而言,聚球藻s sp. PCC7002 (以下簡(jiǎn)稱(chēng)為聚球藻PCC7002) 可能是一種更好的選擇[49],該藻株最適生長(zhǎng)溫度為38 ℃ (PCC6803為30 ℃),可以耐受500 μmol photons/(m2·s) 的光照強(qiáng)度(PCC6803和PCC7942最適光強(qiáng)為300 μmol photons/(m2·s));在38 ℃、500 μmol photons/(m2·s)的光照強(qiáng)度下,該藻株細(xì)胞復(fù)制代時(shí)為4.1 h,而PCC7942為8.5 h[50];而且PCC7002是海洋藍(lán)細(xì)菌,其耐鹽性更好,進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)時(shí)可以直接使用海水進(jìn)行培養(yǎng),因此在工程化應(yīng)用和推廣上具有顯著的優(yōu)勢(shì);此外,聚球藻PCC7002細(xì)胞中攜帶有拷貝數(shù)很高的內(nèi)源性質(zhì)粒,以?xún)?nèi)源性質(zhì)粒序列為整合靶點(diǎn)可以有效地提高整合途徑的拷貝數(shù),提高表達(dá)強(qiáng)度[51-52],而這一點(diǎn)對(duì)現(xiàn)階段提高化學(xué)品光合合成通量來(lái)說(shuō)具有重要意義。2012年,Algenol公司的研究人員在PCC7002中以啟動(dòng)子 (鈷離子誘導(dǎo)型) 和啟動(dòng)子分別控制pdc和表達(dá),培養(yǎng)20 d后,乙醇產(chǎn)量可達(dá)到4.7 g/L;同年,美國(guó)Joule公司申請(qǐng)專(zhuān)利介紹的研究策略中,通過(guò)向PCC7002中引入1個(gè)pdc和2個(gè)不同來(lái)源的基因,同時(shí)敲除PCC7002自身的硫辛酸合成途徑 (,),以限制工程藻株生物量積累而最大化乙醇合成強(qiáng)度,經(jīng)過(guò)329 h培養(yǎng)即可生產(chǎn)5.62 g/L的乙醇,為PCC7002底盤(pán)細(xì)胞的最高乙醇產(chǎn)量,同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了已知的最高乙醇光合生產(chǎn)強(qiáng)度[53-54]。

    2.3 非模式藻株

    傳統(tǒng)的模式藻株雖然在遺傳操作工具的開(kāi)發(fā)、生理和代謝特性的解析上有著更豐富的積累,但其在環(huán)境脅迫適應(yīng)性、生長(zhǎng)速度等與規(guī)模擴(kuò)大化培養(yǎng)密切相關(guān)的性質(zhì)上往往難以令人滿(mǎn)意,因此充分挖掘藍(lán)細(xì)菌種質(zhì)資源多樣性與豐富性,探索更適合乙醇光合合成、更具有應(yīng)用潛力的非模式藻株,對(duì)于藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)的未來(lái)發(fā)展有著重要意義。Algenol公司已經(jīng)報(bào)道了一種新的藍(lán)細(xì)菌藻株,命名為ABICyanol,相比于已知的對(duì)各種環(huán)境脅迫因素耐受性較強(qiáng)的模式藻株聚球藻PCC7002,該藻株在乙醇耐受性、高溫耐受性和過(guò)氧化耐受性等方面又有了明顯的提高,對(duì)該藻株遺傳改造結(jié)果表明,選用其自身的啟動(dòng)子控制pdc表達(dá)而啟動(dòng)子控制基因表達(dá),在光照培養(yǎng)初期乙醇的單天生產(chǎn)強(qiáng)度可以達(dá)到0.552 g/(L·d),但這種高強(qiáng)度乙醇合成維持時(shí)間較短,在培養(yǎng)超過(guò)7 d后產(chǎn)醇強(qiáng)度逐漸降低[55]。上述研究表明通過(guò)對(duì)非模式藻株資源的充分挖掘可以為藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)的發(fā)展注入新的活力,而后續(xù)對(duì)ABICyanol等藻株的生理和代謝特性有更深入的理解后,有望實(shí)現(xiàn)高強(qiáng)度、更具穩(wěn)定性和持續(xù)性的乙醇光合合成,從而真正提高此技術(shù)的應(yīng)用化潛力。

    最近報(bào)道的一種聚球藻藻株UTEX 2973是又一種值得嘗試的底盤(pán)細(xì)胞。盡管UTEX2973藻株在基因組上與聚球藻PCC7942具有高達(dá)98%的相似性 (包括55個(gè)SNP和1個(gè)188.6 kb大片段的位置翻轉(zhuǎn)),該菌卻表現(xiàn)出了顯著提高的環(huán)境脅迫適應(yīng)性和更快的生長(zhǎng)速度,在高光強(qiáng) (500 μmo photons/(m2·s))和高溫 (41 ℃) 培養(yǎng)條件下其代增時(shí)間只有2.1 h,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)此前報(bào)道過(guò)的各種模式藻株[50]。而本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)通過(guò)向該藻株中導(dǎo)入蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因,就可以改造成高效的蔗糖光合平臺(tái),且可以經(jīng)過(guò)多次重懸培養(yǎng)而相對(duì)穩(wěn)定地進(jìn)行蔗糖合成與分泌[56],意味著該藻株具有改造成為高效光合平臺(tái)并用于乙醇合成的潛力。

    3 藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)的代謝工程改造策略

    3.1 提高乙醇合成途徑的表達(dá)強(qiáng)度

    在已有的藍(lán)細(xì)菌光合細(xì)胞工廠(chǎng)開(kāi)發(fā)過(guò)程中普遍發(fā)現(xiàn),目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率往往受制于核心代謝途徑的催化效率,強(qiáng)化關(guān)鍵代謝途徑表達(dá)強(qiáng)度通常是改變碳流、優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物合成速率的首要選擇[57-58]。這一策略在藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)開(kāi)發(fā)中也得到了證實(shí)和應(yīng)用 (如圖1中綠色空框箭頭所示)。如前所述,本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)集胞藻PCC6803的改造中,通過(guò)逐步提高Prbc-pdc-slr1192途徑在染色體上進(jìn)行整合的拷貝數(shù),極大地提高了乙醇的產(chǎn)量和合成速率[38]。而在聚球藻PCC7002的改造中,該藻株自身攜帶有數(shù)個(gè)拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于染色體數(shù)目的內(nèi)源性質(zhì)粒,選擇此類(lèi)高拷貝內(nèi)源質(zhì)粒作為整合靶點(diǎn)以提高關(guān)鍵途徑的拷貝數(shù),將會(huì)成為對(duì)聚球藻PCC7002乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)進(jìn)一步改造的重要策略。

    3.2 競(jìng)爭(zhēng)性途徑敲除

    通過(guò)敲除碳源競(jìng)爭(zhēng)性途徑來(lái)提高乙醇合成性能的成功報(bào)道較少,只有Algenol公司在導(dǎo)入了pdc-adhⅡ途徑的集胞藻PCC6803的同時(shí),敲除乙酸激酶 () 基因和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶 () 基因,使工程藻株12 d培養(yǎng)過(guò)程中的乙醇產(chǎn)量從0.47 g/L成功加倍達(dá)到0.95 g/L[33](如圖1中紅色X所示)。

    而集胞藻PCC6803中兩種主要的碳匯途徑糖原和PHB的敲除對(duì)乙醇合成則沒(méi)有正面的影響。2012年本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)向集胞藻PCC6803中導(dǎo)入1拷貝的-pdc-同時(shí)敲除PHB合成途徑 (--) 并不能有效提高乙醇產(chǎn)量;類(lèi)似結(jié)果在對(duì)集胞藻PCC6803乳酸合成工程藻株的改造中也得到證實(shí)[59],意味著PHB途徑的敲除并不能有效影響或促進(jìn)工程藻株乙醇的產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)乙醇高產(chǎn)藻株Syn-HZ24中的糖原合成途徑 (,) 進(jìn)行了敲除,結(jié)果在無(wú)脅迫培養(yǎng)條件下乙醇產(chǎn)量沒(méi)有任何提高;雖然對(duì)工程藻株進(jìn)行缺氮處理時(shí),糖原合成缺失的藻株中乙醇合成的碳源分配會(huì)得到加強(qiáng),但其產(chǎn)量仍低于在無(wú)脅迫培養(yǎng)條件下的水平,意味著這種非正常培養(yǎng)狀態(tài)下提升并無(wú)法真正實(shí)現(xiàn)乙醇光合產(chǎn)量的有效提高 (未發(fā)表數(shù)據(jù))。作為藍(lán)細(xì)菌中最重要的碳匯機(jī)制,糖原代謝所扮演的角色并不是簡(jiǎn)單的碳流競(jìng)爭(zhēng)途徑,而是起到了全局性緩沖與“穩(wěn)壓器”的作用。糖原的敲除往往給細(xì)胞造成生理、代謝層面的負(fù)面影響,降低細(xì)胞對(duì)環(huán)境脅迫的適切性[60-61],進(jìn)而造成化學(xué)品光合合成整體效能的降低,這一現(xiàn)象在其他藍(lán)細(xì)菌化學(xué)品光合平臺(tái)的改造中也得到了證實(shí)[59,62]。

    3.3 輔因子工程

    以集胞藻PCC6803為例,促進(jìn)藍(lán)細(xì)菌乙醇光合性能提升的一個(gè)重要進(jìn)展是通過(guò)將NADH偏好性的AdhIIZM替換為NADPH偏好性的slr1192,極大地改善了代謝途徑與宿主背景代謝之間的適配性,也證明了在輔因子供給層面途徑對(duì)乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)進(jìn)行優(yōu)化的重要性。如前所述,本實(shí)驗(yàn)室在此前對(duì)PdcZM-slr1192途徑的體外重構(gòu)和動(dòng)態(tài)分析時(shí)發(fā)現(xiàn),NADPH對(duì)該途徑催化乙醇合成的m值為0.136 mmol/L,而飽和值超過(guò)0.5 mmol/L,而實(shí)際上集胞藻PCC6803中實(shí)際NADPH濃度在0.05–0.10 mmol/L左右[40-41],因此增加NADPH的供應(yīng)可能成為提高乙醇產(chǎn)量的有效策略。2016年,Choi等在集胞藻PCC6803野生型過(guò)量表達(dá)其內(nèi)源的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (基因編碼),有效提高了胞內(nèi)NADPH含量,可以使PCC6803在自養(yǎng)和混養(yǎng)體系中的生物量均有增加;而進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中,在引入了乙醇合成途徑 (pdc-yqhD,為來(lái)源于大腸桿菌的乙醇脫氫酶編碼基因,以NADPH為輔酶) 的工程藻株中過(guò)量表達(dá)時(shí),培養(yǎng)14 d后乙醇產(chǎn)量增加33%,由0.44 g/L提高到0.59 g/L[63]。通過(guò)輔因子工程來(lái)提高藍(lán)細(xì)菌乙醇光合性能,另一種潛在策略是改善乙醇脫氫酶輔因子的偏好性。Meng等采用理性設(shè)計(jì)策略成功優(yōu)化了來(lái)自德式乳桿菌的D-乳酸脫氫酶的輔因子偏好性,使之可以同樣利用NADH和NADPH作為催化輔因子,而且采用兩種輔因子的時(shí)候催化活性均有所提高[64]。如果類(lèi)似策略能夠成功應(yīng)用于A(yíng)dhII (slr1192) 的改造則等同于增加了該酶在藍(lán)細(xì)菌胞內(nèi)的輔因子供應(yīng)量 (從NADPH到NADPH+NADH),從而進(jìn)一步提高乙醇合成的穩(wěn)定性與效率。

    3.4 基于代謝網(wǎng)絡(luò)模型的改造靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

    雖然基于對(duì)局部代謝途徑的分析和傳統(tǒng)異養(yǎng)微生物代謝工程改造經(jīng)驗(yàn)的指導(dǎo),已經(jīng)在藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)和其他化學(xué)品光合平臺(tái)的開(kāi)發(fā)中進(jìn)行了大量遺傳操作來(lái)實(shí)現(xiàn)碳流的重新分配,但此類(lèi)直觀(guān)、簡(jiǎn)單的基因敲除缺乏對(duì)整個(gè)藍(lán)細(xì)菌代謝網(wǎng)絡(luò)全局調(diào)控和表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的充分理解,尤其缺乏對(duì)藍(lán)細(xì)菌特有的光合固碳系統(tǒng)本身特性以及其與中心代謝互作關(guān)系的考量。藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)的深度優(yōu)化需要更具針對(duì)性的代謝工程改造靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和改造策略設(shè)計(jì)?;谙到y(tǒng)生物學(xué)海量數(shù)據(jù)的積累和挖掘,在基因組測(cè)序基礎(chǔ)上的各種基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型的發(fā)展,已成為指導(dǎo)代謝工程改造不可或缺的有力工具,并廣泛應(yīng)用于預(yù)測(cè)改造靶點(diǎn),提高代謝通量。利用代謝網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行敲除靶點(diǎn)和敲除策略的設(shè)計(jì)以?xún)?yōu)化碳流、提高藍(lán)細(xì)菌乙醇光合合成效率的研究已經(jīng)有了初步進(jìn)展 (圖1)。

    2013年,Sengupta等以集胞藻PCC6803基因組規(guī)模代謝模型為基礎(chǔ),結(jié)合通量平衡分析 (Flux balance analysis,F(xiàn)BA)、最小化代謝調(diào)整 (Minimization of metabolic adjustment,MOMA) 以及調(diào)控開(kāi)關(guān)最小化 (Regulatory on/off minimization,ROOM) 等多種代謝建模技術(shù)進(jìn)行基因敲除效果分析。結(jié)果顯示,集胞藻PCC6803代謝網(wǎng)絡(luò)中通過(guò)敲除腺苷酸激酶基因 (Adenylate kinase,,)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(Phosphotransacetylase,,) 和乙酸激酶基因 (Acetate kinase,,) 可以顯著提高乙醇合成通量[65]。而前文中已經(jīng)提到的,Algenol公司在代謝工程改造實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)同時(shí)敲除集胞藻PCC6803中和基因確實(shí)提高了工程藻株中乙醇的產(chǎn)量,充分證明采用代謝網(wǎng)絡(luò)模型輔助預(yù)測(cè)敲除靶點(diǎn)的策略是有效的,有望提高藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)的改造效率和效果。

    2014年,Erdrich等基于集胞藻PCC6803的基因組規(guī)模的化學(xué)計(jì)量模型,結(jié)合CASOP (Computational approach for strain optimization aiming at high productivity,應(yīng)對(duì)高生產(chǎn)率變化的優(yōu)化計(jì)算方法) 和cMCS (Minimal cut set,最小切集) 系統(tǒng)分析并設(shè)計(jì)了集胞藻中乙醇合成工程藻株的改造和優(yōu)化方案,對(duì)大量基因敲除模擬的分析結(jié)果顯示,降低胞內(nèi)ATP和NADPH的比率可以促進(jìn)乙醇的合成,而二者比率的改變可以通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn):1) 降低ATP合成;2) 提高ATP消耗;3) 提高NADPH合成;4) 降低NADPH消耗;具體到實(shí)際的代謝工程改造,包括阻斷環(huán)式電子傳遞流、引入ATP代謝空循環(huán)機(jī)制等策略[66]。而上述研究結(jié)果在2015年Knoop等的后續(xù)研究中得到進(jìn)一步證實(shí)[67]。通過(guò)代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu),研究人員分析了集胞藻PCC6803中代謝產(chǎn)物合成過(guò)程中的化學(xué)計(jì)量特性和平衡關(guān)系,監(jiān)測(cè)了細(xì)胞生長(zhǎng)模式到產(chǎn)物合成模式中代謝系統(tǒng)特性的轉(zhuǎn)變,結(jié)果顯示PCC6803的線(xiàn)性電子傳遞鏈中ATP/NADPH比率 (1.28∶1) 與細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇合成的適配關(guān)系不同,對(duì)生物量積累而言最優(yōu)的ATP/NADPH比率為1.51,而乙醇合成最適比率則為1.17。這一結(jié)果與Endrich等研究工作中對(duì)ATP/NADPH比率調(diào)整需求的預(yù)測(cè)是相符的。

    2016年,Yoshikawa團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了鈍頂節(jié)旋藻NIES-39的基因組規(guī)模代謝模型 (包含746組代謝反應(yīng)、673種代謝產(chǎn)物),并結(jié)合FBA方法對(duì)藻株代謝改造進(jìn)行模擬和預(yù)測(cè)。鈍頂節(jié)旋藻本身就可以進(jìn)行乙醇合 成[28,68],而基因和途徑敲除模擬分析發(fā)現(xiàn),銨鹽比硝酸鹽更適合作為鈍頂節(jié)旋藻產(chǎn)醇的氮源;敲除NAD(P)H脫氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶等呼吸鏈功能相關(guān)基因以促進(jìn)NADPH供應(yīng)可能有助于促進(jìn)乙醇合成,將藻株固定的碳源向乙醇的分配比提高到43%;而通過(guò)敲除磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇酶或磷酸甘油酸變位酶等基因以阻斷酵解途徑可以將乙醇合成占碳源的分配比率提高至50%以上[69]。

    雖然現(xiàn)階段代謝模型基礎(chǔ)上所進(jìn)行的敲除靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、敲除策略設(shè)計(jì)等還普遍缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,但是相比于傳統(tǒng)的直觀(guān)層面上單純對(duì)競(jìng)爭(zhēng)旁路的敲除策略相比,此種技術(shù)體系下所提出的針對(duì)藍(lán)細(xì)菌固有生理功能和光合特性的改造策略,無(wú)疑會(huì)在未來(lái)成為提高乙醇光合合成效率的首要選擇。

    3.5 藍(lán)細(xì)菌新型基因組編輯技術(shù)的發(fā)展

    一直以來(lái),藍(lán)細(xì)菌的遺傳操作主要是通過(guò)同源重組將外源DNA向基因組上特點(diǎn)位點(diǎn)進(jìn)行整合,以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)或內(nèi)源基因的敲除。外源DNA可以通過(guò)直接吸收 (集胞藻PCC6803、聚球藻PCC7932以及聚球藻PCC7002等) 或接合轉(zhuǎn)移 (魚(yú)腥藻PCC7120和聚球藻UTEX2973等) 的方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞,其與基因組的整合則依靠抗性篩選和PCR-測(cè)序來(lái)進(jìn)行鑒定。而藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞的染色體往往具有多倍性 (即單個(gè)細(xì)胞中含有多條相同染色體)[70-71],在通過(guò)抗性篩選和PCR初篩,獲得基因組上攜帶有正確整合元件的轉(zhuǎn)化子后,通常還需要進(jìn)行一系列的傳代,以提高整合程度,獲得基因型純合的突變?cè)逯?。上述過(guò)程效率低、耗時(shí)長(zhǎng),難以滿(mǎn)足藍(lán)細(xì)菌高效遺傳操作,特別是基因組多靶點(diǎn)改造的需要。

    以CRISPR-CAS9為代表的新型基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)為藍(lán)細(xì)菌代謝工程領(lǐng)域提供了新的精確、高效的遺傳操作工具[72]?,F(xiàn)在基于CRISPR系統(tǒng)的藍(lán)細(xì)菌基因組編輯技術(shù)主要可以分為基因沉默和基因敲除兩類(lèi)。2016年Yao等[73]證明應(yīng)用核酸酶活性缺失的Ⅱ型CRISPR- CAS9系統(tǒng) (來(lái)源于釀膿鏈球菌) 可以在聚球藻PCC7942中對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行抑制,并成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)4個(gè)醛還原酶和醛脫氫酶基因表達(dá)的同時(shí)沉默 (抑制效率50%?95%)。Gordon等利用相同系統(tǒng)和類(lèi)似策略在聚球藻PCC7002中也實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因的表達(dá)調(diào)控,并應(yīng)用于代謝工程改造[74]。華盛頓大學(xué)Pakrasi教授的研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了利用CRISPR系統(tǒng)直接進(jìn)行基因敲除的研究,在聚球藻UTEX2973中通過(guò)CAS9蛋白的瞬時(shí)表達(dá)和另一種核酸酶Cpf1基因的穩(wěn)定表達(dá)分別實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因的無(wú)痕敲除和外源基因的整合[75-76],其中Cpf1系統(tǒng)在集胞藻PCC6803和魚(yú)腥藻PCC7120中也證實(shí)有效。而針對(duì)聚球藻PCC7942,Li等證明CRISPR-CAS9系統(tǒng)可以在基因組的靶點(diǎn)上引發(fā)雙鏈斷裂,進(jìn)而通過(guò)雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制極大地提高了外源DNA同源重組的效率、并降低了對(duì)同源臂長(zhǎng)度的要求[77]?,F(xiàn)階段,基于CRSIPR技術(shù)的各種藍(lán)細(xì)菌基因組編輯和代謝調(diào)控工具正在不斷涌現(xiàn),對(duì)代謝背景中多個(gè)靶點(diǎn)的同時(shí)改造也成為可能,結(jié)合3.4部分中所述的改造靶點(diǎn)預(yù)測(cè)技術(shù),無(wú)疑將在未來(lái)為藍(lán)細(xì)菌乙醇光合合成能力的提升提供新的動(dòng)力。

    4 藍(lán)細(xì)菌底盤(pán)細(xì)胞對(duì)乙醇脅迫的響應(yīng)與適應(yīng)機(jī)制解析

    對(duì)大多數(shù)藍(lán)細(xì)菌,尤其是應(yīng)用于代謝工程改造的幾種模式藻株而言,乙醇并不是其主要的天然代謝產(chǎn)物,乙醇在胞內(nèi)檢測(cè)不到存在或者含量極低,因此其對(duì)細(xì)胞生理和代謝的平衡與穩(wěn)定影響非常微弱。而引入了Pdc-AdhII途徑的工程藻株中,碳流、能量以及還原力的分配會(huì)發(fā)生顯著變化,乙醇甚至成為主要代謝產(chǎn)物,乙醇合成可以占到工程藻株固碳量的50%以 上[34,38],這就意味著工程藻株從光合作用到細(xì)胞生長(zhǎng)的各種生理和代謝活動(dòng)都可能受到顯著影響;另一方面,當(dāng)乙醇合成能力進(jìn)一步加強(qiáng),乙醇含量在培養(yǎng)體系中達(dá)到1%甚至1.5%時(shí),細(xì)胞生理和代謝活動(dòng)會(huì)受到脅迫,從細(xì)胞結(jié)構(gòu)到蛋白功能等各個(gè)層面都會(huì)受到擾動(dòng)和抑制[78-79],進(jìn)而影響工程藻株生長(zhǎng)和生產(chǎn)的性能。而現(xiàn)階段,藍(lán)細(xì)菌乙醇光合工程藻株的最高產(chǎn)量可達(dá)到 8 g/L左右,接近于乙醇1%的脅迫臨界濃度。因此,理解藍(lán)細(xì)菌對(duì)乙醇脅迫、乙醇合成的響應(yīng)與適應(yīng)機(jī)制,挖掘乙醇耐受性改造靶點(diǎn),對(duì)于藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)的繼續(xù)發(fā)展和優(yōu)化有著重要意義。

    4.1 藍(lán)細(xì)菌對(duì)外源添加乙醇脅迫的響應(yīng)與適應(yīng)機(jī)制

    天津大學(xué)合成微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室以集胞藻PCC6803為對(duì)象,以藍(lán)細(xì)菌對(duì)外源添加的高濃度乙醇的響應(yīng)和適應(yīng)機(jī)制為切入點(diǎn),在轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組等各個(gè)層面上進(jìn)行了較為系統(tǒng)的解析。2012年,研究人員以1.25%、1.5%和2%三種濃度的乙醇對(duì)集胞藻PCC6803細(xì)胞進(jìn)行脅迫處理,進(jìn)而通過(guò)iTRAQ LC-MS/MS技術(shù)分析到了細(xì)胞中1 509個(gè)蛋白表達(dá)情況的變化,其中乙醇脅迫處理24 h后有135個(gè)蛋白的表達(dá)有了顯著變化 (以1.5倍差異為閾值),而48 h后則達(dá)到293個(gè)。進(jìn)一步的分析顯示,面臨高濃度外源乙醇時(shí)集胞藻PCC6803采取了啟動(dòng)壓力應(yīng)激系統(tǒng) (General stress response)、調(diào)整細(xì)胞被膜組分與結(jié)構(gòu)、加強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成等多種策略來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫;此外,乙醇脅迫還誘導(dǎo)了PCC6803中與光合作用相關(guān)的多種蛋白的上調(diào)表達(dá),同時(shí)胞內(nèi)葉綠素a含量也有所提高[80],意味著細(xì)胞可能需要通過(guò)加強(qiáng)光合作用為脅迫應(yīng)激提供更多的物質(zhì)和能量。上述蛋白質(zhì)組分析的結(jié)果在后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組分析中得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證;此外,轉(zhuǎn)錄組分析還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),PCC6803會(huì)通過(guò)強(qiáng)化PHB合成和乙二醛途徑來(lái)緩解乙醇毒性[81]。

    針對(duì)全局性分析的結(jié)果,研究人員又結(jié)合基因敲除和回補(bǔ)策略,對(duì)其中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子系統(tǒng)的響應(yīng)進(jìn)行針對(duì)性分析。2014年,Song等證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子編碼基因直接與集胞藻PCC6803的乙醇耐受能力相關(guān),該基因的缺陷型藻株在1.5%濃度的乙醇脅迫下,生長(zhǎng)受到顯著抑制;而相應(yīng)的蛋白質(zhì)組分析顯示,該基因的缺失造成了54個(gè)蛋白表達(dá)的下調(diào)和87個(gè)基因的表達(dá)上調(diào)。該基因編碼蛋白可以直接與 1個(gè)16.6 kDa的小熱激蛋白 ()、1個(gè)鈉離子依賴(lài)型的碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (,) 以及1個(gè)二氧化碳濃縮機(jī)制相關(guān)蛋白CcmK () 編碼基因的上游序列直接結(jié)合[82]。2015年,Zhu等對(duì)集胞藻PCC6803轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)對(duì)乙醇脅迫的響應(yīng)進(jìn)行了更大范圍的研究,系統(tǒng)敲除了集胞藻PCC6803中34個(gè)假定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因,在乙醇脅迫條件下比較其與野生型的生長(zhǎng)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)、和的3個(gè)基因的敲除突變株與野生型相比生長(zhǎng)變差,而代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)上述3種轉(zhuǎn)錄因子的缺失在代謝物和代謝模塊層面引發(fā)的擾動(dòng)存在顯著的重疊現(xiàn)象,意味著其調(diào)控機(jī)制存在一定的交互性[83]。2015年Zhang等對(duì)PCC6803中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)與乙醇耐受性的相關(guān)性進(jìn)行了系統(tǒng)研究,通過(guò)對(duì)58個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的敲除和相應(yīng)的乙醇耐受性分析發(fā)現(xiàn),基因的突變體對(duì)1.5%的乙醇脅迫敏感,生長(zhǎng)受到明顯抑制。通過(guò)對(duì)缺失突變株代謝組學(xué)層面的分析發(fā)現(xiàn),集胞藻PCC6803中色氨酸合成、不飽和脂肪酸合成以及次級(jí)代謝產(chǎn)物合成等代謝模塊,以及乙酰CoA、ADP-葡萄糖、ATP、ADP、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、核糖-5-磷酸等代謝物與細(xì)胞的乙醇耐受性密切相關(guān)[84]。上述研究針對(duì)集胞藻PCC6803對(duì)外源添加的乙醇脅迫的相應(yīng)機(jī)制,系統(tǒng)采用了基因敲除-表型分析、轉(zhuǎn)錄組、代謝組和蛋白質(zhì)組層面的分析手段,對(duì)乙醇的脅迫機(jī)制和細(xì)胞響應(yīng)策略獲得了全面的認(rèn)知,也為進(jìn)一步采用代謝工程策略改造細(xì)胞本身的乙醇耐受性提供了豐富的 靶點(diǎn)。

    4.2 藍(lán)細(xì)菌乙醇光合工程藻株對(duì)內(nèi)源性乙醇合成的響應(yīng)與適應(yīng)機(jī)制

    德國(guó)弗萊堡大學(xué)的研究人員和荷蘭阿姆斯特丹大學(xué)的研究人員從另一種角度進(jìn)行了研究,有針對(duì)性地解析藍(lán)細(xì)菌乙醇光合合成工程藻株對(duì)內(nèi)源性合成的乙醇的響應(yīng)機(jī)制。2014年Dienst等將PpetJ-pdc-slr1192途徑通過(guò)穿梭載體導(dǎo)入PCC6803,獲得了乙醇高產(chǎn)藻株,18 d內(nèi)可以合成4.7 g/L的乙醇,在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中選取了4個(gè)時(shí)間點(diǎn),對(duì)乙醇合成株和野生型藻株在生理和轉(zhuǎn)錄水平上的差異進(jìn)行了分析。很有意思的是,在乙醇合成藻株中,在轉(zhuǎn)錄水平上藻藍(lán)蛋白β亞基編碼基因CpcB和兩組鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)也都持續(xù)降低,而表型水平上整個(gè)過(guò)程中葉綠素和藻藍(lán)蛋白含量顯著降 低[48],這一點(diǎn)與此前Qiao等[80]在外源乙醇脅迫處理時(shí)觀(guān)察到的葉綠素含量升高的現(xiàn)象恰恰相反。2015年Borirak等在集胞藻PCC6803中,采用PpsbA2-pdc-adhII構(gòu)建乙醇合成藻株,進(jìn)而通過(guò)蛋白組學(xué)定量分析發(fā)現(xiàn)工程藻株中有77種蛋白上調(diào),64種蛋白下調(diào)。功能聚類(lèi)分析表明,乙醇合成工程藻株中與二氧化碳濃縮、固定相關(guān)的很多蛋白,如卡爾文循環(huán)關(guān)鍵蛋白核酮糖1,5-二磷酸脫羧酶和碳濃縮機(jī)制核心功能蛋白CcmK1等,其含量普遍上調(diào),意味著乙醇合成導(dǎo)致的碳流分散促進(jìn)了工程細(xì)胞加快碳的固定以維持生長(zhǎng)和其他生理代謝所需 (工程藻株中碳源到乙醇的流向分配比高達(dá)65%);與Dienst等結(jié)果類(lèi)似的是發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)合成機(jī)器組分以及藻膽體組分 (CpcA、CpcB、CpcC1、CpcC2、CpcG2) 含量受到抑制和下調(diào);此外乙醇的合成還在胞內(nèi)引發(fā)了氧化應(yīng)激反應(yīng)(GshB含量升高)。

    值得注意的是,乙醇外源添加或內(nèi)源合成都會(huì)影響集胞藻PCC6803細(xì)胞中節(jié)律性蛋白的表達(dá)。在Borirak等構(gòu)建的工程藻中節(jié)律性蛋白 (Circadian clock protein,生物鐘蛋白,使藍(lán)細(xì)菌適應(yīng)晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)功能需要KaiA、KaiB和KaiC三種組分來(lái)完成) KaiA和KaiC顯著上調(diào),而此前Qiao等的蛋白組分析中發(fā)現(xiàn)外源乙醇脅迫會(huì)引發(fā)KaiB的表達(dá)提高,Wang等的轉(zhuǎn)錄組分析則發(fā)現(xiàn)KaiC的上調(diào)。上述研究表明,無(wú)論是內(nèi)源產(chǎn)生的乙醇還是外源添加的乙醇,都會(huì)引發(fā)藍(lán)細(xì)菌Kai系統(tǒng)組分的表達(dá)變化。在現(xiàn)階段藍(lán)細(xì)菌乙醇光合工程藻株的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中普遍采用了持續(xù)光照條件,而未來(lái)推向規(guī)?;囵B(yǎng)時(shí)在戶(hù)外晝夜交替條件下,該系統(tǒng)的擾動(dòng)所造成的潛在影響則值得引起重視[85]。

    上述的響應(yīng)機(jī)制在圖2中進(jìn)行了具體展示和歸納。

    圖2 集胞藻PCC6803對(duì)乙醇的動(dòng)態(tài)響應(yīng)機(jī)制示意圖

    5 展望

    乙醇是最早報(bào)道的、通過(guò)代謝工程手段改造藍(lán)細(xì)菌實(shí)現(xiàn)光合生物合成的化學(xué)品,也是最有代表性的藍(lán)細(xì)菌光合化學(xué)品。到目前為止,藍(lán)細(xì)菌乙醇合成技術(shù)還處于初級(jí)階段,乙醇產(chǎn)量較低 (小于10 g/L),合成強(qiáng)度低(不超過(guò) 0.5 g/(L·d)),相比較于已經(jīng)成熟的釀酒酵母乙醇合成等生物技術(shù)體系,其距離規(guī)?;囵B(yǎng)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走。但是,如上文中已經(jīng)展示的,蓬勃發(fā)展和廣泛應(yīng)用的系統(tǒng)生物技術(shù)體系已經(jīng)對(duì)藍(lán)細(xì)菌對(duì)乙醇的響應(yīng)和適應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了全面、立體的詮釋?zhuān)桓鞣N層面的代謝網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)潛在的藻株改造靶點(diǎn)和改造策略進(jìn)行了預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì);以CRISPR-CAS等技術(shù)為代表的先進(jìn)、高效的遺傳操作體系的發(fā)展將使得多靶點(diǎn)、多層次的精細(xì)改造和途徑調(diào)控成為可能,在可見(jiàn)的未來(lái),藍(lán)細(xì)菌乙醇光合藻株的性能有望迎來(lái)新的突破。同時(shí),發(fā)展高效的藍(lán)細(xì)菌乙醇光合藻株對(duì)其他化學(xué)品光合合成平臺(tái)的開(kāi)發(fā)具有很好的示范與啟示意義。藍(lán)細(xì)菌乙醇光合藻株核心代謝途徑簡(jiǎn)單、清楚,藻株培養(yǎng)和產(chǎn)物分析技術(shù)成熟、便捷,各種代謝工程和合成生物學(xué)策略可以很快實(shí)施和驗(yàn)證,從而為其他高值化學(xué)品的光合合成的實(shí)現(xiàn)和優(yōu)化提供概念和方向性的指引。

    光合固碳效率的提升將成為其中最具吸引力的發(fā)展方向。光合作用是藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)和化學(xué)品合成的基礎(chǔ),光合固碳效率從根本上決定著藍(lán)細(xì)菌化學(xué)品光合平臺(tái)的效能和潛力。Atsumi等的研究證實(shí)在聚球藻PCC7942中過(guò)量表達(dá)卡爾文循環(huán)關(guān)鍵蛋白1.5-二磷酸核酮糖羧化酶 (Rubisco),可以提高工程藻株中異丁醛的產(chǎn)量[22],表明通過(guò)改善光合作用效率來(lái)提高代謝物合成能力的策略是可行、有效的。在未來(lái),通過(guò)系統(tǒng)采用改造Rubisco等關(guān)鍵蛋白[86-87]、強(qiáng)化碳濃縮機(jī)制 (Carbon concentrating mechanism)[88]以及調(diào)控光呼吸系統(tǒng)[89]等策略,有望促使藍(lán)細(xì)菌工程藻株的光合效率得到進(jìn)一步提高。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所李寅研究員團(tuán)隊(duì)最近發(fā)現(xiàn),通過(guò)引入新的NADPH消耗途徑可以有效促進(jìn)光合固碳效率,加快工程細(xì)胞生長(zhǎng)速度[90],表明在代謝途徑設(shè)計(jì)的過(guò)程中將藍(lán)細(xì)菌光合固碳系統(tǒng)的特點(diǎn)納入考慮,有望實(shí)現(xiàn)平臺(tái)生長(zhǎng)性能與合成性能的協(xié)同提高。對(duì)于藍(lán)細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠(chǎng)而言,此前的主要設(shè)計(jì)和改造策略集中于胞內(nèi)固有碳流的重新分配上,而對(duì)于從源頭上強(qiáng)化光合固碳、為乙醇合成提供更強(qiáng)的物質(zhì)-能量動(dòng)力將是未來(lái)進(jìn)一步發(fā)展的必然選擇。隨著對(duì)藍(lán)細(xì)菌光合固碳、中心代謝以及生理功能等生理和代謝機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷加深,以及合成生物學(xué)和代謝工程手段的豐富和完善,更為高效、穩(wěn)定的藍(lán)細(xì)菌光合平臺(tái)必將成功構(gòu)建,結(jié)合乙醇合成途徑的優(yōu)化和代謝互作背景的適配調(diào)控,藍(lán)細(xì)菌平臺(tái)的乙醇光合合成能力將有望迎來(lái)質(zhì)的飛躍。

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    (本文責(zé)編 陳宏宇)

    Cyanobacteria cell factories for ethanol photosynthetic production: development and prospect

    Yunjing Qi1,2, Jialin Wang1, Guodong Luan2, Xiaoming Tan2, and Xuefeng Lü2

    1 College of Chemical Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, Shandong, China 2 Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, Shandong, China

    Bioethanol is one of the most promising and representative biofuel products. Photosynthetic production of ethanol using CO2and solar energy based on cyanobacteria is of great significance for research and application, due to the potential to reduce CO2emission and to provide renewable energy simultaneously. Here we review the history and updated development of cyanobacteria cell factories for ethanol photosynthetic production, the progress and problems in pathway optimization, chassis selection, and metabolic engineering strategies, and finally indicate the future development in this area.

    cyanobacteria, bioethanol, metabolic engineering, cell factory, ethanol tolerance

    10.13345/j.cjb.160457

    November 24, 2016; Accepted: January 24, 2017

    Guodong Luan. Tel: +86-532-80662711; E-mail: luangd@qibebt.ac.cn

    Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31600034).

    國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31600034)資助。

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