白藜蘆醇抑制叔丁基過氧化物誘導的外周血內(nèi)皮祖細胞損傷*

鄭 浩, 李占魯， 沈嘯華， 傅國勝

(1浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 杭州 310016； 2杭州市下沙醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 杭州 310058)

白藜蘆醇抑制叔丁基過氧化物誘導的外周血內(nèi)皮祖細胞損傷*

鄭 浩1, 2△, 李占魯2， 沈嘯華1， 傅國勝1

(1浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 杭州 310016；2杭州市下沙醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 杭州 310058)

目的： 觀察白藜蘆醇對叔丁基過氧化物誘導的人外周血內(nèi)皮祖細胞(EPC)凋亡的影響，探討其可能機制。方法: 密度梯度離心法獲取人外周血單個核細胞，培養(yǎng)4 d后，收集貼壁細胞。實驗分為對照組、叔丁基過氧化物誘導組和白藜蘆醇+叔丁基過氧化物組。采用二苯基四氮唑溴鹽(MTT)比色法和5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)ELISA法檢測EPC增殖能力；采用改良Boyden小室法檢測EPC增殖及遷移能力；Annexin V-FITC/PI染色及流式細胞術檢測EPC凋亡率；比色法檢測caspase-3活性；熒光探針H2DCF-DA法檢測細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)水平；Western blot檢測cleaved caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白的表達。結果: 白藜蘆醇能抑制叔丁基過氧化物誘導的EPC凋亡，并增加EPC增殖及遷移能力；白藜蘆醇降低EPC細胞內(nèi)ROS水平，抑制caspase-3的活性及cleaved caspase-3的蛋白水平，同時能促進Bcl-2及抑制Bax蛋白表達。結論: 白藜蘆醇對叔丁基過氧化物誘導的EPC凋亡有抑制作用，其機制可能與抗氧化應激有關。

白藜蘆醇； 內(nèi)皮祖細胞； 細胞凋亡； 氧化應激

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPC)不僅參與血管形成，同時也參與出生后血管生成，在促進缺血組織的血管新生過程中起主要的作用。EPC還能修復損傷的內(nèi)皮細胞，保持內(nèi)膜完整性從而抑制局部粥樣硬化斑塊及血栓的形成[1]。

研究顯示，高血脂、高血糖、高血壓等心血管危險因素很大程度上減少EPC的數(shù)量、損害其功能，而且外周循環(huán)中EPC數(shù)量及其增殖能力均有限，限制了其臨床應用[1-2]。最近的研究表明EPC數(shù)量減少、功能減退跟細胞凋亡有關[3]，而氧化應激損傷在EPC凋亡過程中起重要的作用[4]。

白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，研究顯示其能改善EPC數(shù)量和功能，抑制EPC衰老[5-6]。但目前尚無白藜蘆醇是否抗氧化應激損傷引起EPC凋亡的研究。本研究采用體外培養(yǎng)人外周血EPC，經(jīng)過叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，tBHP)處理制作氧化應激模型，擬觀察白藜蘆醇是否通過抗氧化應激，延緩EPC凋亡從而改善EPC功能。

材 料 和 方 法

1 主要材料與試劑

人纖維連接蛋白(human fibronectin，HFN)購自Chemicon；淋巴細胞分離液購自Cedarlane；EGM-2MV購自Clonetic； FITC標記荊豆凝集素I(UEA-I-FITC)、基質(zhì)細胞衍生因子(stromal cell-derived factor，SDF)-1α和白藜蘆醇購自Sigma；DiI標記的乙?；疞DL(acLDL-DiI)購自Molecular Probe；FITC標記的抗CD34單克隆抗體和APC標記的抗AC133單克隆抗體購自Becoton Dickinson；PE標記的抗血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR)2單克隆抗體購自Miltenyi Biotec；二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自華美生物工程公司；5-溴-2’-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine， BrdU)ELISA試劑盒購自Roche；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒和caspase-3活性比色法檢測試劑盒購自BioVision；H2DCF-DA活性氧檢測試劑盒購自Invitrogen；抗cleaved caspase-3、Bcl-2及Bax多克隆抗體購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 EPC的分離、培養(yǎng)與鑒定[7-9]取健康成人空腹外周血20 mL，密度梯度離心法獲取單個核細胞(mononuclear cells，MNCs)。將MNCs接種于HFN包被的培養(yǎng)板。EGM-2MV培養(yǎng)基(含EBM-2、5%胎牛血清、VEGF-A、hFGF-2、hEGF、IGF-1、維生素和抗生素)培養(yǎng)4 d，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗掉非貼壁細胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7 d，PBS洗掉非貼壁細胞，貼壁細胞供實驗用。

將貼壁細胞與acLDL-DiI (2.4 mg/L)37 ℃孵育1 h后,用2%多聚甲醛固定細胞10 min，PBS浸洗，將UEA-I-FITC(10 mg/L)加于上述標本37 ℃下再孵育1 h。多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定acLDL和UEA-I雙染色陽性細胞被認為是正在分化的EPC。用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞并計數(shù)。將2×105個貼壁細胞分別與PE標記的VEGFR-2，APC標記的AC133和FITC標記的CD34單克隆抗體，在4 ℃孵育30 min后，用PBS洗細胞2次，最后用300 μL PBS懸浮細胞后用流式細胞術檢測細胞表型。

2.2 實驗分組及處理 貼壁細胞隨機分為3組：對照組，含5%胎牛血清的EGM-2MV培養(yǎng)基(含EBM-2、VEGF-A、hFGF-2、hEGF、IGF-1、維生素和抗生素)；叔丁基過氧化物誘導組，100 μmol/L tBHP干預6 h；白藜蘆醇+叔丁基過氧化物組，不同濃度白藜蘆醇(1、10、25和50 μmol/L)預作用24 h后，再加入100 μmol/L tBHP干預6 h。

2.3 細胞增殖能力檢測[7，9-10]采用MTT比色法檢測EPC活性，在培養(yǎng)第7天消化細胞、計數(shù)，將等量EPC及200 μL EGM-2MV培養(yǎng)液接種到包被有人纖維連接蛋白的96孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入不同濃度的白藜蘆醇，24 h后再加入終濃度為100 μmol/L tBHP溶液繼續(xù)培養(yǎng)6 h，最后每孔加MTT (5 g/L) 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液，再加入二甲亞砜 (每孔150 μL)，于微量振蕩器充分振蕩10 min, 置酶標儀于波長490 nm處測吸光度A值，取6孔平均值。

在MTT比色法基礎上，我們采用BrdU ELISA法進一步檢測EPC增殖能力。在培養(yǎng)第7天消化細胞、計數(shù)，將等量EPC及200 μL EGM-2MV培養(yǎng)液接種到包被有人纖維連接蛋白的96孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入不同濃度的白藜蘆醇，24 h后再加入終濃度為100 μmol/L tBHP溶液繼續(xù)培養(yǎng)6 h，最后每孔加BrdU標記液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，加入Fix Denat使DNA變性，每孔加100 μL HRP標記的抗BrdU抗體，洗滌3次，每孔加入100 μL TMB底物液顯色，20 min后加入1 mol/L H2SO4終止反應，于微量振蕩器上振蕩1 min, 置酶標儀上以450 nm/630 nm雙波長測A值，即BrdU值，取6孔平均值。

2.4 細胞遷移能力檢測[8]采用改良Boyden小室法檢測EPC遷移能力。將200 μL培養(yǎng)液和100 μg/L SDF-1α加入改良的Boyden 小室的下室，將2×104EPC放在50 μL培養(yǎng)液注入上室，在37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)6 h。刮去濾膜上面的未移動細胞，用甲醇固定3～5 min，進行DAPI染色15～30 min，用蒸餾水沖洗，熒光顯微鏡下，隨機選擇3個顯微鏡視野(×100)計數(shù)遷移到低層的細胞。

2.5 細胞凋亡的檢測[9, 11]本實驗分析早期凋亡的差別。細胞在早期凋亡是僅僅能結合Annexin V(即Annexin V+/ PI-)。消化收集5×105細胞，分別放置于康氏管中，用500 μL Binding Buffer重懸，37 ℃培養(yǎng)90 min，然后加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，避光孵育5 min后上流式細胞儀檢測。

2.6 Caspase-3活性的測定[9]收集5×106細胞，加入50 μL細胞裂解液，吹打混勻，冰浴10 min，12 000×g離心10 min后收集上清液(即“細胞裂解物”)，-70 ℃保存。測定蛋白濃度，用50 μL稀釋緩沖液稀釋50～200 μg蛋白，置入微孔板內(nèi)，各孔中加入50 μL 的2× reaction buffer (含10 mmol/L DTT)，加入5 μL的4 mmol/L DEVD-pNA substrate(終濃度為200 μmol/L), 37oC孵育1～2 h，然后置酶標儀于波長400 nm處測A值。

2.7 細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的檢測[12]EPC內(nèi)ROS的濃度通過在細胞內(nèi)裝載熒光探針H2DCF-DA后用流式細胞術分析。tBHP及白藜蘆醇干預EPC后，加入10 μmol/L的H2DCF-DA，在37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)30 min，用無血清培養(yǎng)液洗去未進入細胞內(nèi)的H2DCF-DA，收集細胞，流式細胞術檢測ROS，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射光525 nm。

2.8 Western blot法檢測蛋白水平 收集細胞，加入細胞裂解液，冰上裂解10 min，離心收集細胞裂解物，置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩８鹘M取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后電轉移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h；TBST洗膜(15～20 min)3次，加入I 抗4 ℃過夜，TBST洗膜(15～20 min)3次，再加入辣根過氧化物酶標記的 II 抗孵育1 h，ECL顯影后，用凝膠成像系統(tǒng)掃描。

3 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間資料比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為有差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 EPC的分離與鑒定

剛分離獲得的MNCs是圓形的，體積較小，懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)4 d后形成了梭形的內(nèi)皮樣細胞，見圖1。通過共聚焦顯微鏡鑒定，UEA-I和acLDL雙染色陽性細胞被認為是正在分化的EPC(圖2)。流式細胞術檢測貼壁細胞表面標志，結果顯示其表達VEGFR2比率為(78.7±9.7)%，CD34比率為(31.3±4.2)%，AC133比率為(18.7±5.0)%，進一步證實為EPC。

2 白藜蘆醇對EPC增殖及遷移功能的影響

如圖3所示，白藜蘆醇可以明顯緩解tBHP對EPC增殖的抑制作用。MTT比色法檢測顯示， 100 μmol/L tBHP作用6 h后能顯著降低EPC的增殖能力，而50 μmol/L白藜蘆醇預處理24 h后，外周EPC的增殖能力較單純100 μmol/L tBHP組明顯增加(P<0.05)，并且25和50 μmol/L白藜蘆醇預先處理24 h后，EPC的增殖能力與對照組相比，無統(tǒng)計學差異。BrdU ELISA檢測顯示，100 μmol/L tBHP作用6 h后能顯著降低EPC的增殖能力，而25和50 μmol/L白藜蘆醇預處理24 h后，外周EPC的增殖能力較單純100 μmol/L tBHP組明顯增加(P<0.05)，并且50 μmol/L白藜蘆醇預先處理24 h后，EPC的增殖能力與對照組相比，無統(tǒng)計學差異。改良Boyden小室法檢測EPC遷移功能如圖4所示，100 μg/L SDF-1α加入改良的Boyden小室的下室后能顯著促進EPC的遷移能力，而100 μmol/L tBHP可以顯著抑制SDF-1α對EPC的遷移能力的促進作用，在白藜蘆醇25和50 μmol/L預作用24 h后，外周EPC的遷移能力較單純100 μmol/L tBHP組明顯增加(P<0.05)。

Figure 1.Morphological changes of EPC under inverted microscope (×200). A: mononuclear cells were plated on culture dishes just after isolated from peripheral blood; B: after 7 d of culture, nonadherent cells were removed and attached cells exhibited spindle-shaped, endothelial cell-like morphology.

圖1 倒置顯微鏡下EPC形態(tài)

Figure 2.Characterization of EPC under laser scanning confocal microscope (×400). The acLDL uptake (red, exci-ting wavelength 543 nm) and lectin binding (green, exciting wavelength 477 nm) were assessed under a laser scanning confocal microscope. Double positive cells appearing yellow in the overlay were identified as differentiating EPC.

圖2 激光共聚焦顯微鏡鑒定EPC

Figure 3.The effect of resveratrol on EPC proliferation measured by MTT assay (A) and BrdU assay (B). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vstBHP group.

圖3 白藜蘆醇對EPC增殖功能的影響

Figure 4.The effect of resveratrol (Res) on the migration ability of EPC (×200). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSDF-1α group;△P<0.05vsSDF-1α+tBHP group.

圖4 白藜蘆醇對EPC遷移功能的影響

3 白藜蘆醇對tBHP誘導EPC凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測EPC早期凋亡率顯示：100 μmol/L tBHP作用EPC 6 h可以明顯誘導EPC凋亡。白藜蘆醇與EPC培養(yǎng)24 h后，可以有效抑制tBHP誘導的EPC凋亡，EPC凋亡率隨著白藜蘆醇濃度的增加而降低，25 μmol/L白藜蘆醇即顯著減少凋亡細胞數(shù)量,50 μmol/L白藜蘆醇最為明顯 (P<0.05)，見圖5。

4 白藜蘆醇對EPC細胞內(nèi)ROS水平的影響

采用H2DCF-DA法檢測EPC細胞內(nèi)ROS水平。圖6結果顯示，100 μmol/L tBHP作用6 h后，EPC細胞內(nèi)ROS水平顯著增加，白藜蘆醇預處理24 h，EPC細胞內(nèi)的ROS水平呈劑量依賴性降低，在50 μmol/L時，降低ROS水平最為明顯。

5 白藜蘆醇抑制caspase-3活性及cleaved caspase-3蛋白的表達

我們觀察到白藜蘆醇抑制tBHP誘導的EPC凋亡后，進一步觀察了白藜蘆醇干預后是否伴隨著caspase-3活性及cleaved caspase-3蛋白表達改變。對caspase-3活性的檢測，我們同樣發(fā)現(xiàn)tBHP可以明顯增高caspase-3的活性(P<0.05)。白藜蘆醇預作用24 h后可以降低caspase-3活性，呈現(xiàn)明顯的劑量相關性。與單獨tBHP相比，10、25和50 μmol/L白藜蘆醇可以明顯降低caspase-3活性(圖7)。Western blot分析顯示，100 μmol/L tBHP可以促進cleaved caspase-3蛋白的表達，而加入白藜蘆醇預處理24 h可以顯著抑制cleaved caspase-3蛋白的表達，50 μmol/L白藜蘆醇作用24 h后對cleaved caspase-3蛋白表達的抑制作用最為顯著(圖8)，提示白藜蘆醇可能通過調(diào)節(jié)caspase-3活性及cleaved caspase-3蛋白表達而抑制tBHP誘導的EPC凋亡。

同時，我們觀察了白藜蘆醇對Bax及Bcl-2表達的影響。Western blot分析顯示100 μmol/L tBHP可以使促凋亡蛋白Bax表達增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達降低，而50 μmol/L白藜蘆醇預處理可以抑制tBHP對Bax及Bcl-2蛋白表達的影響，見圖9。

Figure 5.The effect of resveratrol (Res) on apoptosis of EPC detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vstBHP group.

圖5 白藜蘆醇對tBHP誘導的EPC凋亡的影響

討 論

本研究結果發(fā)現(xiàn)，tBHP能抑制EPC增殖及遷移能力，誘導EPC的凋亡，而白藜蘆醇能抑制tBHP誘導EPC的凋亡，恢復EPC的增殖及遷移能力。EPC凋亡是調(diào)節(jié)EPC數(shù)量、功能的重要機制之一[3]。

tBHP是用于誘導細胞氧化應激損傷的常用試劑，不易降解，與過氧化氫(H2O2)相比，其化學性質(zhì)更穩(wěn)定。tBHP能直接破壞膜結構，最終導致細胞或線粒體膜的破壞，進而模擬氧化應激損傷[13]。ROS在氧化應激所致的EPC凋亡和損傷中發(fā)揮重要的作用，與細胞凋亡存在非常密切的關系[14]。

Caspases是一組具有特異天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡過程中起著關鍵作用。Caspases的激活主要經(jīng)過線粒體依賴途徑(通過激活caspase-9)和死亡受體介導途徑(主要通過激活caspase-8)。上述途徑均可以激活下游執(zhí)行相關caspases，如caspase-3。

研究顯示，線粒體依賴途徑是細胞凋亡的主要誘導途徑[15]。線粒體是細胞凋亡最重要的調(diào)控靶點，也是ROS的主要來源，其易受氧化應激損傷。線粒體損傷，產(chǎn)生釋放ROS，進而誘導線粒體通透性轉化孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開放，導致各種凋亡調(diào)節(jié)因子，如細胞色素C釋放到胞質(zhì)中，激活caspase 3，隨后caspase 3的切割底物RARP被切割激活后形成DNA碎片，從而導致細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白質(zhì)，如Bax和Bcl-2在mPTP開放及細胞色素C釋放的調(diào)控中起重要的作用。Bax是促凋亡蛋白，促進mPTP的開放，導致細胞色素C釋放，而Bcl-2是抗凋亡蛋白，抑制mPTP開放，阻斷細胞色素C的釋放。本研究結果顯示，tBHP能增加EPC細胞內(nèi)ROS，促進Bax及caspase-3蛋白表達，增強caspase-3活性，抑制Bcl-蛋白的表達，而白藜蘆醇能明顯抑制tBHP的上述作用，抑制tBHP誘導的EPC凋亡。

Figure 6.The effect of resveratrol on ROS generation. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vstBHP group.

圖6 白藜蘆醇對EPC細胞內(nèi)ROS水平的影響

Figure 7.The effect of resveratrol on caspase-3 activity of EPC. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vstBHP group.

圖7 白藜蘆醇對EPC caspase-3活性的影響

細胞凋亡與細胞的數(shù)量及其功能密切相關。本研究顯示白藜蘆醇通過抑制細胞內(nèi)ROS生成所致的氧化應激損傷，進而抑制caspase-3表達及活性，抑制EPC的凋亡，促進EPC的數(shù)量和功能，在某種程度上

Figure 8.The effect of resveratrol on the protein levels of cleaved caspase-3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vstBHP group.

圖8 白藜蘆醇對EPC cleaved caspase-3蛋白水平的影響

為粥樣硬化性和缺血性心血管疾病提供了一種重要的、潛在的細胞治療手段。

Figure 9.The effect of resveratrol on the protein expression of Bcl-2 and Bax. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vstBHP group.

圖9 白藜蘆醇對EPC Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Resveratrol attenuates apoptosis of endothelial progenitor cells induced by tert-butyl hydroperoxide

ZHENG Hao1, 2, LI Zhan-lu2, SHEN Xiao-hua1, FU Guo-sheng1

(1DepartmentofCardiovascularDiseases,SirRunRunShawHospital,CollegeofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310016,China;2DepartmentofCardiovascularDiseases,HangzhouXiashaHospital,Hangzhou310058,China.E-mail:zhenghao@medmail.com.cn)

AIM: To investigate the effect of resveratrol on the apoptosis of endothelial progenitor cells (EPC) induced by tert-butyl hydroperoxide (tBHP) and the underlying mechanisms. METHODS: Total mononuclear cells were isolated from peripheral blood by density gradient centrifugation, and the cells were cultured on fibronectin-coated culture dishes. After 4 d of culture, attached cells were divided into control group, tBHP group, and resveratrol plus tBHP group (pretreated with resveratrol for 24 h and then cultured with 100 μmol/L tBHP for 6 h). The proliferation and migration abilities of the EPC were assessed by MTT assay, BrdU incorporation assay and modified Boyden chamber assay. The proportion of apoptotic EPC was determined by flow cytometry after staining with fluorescein isothiocyanate -conjugated Annexin V and propodium iodide. The level of reactive oxygen species (ROS) was determined by H2DCF-DA method. Caspase-3 activity was assay using a caspase-3 colorimetric assay kit. The protein levels of cleaved caspase-3, Bcl-2 and Bax were determined by Western blot. RESULTS: Resveratrol decreased EPC apoptosis induced by tBHP in a dose-dependent manner. Moreover, resveratrol increased the proliferation and migration abilities of the EPC. Resveratrol decreased intracellular ROS level, caspase-3 activity and the protein level of cleaved caspase-3. Resveratrol also decreased protein expression of Bax and increased protein expression of Bcl-2. CONCLUSION: Resveratrol attenuates EPC apoptosis induced by oxidative stress, and its mechanisms may be related to protecting the mitochondrial function.

Resveratrol; Endothelial progenitor cells; Apoptosis; Oxidative stress

1000- 4718(2017)06- 1073- 07

2016- 12- 20

2017- 04- 12

國家自然科學青年基金資助項目(No. 30900615)；浙江省自然科學基金資助項目(No. Y2090173)

R363.2+1; R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.019

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