Sonic hedgehog信號(hào)通路與食管癌放射抗拒的相關(guān)性研究*

賀昱霖， 劉佳琪， 劉 群， 李 歡， 龍 輝， 孟忠吉， 吳清明△

(武漢科技大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院， 2附屬天佑醫(yī)院消化內(nèi)科， 湖北 武漢 430065；3十堰市太和醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究所， 湖北 十堰 442000)

Sonic hedgehog信號(hào)通路與食管癌放射抗拒的相關(guān)性研究*

賀昱霖1,3， 劉佳琪1， 劉 群2， 李 歡2， 龍 輝2， 孟忠吉3， 吳清明1△

(武漢科技大學(xué)1醫(yī)學(xué)院，2附屬天佑醫(yī)院消化內(nèi)科， 湖北 武漢 430065；3十堰市太和醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究所， 湖北 十堰 442000)

目的： 研究Sonic hedgehog (Shh)信號(hào)通路在食管癌放射抗拒中的作用及機(jī)制。方法: 以人食管癌細(xì)胞Eca109為親本株，通過X射線反復(fù)照射(累計(jì)照射劑量60 Gy)誘導(dǎo)形成放射抗拒細(xì)胞株Eca109R。分別采用集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞放射敏感性，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力的變化，來證實(shí)放射抗拒細(xì)胞株Eca109R的放射抗拒性。免疫熒光及Western blot檢測Eca109R和親本細(xì)胞Eca109內(nèi)Gli1蛋白與Shh蛋白的表達(dá)。結(jié)果: 集落形成實(shí)驗(yàn)顯示2 Gy的X線照射后，Eca109和Eca109R細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)(SF2)分別為0.499±0.042和0.937±0.013；同時(shí)，CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，Eca109R細(xì)胞的活力抑制率明顯低于Eca109細(xì)胞(P<0.05)，證實(shí)Eca109R細(xì)胞有明顯的放射抗拒性，誘導(dǎo)形成放射抗拒株成功。免疫熒光結(jié)果顯示Eca109R細(xì)胞中Gli1表達(dá)明顯高于Eca109細(xì)胞(P<0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Eca109R細(xì)胞中的Gli1與Shh蛋白表達(dá)明顯高于Eca109細(xì)胞(P<0.05)。結(jié)論: 食管癌放射抗拒性的產(chǎn)生可能與Shh信號(hào)通路相關(guān)蛋白的過表達(dá)有關(guān)。

食管癌； 放射抗拒性； Sonic hedgehog信號(hào)通路

食管癌(esophageal cancer)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率位于惡性腫瘤的第8位，死亡率位于第6位[1-2]，放射治療是最有效的治療手段之一，但放射治療可能引起腫瘤對(duì)放療產(chǎn)生抗拒性。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，Sonic hedgehog (Shh)信號(hào)通路與消化道腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]，Gli1是Shh信號(hào)通路下游的轉(zhuǎn)錄因子，Gli1表達(dá)水平的上調(diào)代表Shh信號(hào)通路的激活,食管鱗癌中存在Shh信號(hào)通路相關(guān)基因的高表達(dá)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)通過反復(fù)照射食管癌細(xì)胞系Eca109，建立食管癌放射抗拒細(xì)胞系，并檢測細(xì)胞中Gli1與Shh蛋白的表達(dá)，探究Shh信號(hào)通路與食管癌放射抗拒性之間的關(guān)系，為臨床提高食管癌放療療效提供新的方案和依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株、主要試劑與儀器

人食管癌細(xì)胞株Eca109(由十堰太和醫(yī)院李勝保博士惠贈(zèng))；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青公司產(chǎn)品)；CCK-8試劑盒(Sigma)；抗Gli1抗體和抗Shh抗體(北京博奧森公司)。二氧化碳培養(yǎng)箱和超凈工作臺(tái)(Thermo Fisher)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Eca109細(xì)胞系于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞照射 采用Varian 2300直線加速器6 MV X射線照射，照射野6 cm×4 cm，源靶距80 cm，培養(yǎng)瓶表面覆蓋1.5 cm厚的補(bǔ)償塊，吸收劑量率為2 Gy/min。取指數(shù)生長期Eca109細(xì)胞1瓶，用直線加速器照射2 Gy、1 min。之后繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待照射后細(xì)胞穩(wěn)定生長并增長至接近長滿瓶底時(shí)，用0.25%胰蛋白酶(含0.25%EDTA)消化細(xì)胞，重新接種培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖進(jìn)入指數(shù)生長期時(shí)，再次X射線照射2 Gy、1 min。重復(fù)以上過程，照射30次，共60 Gy。然后傳代培養(yǎng)至細(xì)胞形態(tài)、增殖狀態(tài)穩(wěn)定，即篩選得到放射抗拒細(xì)胞系，將該放射抗拒細(xì)胞命名為Eca109R。繼續(xù)培養(yǎng)14 d后取部分細(xì)胞凍存，部分繼續(xù)傳代培養(yǎng)，在不再照射的情況下常規(guī)傳代>50代，仍保持較高的放射抗拒性。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞單層貼壁后指數(shù)生長期的細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異。

2.4 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞放射敏感性 將指數(shù)生長期Eca109細(xì)胞和Eca109R細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后制備成單細(xì)胞懸液，根據(jù)不同細(xì)胞數(shù)目(4×102、4×102、8×102、1×103和1.2×103)接種于6孔板，貼壁12 h后，進(jìn)行細(xì)胞照射，照射劑量分別為0、2、4、6和8 Gy，繼續(xù)培養(yǎng)14 d，出現(xiàn)肉眼可見的集落。用甲醇固定，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)集落數(shù)(>50個(gè)細(xì)胞的集落)。用單擊多靶模型計(jì)算細(xì)胞放射敏感性參數(shù)，包括平均致死劑量(mean lethal dose，D0)、準(zhǔn)閾劑量(quasi-threshold dose，Dq)、外推值(extrapolation value，N)以及照射2 Gy后細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(survival fraction at 2 Gy，SF2)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力 取經(jīng)過2、4、6和8 Gy劑量照射對(duì)數(shù)期生長的Eca109和Eca109R細(xì)胞，分別將其制成單細(xì)胞懸液后并計(jì)數(shù)，接種于96孔板，每孔約5 000個(gè)細(xì)胞，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后加入10 μL CCK-8溶液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長下測各孔吸光度(A)值，根據(jù)各組細(xì)胞在450 nm下的A值，用公式計(jì)算細(xì)胞活力抑制率，抑制率(IR)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 免疫熒光檢測Gli1蛋白的表達(dá) 制備Eca109和Eca109R細(xì)胞爬片，甲醇固定15 min，山羊血清封閉10 min，加Gil1抗體(1∶100)，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，加 II 抗，避光孵育1.5 h，PBS 洗3次，每次10 min，DAPI復(fù)染10 min，封片，熒光顯微鏡鏡檢照相。

2.7 Western blot檢測Gli1和Shh蛋白的表達(dá) 用RIPA裂解液分別提取Eca109細(xì)胞和Eca109R細(xì)胞的總蛋白，用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度，煮沸變性，每孔加樣35 μg蛋白，采用SDS-PAGE(2 h)分離蛋白，之后轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，I 抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，II 抗室溫下孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白的表達(dá)，對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 14.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Eca109細(xì)胞和Eca109R細(xì)胞形態(tài)學(xué)

相差顯微鏡下可見2種細(xì)胞呈單層貼壁生長，高倍鏡下見Eca109R細(xì)胞呈不規(guī)則梭型，細(xì)胞核小，細(xì)胞質(zhì)顆粒密集；Eca109細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則多邊形，細(xì)胞核中染色體折光性強(qiáng)，見圖1。

2 Eca109細(xì)胞和Eca109R細(xì)胞放射敏感性

Eca109細(xì)胞與Eca109R細(xì)胞照射2、4、6和8 Gy劑量后，用單擊多靶模型擬合，Eca109與Eca109R細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)見圖2。2組細(xì)胞對(duì)應(yīng)劑量的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可見Eca109R細(xì)胞有明顯的放射抗拒性。相關(guān)放射生物學(xué)參數(shù)見表1，Eca109R細(xì)胞D0、Dq和N值均高于Eca109細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Figure 1.Observation of cell morphology (optical microscope, ×400).

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

Figure 2.The survival fractions of the Eca109 cells and Eca109R cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsEca109.

圖2 Eca109與Eca109R細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的比較

3 Eca109細(xì)胞和Eca109R細(xì)胞活力的變化

經(jīng)過不同劑量照射后，Eca109R細(xì)胞各個(gè)劑量的活力抑制率均明顯低于Eca109細(xì)胞對(duì)應(yīng)劑量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

4 Eca109R細(xì)胞高表達(dá)Shh和Gli1蛋白

Gli1蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量是118 kD，Shh蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量是50 kD，內(nèi)參照蛋白β-actin的相對(duì)分子質(zhì)量是42 kD。結(jié)果顯示，Eca109細(xì)胞和Eca109R細(xì)胞中均有Gli1蛋白和Shh蛋白的表達(dá)，但Eca109R細(xì)胞中Gli1蛋白和Shh蛋白的表達(dá)明顯高于Eca109細(xì)胞，見圖4。

5 Eca109R中Gli1蛋白向細(xì)胞核聚集

Eca109和Eca109R 細(xì)胞胞核及胞漿均有Gli1蛋白表達(dá)，Eca109R中大部分細(xì)胞的胞漿Gli1蛋白向細(xì)胞核聚集。Eca109與Eca109R 細(xì)胞的免疫熒光陽性細(xì)胞率分別為52.3%±0.035%和87.6%±0.021%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

表1 X射線照射對(duì)Eca109與Eca109R細(xì)胞放射生物學(xué)參數(shù)的影響

N: extrapolation value; D0: mean lethal dose; Dq: quasi-threshold dose; SF2: survival fraction at 2 Gy.

Figure 3.The inhibitory rate of the cell viability. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsEca109.

圖3 細(xì)胞活力抑制率的比較

討 論

我國屬于食管癌高發(fā)地區(qū)，放射治療是最有效的治療手段之一，但不同患者對(duì)放療的敏感性不同，療效差異大，究其原因，除了與腫瘤靶區(qū)勾畫、劑量要求不一等因素有關(guān)外，腫瘤細(xì)胞自身對(duì)放射線就存在一定的抗拒性，也成為導(dǎo)致放療療效有限甚至失敗的重要原因。目前，對(duì)于腫瘤細(xì)胞放射抗拒機(jī)制的研究已經(jīng)有很多，涉及了多種復(fù)雜的因素，如細(xì)胞周期紊亂、DNA的損傷、修復(fù)，放射所致細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變、血管形成、細(xì)胞微環(huán)境、細(xì)胞的凋亡、分化等[7]。Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由Shh配體、2個(gè)跨膜蛋白質(zhì)受體Ptch和Smo組成的受體復(fù)合物以及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白(Gli1、Gli2和Gli3)等組成。在沒有Shh配體信號(hào)刺激時(shí)，Ptch抑制Smo的活性。當(dāng)Shh與Ptch結(jié)合后，解除了Ptch對(duì)Smo的抑制，釋放的Smo進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)下傳，激活下游轉(zhuǎn)錄因子Gli家族，調(diào)節(jié)包括Wnt、Ptc、cyclin D1、N-Myc在內(nèi)的多種靶基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致與細(xì)胞增殖、凋亡等相關(guān)的事件發(fā)生[8]。Gli1是Shh下游靶基因的強(qiáng)激活子，被認(rèn)為是Shh信號(hào)通路的可信標(biāo)志。Shh信號(hào)通常在成人正常組織中不表達(dá)，僅在參與組織的修復(fù)時(shí)激活。成人Shh信號(hào)通路過度激活可導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖、抑制細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。近年來已有多項(xiàng)研究表明，Shh信號(hào)通路的異常激活與多種腫瘤形成有關(guān)，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌和結(jié)腸癌等[9-12]，而且在對(duì)浸潤性乳腺癌患者進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)癌組織中Shh、Ptch-1、Gli1和Smo的mRNA呈高表達(dá)的患者腫瘤復(fù)發(fā)率高[13]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，人食管鱗癌組織中Shh的陽性表達(dá)明顯高于癌旁組織，且Shh蛋白的表達(dá)與食管鱗癌患者的TNM分期有關(guān)[14]。因此，進(jìn)一步研究Shh信號(hào)通路與食管癌的關(guān)系具有重要意義。

Figure 4.The protein expression of Shh and Gli1 in the Eca109 cells and Eca109R cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsEca109.

圖4 Eca109細(xì)胞與Eca109R細(xì)胞中Shh與Gli1蛋白表達(dá)水平的比較

Figure 5.Observation of the Gli1 immunofluorescence staining (fluorescence microscope, ×400).

圖5 Gli1的免疫熒光染色

本實(shí)驗(yàn)利用X射線反復(fù)照射人食管癌細(xì)胞系Eca109，誘導(dǎo)出放射抗拒細(xì)胞系Eca109R，應(yīng)用單擊多靶模型進(jìn)行計(jì)算后，得出的放射生物學(xué)參數(shù)顯示Eca109R細(xì)胞的N 值、D0及Dq均增大，提示抗拒株Eca109R細(xì)胞比親本株Eca109細(xì)胞更具放射抗性，同時(shí)，細(xì)胞活力抑制率提示Eca109R細(xì)胞的活力明顯高于Eca109，證實(shí)了Eca109R細(xì)胞放射抗性的產(chǎn)生。Western blot結(jié)果顯示Gli1蛋白與Shh蛋白在Eca109R細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于Eca109細(xì)胞，而免疫熒光結(jié)果顯示Eca109R細(xì)胞內(nèi)Gli1蛋白呈現(xiàn)與親本細(xì)胞顯著異常的表達(dá)水平和模式。已經(jīng)有研究表明，Shh信號(hào)通路的激活與食管鱗癌的發(fā)展有關(guān)，食管鱗癌中存在Shh信號(hào)通路相關(guān)基因的高表達(dá)，而高表達(dá)Gli1的食管鱗癌患者對(duì)放射治療不敏感[6, 15]，這與我們的研究結(jié)果是一致的，因此，Shh信號(hào)通路的激活可能與食管鱗癌的放射抗拒性有關(guān)。Shh蛋白表達(dá)與Gli1蛋白表達(dá)一致，說明可能由于Shh信號(hào)通路上游的配體過表達(dá)，引起Gli1蛋白表達(dá)上調(diào)，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖。

食管癌放射抗拒性形成的機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，有待進(jìn)一步深究。通過本實(shí)驗(yàn)，建立了食管癌放射抗拒細(xì)胞系，證實(shí)了引起食管癌放射抗拒的重要原因之一是Shh信號(hào)通路的過度激活，為進(jìn)一步研究Shh信號(hào)通路的激活誘導(dǎo)放射抗拒的機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，Shh信號(hào)通路的其它相關(guān)分子如Ptch-1、Smo等在Eca109R細(xì)胞的表達(dá)情況有待于進(jìn)一步完善。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍, 羅 森)

Relationship between Sonic hedgehog signaling pathways and radioresistance of esophageal cancer

HE Yu-lin1, 3, LIU Jia-qi1, LIU Qun2, LI Huan2, LONG Hui2, MENG Zhong-ji3, WU Qing-ming1

(1SchoolofMedicine,2DepartmentofGastroenterology,AffiliatedTianyouHospital,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430065,China;3InstituteofBiomedicine,TaiheHospitalofShiyanCity,Shiyan442000,China.E-mail:wuhe9224@sina.com)

AIM: To investigate the potential role of Sonic hedgehog (Shh) signaling pathways in the radioresistance of esophageal cancer. METHODS: Radioresistant cell line Eca109R was established by repeating X-ray irradiation at dose of 60 Gy in total using Eca109 cells as parental cells. The radiosensitivity of the parental and radioresistant cells was confirmed by colony formation assay. The cell viability was detected by CCK-8 assay. The intracellular protein levels of Shh and Gli1 were determined by Western blot and immunofluorescence.RESULTS: The survival fractions at dose of 2 Gy for Eca109R cells and Eca109 cells were 0.937±0.013 and 0.499±0.042, respectively. The inhibitory rate of cell viability decreased gradually in the Eca109R cells (P<0.05), suggesting that the radioresistant cell line was successfully established. The results of Western blot indicated that the protein expression of Shh and Gli1 was much higher in the Eca109R cells than that in the Eca109 cells (P<0.05). Immunofluorescence staining showed that Gli1 was expressed in the cytoplasm and nucleus, and presented nuclear clustering in the Eca109R cells. The positive rate of Gil1 expression in Eca109 cells was 52.3%± 0.035%, while that in Eca109R cells was 87.6%±0.021% (P<0.05).CONCLUSION: The radioresistance of esophageal cancer may be related to the activation of Shh signaling pathways with over-expression of Gli1 and other related proteins.

Esophageal cancer; Radioresistance; Sonic hedgehog signaling pathways

1000- 4718(2017)06- 1043- 05

2016- 11- 30

2017- 02- 10

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2014CFB818)；湖北省醫(yī)學(xué)領(lǐng)軍人才工程補(bǔ)助

R735.1; R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.014

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