CARMA3基因敲減對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116生長和侵襲轉(zhuǎn)移的抑制*

劉 枋， 林萬松， 陳淑萍， 葉韻斌△

(1福建省腫瘤醫(yī)院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤免疫學(xué)研究室， 2福建省腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350014)

CARMA3基因敲減對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116生長和侵襲轉(zhuǎn)移的抑制*

劉 枋1, 2， 林萬松1, 2， 陳淑萍1, 2， 葉韻斌1, 2△

(1福建省腫瘤醫(yī)院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤免疫學(xué)研究室，2福建省腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350014)

目的： 探討CARMA3基因在人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116生長和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制。方法: 選取高表達(dá)CARMA3的人結(jié)腸癌細(xì)胞株。應(yīng)用慢病毒技術(shù)敲減CARMA3基因，puromycin篩選后構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HCT116-shCARMA3細(xì)胞株。Real-time PCR和Western blot鑒定 mRNA和蛋白表達(dá)的抑制情況。WST-1法和RTCA S16系統(tǒng)分析細(xì)胞增殖情況。集落形成實(shí)驗(yàn)觀察集落形成。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。顯微鏡下觀察上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)形態(tài)變化。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲能力的改變。Western blot分析相關(guān)分子變化，探討可能機(jī)制。結(jié)果: 4株人結(jié)腸癌細(xì)胞株中HCT116細(xì)胞的CARMA3 mRNA和蛋白表達(dá)量最高，構(gòu)建穩(wěn)定沉默CARMA3的HCT116-shCARMA3細(xì)胞株，其中HCT116-shCARMA3-93細(xì)胞中CARMA3 的mRNA和蛋白受抑制最明顯，將其作為細(xì)胞模型。相比于對(duì)照組，HCT116-shCARMA3-93細(xì)胞形態(tài)發(fā)生EMT逆轉(zhuǎn)，其增殖、集落形成、遷移和侵襲能力明顯下降(P<0.01)。HCT116-shCARMA3-93的G0/G1細(xì)胞所占比例明顯升高，S期細(xì)胞比例相應(yīng)下降(P<0.05)。信號(hào)通路分子Bcl10和NF-κB表達(dá)明顯下調(diào)，MALT-1變化不明顯；細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1顯著下調(diào)，cyclin A表達(dá)略有下降；侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子MMP-2和MMP-9的表達(dá)下調(diào)，MMP-7未見改變，TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)上調(diào)；EMT相關(guān)分子E-cadherin的表達(dá)水平升高，N-cadherin、Snail、Slug和Twist的表達(dá)水平呈不同程度降低。結(jié)論: CARMA3可通過改變細(xì)胞周期和侵襲轉(zhuǎn)移分子的表達(dá)、調(diào)控EMT來影響結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的生長和侵襲轉(zhuǎn)移。這可能與NF-κB信號(hào)通路發(fā)生改變有關(guān)。

CARMA3； 結(jié)腸癌； 慢病毒； 細(xì)胞生長； 細(xì)胞遷移； 細(xì)胞侵襲

結(jié)腸癌是我國最常見的消化道腫瘤之一。2015年中國結(jié)直腸癌新增病例37.63萬，死亡19.1萬，發(fā)病率和致死率均位居第5位，呈逐年上升趨勢(shì)[1]。結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，篩選參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵性靶點(diǎn)，選擇性阻斷腫瘤相關(guān)信號(hào)通路是結(jié)腸癌治療的研究方向。Caspase 募集結(jié)構(gòu)域膜相關(guān)鳥苷酸激酶蛋白3(caspase recruitment domain membrane-associated guanylate kinase protein 3，CARMA3)，又稱CARD10或Bimp1，屬于膜相關(guān)鳥苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinase，MAGUK)家族成員，高表達(dá)于結(jié)腸癌等多種實(shí)體瘤。CARMA3異常表達(dá)可激活腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，發(fā)揮促癌作用。多篇文獻(xiàn)證實(shí)CARMA3通過CARMA3-Bcl10-MALT-1復(fù)合物(CBM復(fù)合物)誘導(dǎo)經(jīng)典的核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路。NF-κB與細(xì)胞增殖分化、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和腫瘤血管新生密切相關(guān)[2-3]。關(guān)于CARMA3在結(jié)腸癌生長和侵襲轉(zhuǎn)移方面的研究，目前罕見報(bào)道，機(jī)制尚不清楚。本研究以高表達(dá)CARMA3的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過慢病毒技術(shù)敲減CARMA3，分析CARMA3調(diào)控細(xì)胞生長、遷移、侵襲和EMT的可能機(jī)制，旨在從基礎(chǔ)理論角度探究以CARMA3為靶點(diǎn)治療結(jié)腸癌所具有的臨床應(yīng)用價(jià)值。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29、SW480、SW620和人胚腎細(xì)胞株293T購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

2 主要試劑

質(zhì)粒(sheGFP和shCARMA3)、DMEM培養(yǎng)基和McCoy’s 5A培養(yǎng)基購自Gibco；質(zhì)粒和慢病毒表達(dá)系統(tǒng)購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司； NucleoBond Xtra Midi Kit購自MN；大腸桿菌DH5α、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000和引物購自Invitrogen；LightCycler 480 SYBR Green I Master熒光定量試劑盒購自Roche；Nuclear Extract Kit購自Millipore；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天公司；兔抗人CARMA3購自Sigma；鼠抗人NF-κB p65和兔抗人B細(xì)胞白血病淋巴瘤蛋白10(B-cell leukemia-lymphoma 10，Bcl10)、黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤易位蛋白1(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1，MALT-1)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug抗體購自Cell Signaling；兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1 (cyclin D1)、細(xì)胞周期蛋白A (cyclin A)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7，MMP-7)、金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)、金屬蛋白酶組織抑制物2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)、β-actin以及抗兔IgG II 抗、抗鼠IgG II抗購自Santa Cruz；兔抗人EMT因子Twist抗體購自Abcam；化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Thermo； BD CycletesTMPlus DNA Reagent Kit購自BD； WST-1試劑購自Roche；劃痕小室購自Ibidi； TranswellTM小室購自Millipore； Matrigel? Invasion Chambers購自Coring。

3 主要方法

3.1 慢病毒感染 按試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒大量抽提。質(zhì)粒(sheGFP和shCARMA3)序列詳見表1。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒和慢病毒表達(dá)系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，收集24 h和48 h病毒液。4 ℃、5 000 r/min離心5 min去除病毒液中的碎片,收集上清液。21 600 r/min繼續(xù)離心1.5 h，1 mL無血清培養(yǎng)液重懸沉淀，0.22 μmol/L過濾除菌獲得病毒濃縮液，-80 ℃保存。慢病毒感染前1 d，每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞(2 mL)至6孔板,次日棄舊培養(yǎng)液，同時(shí)加入相應(yīng)病毒液1 mL、McCoy’s 5A培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清)1.5 mL和15 μg polybrene，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，更換新鮮培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入1.5 mg/L puromycin篩選細(xì)胞。每3～4 d更換1次培養(yǎng)液。1～2周后，陽性集落逐漸形成，擴(kuò)大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定傳代的細(xì)胞株。

表1 對(duì)照組sheGFP和實(shí)驗(yàn)組shCARMA3的序列

Table 1.The sequences of sheGFP in negative control group and shCARMA3 in experimental group

shRNAnameshRNAsequencesheGFPTTCTCCGAACGTGTCACGTshCARMA3-91TCCTAGAAGTTCAGGAGAAshCARMA3-92CCTTCTACATTCGTGCCAAshCARMA3-93CTGCTCCATGATCCTCGATshCARMA3-94CAGGGAGTGTGACACTTAA

3.2 Real-time PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) 用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,按照LightCycler 480 SYBR GreenⅠ Master 試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。CARMA3的上游引物為5’-CCCCTAAGAGATCCTTCAGCAG-3’，下游引物為5’-CCACACGCTGTCAGAGGATG-3’，產(chǎn)物長度為104 bp；β-actin的上游引物為5’-TGGCACCACACCTTCTACA-3’，下游引物為5’-AGCACAGCCTGGATAGCA-3’， 產(chǎn)物長度為164 bp。擴(kuò)增條件為 95 ℃ 15 min； 95 ℃ 15 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 s， 共40個(gè)循環(huán)。

3.3 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞蛋白并定量。上樣蛋白為25 μg或40 μg，SDS- PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入1∶200～1∶1 000稀釋的 I 抗，4 ℃孵育過夜。次日TBST洗膜5 min×3次。HRP標(biāo)記的抗兔或鼠IgG II 抗(1∶2 000稀釋)繼續(xù)室溫孵育2 h。TBST洗膜5 min×3次。按1∶1配置化學(xué)發(fā)光顯影劑，避光孵育3～5 min后，經(jīng)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像。應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

3.4 WST-1法和RTCA S16系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 調(diào)整細(xì)胞密度至5×107/L，接種于96孔板，每孔100 μL，每組3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h，加入10 μL WST-1孵育2 h后檢測(cè)吸光度A值。繪制細(xì)胞活力曲線。調(diào)整細(xì)胞密度至1×108/L接種于96孔板，每孔100 μL，每組3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)72 h，應(yīng)用 RTCA S16 系統(tǒng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

3.5 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成能力 每孔接種500個(gè)細(xì)胞(2 mL)于6孔板，每隔3～4 d補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液。12～14 d后棄舊培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，甲醇固定30 min。 自然晾干后，每孔取600 μL結(jié)晶紫(1 g/L)染色20 min，PBS再洗滌2次，計(jì)算集落數(shù)。

3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 按試劑盒說明書進(jìn)行。

3.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的創(chuàng)傷愈合能力 調(diào)整細(xì)胞密度至7×109/L，接種到劃痕小室中，每孔100 μL，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待24 h細(xì)胞貼壁后，吸棄舊培養(yǎng)液，拔掉小室并加入2 mL新鮮培養(yǎng)液。37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察0 h、24 h、48 h創(chuàng)傷愈合情況。

3.8 體外遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 吸取10 μL纖連蛋白(1 g/L)均勻涂抹在TranswellTM下室的膜上，37 ℃培養(yǎng)4 h。用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至7×108/L，取100 μL細(xì)胞懸液加至上室，下室加入600 μL 含20% FBS的McCoy’s 5A培養(yǎng)液，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2孵育48 h后，用棉簽輕輕擦去上室膜上未遷移的細(xì)胞，PBS洗2次，甲醇固定30 min。自然晾干后，用1 g/L結(jié)晶紫染液染色20 min。棄染液，雙蒸水洗2次。200倍顯微鏡下，計(jì)數(shù)上、下、左、右、中5個(gè)不同視野的總細(xì)胞數(shù)取平均值。

3.9 體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 采用Corning? BioCoatTMMatrigel invasion chambers，步驟同體外遷移實(shí)驗(yàn)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用 Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 構(gòu)建CARMA3基因穩(wěn)定沉默的HCT116細(xì)胞株

首先，檢測(cè)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29、SW480和SW620中CARMA3的表達(dá)，并選擇一株高表達(dá)CARMA3的細(xì)胞株。由圖1可知，HCT116和HT29中CARMA3的mRNA和蛋白表達(dá)水平較高。本研究以HCT116為主要實(shí)驗(yàn)對(duì)象。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法包裝慢病毒，將收集到的慢病毒感染細(xì)胞，puromycin篩選后構(gòu)建穩(wěn)定沉默CARMA3的HCT116-shCARMA3細(xì)胞(HCT116-shCARMA3-91、HCT116-shCARMA3-92、HCT116-shCARMA3-93和HCT116-shCARMA3-94)，以HCT116細(xì)胞為空白對(duì)照，HCT116-sheGFP細(xì)胞為陰性對(duì)照。慢病毒感染48 h，除HCT116-shCARMA3-92細(xì)胞外，其它組細(xì)胞綠色熒光表達(dá)效率均達(dá)90%以上(圖2)，其中HCT116-shCARMA3-93細(xì)胞CARMA3的mRNA和蛋白水平受抑制最明顯(圖3)。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用HCT116-shCARMA3-93作為細(xì)胞模型進(jìn)行功能研究。

Figure 1.The expression of CARMA3 at mRNA(A) and protein (B) levels in different colonic carcinoma cell lines. Mean±SD.n=3.

圖1 不同結(jié)腸癌細(xì)胞株CARMA3 mRNA和蛋白的表達(dá)情況

Figure 2.The expression of green fluorescence in transfected cell lines after 48 h infection (×100). A: HCT116-sheGFP; B: HCT116-shCARMA3-91; C: HCT116-shCARMA3-92; D: HCT116-shCARMA3-93; E: HCT116-shCARMA3-94.

圖2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞綠色熒光的表達(dá)情況

Figure 3.The expression of CARMA3 at mRNA(A) and protein (B) levels in different transfected cell lines. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHCT116-sheGFP.

圖3 不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞CARMA3 mRNA和蛋白的表達(dá)情況

2 敲減CARMA3基因抑制HCT116細(xì)胞生長

本研究通過WST-1實(shí)驗(yàn)、RTCA實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)分析CARMA3在結(jié)腸癌細(xì)胞生長中的作用。相比于空白對(duì)照HCT116細(xì)胞和陰性對(duì)照HCT116-sheGFP細(xì)胞, WST-1法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HCT116-shCARMA3-93細(xì)胞活力顯著下降，72 h抑制率為41.8%±4.9% (圖4A)。RTCA系統(tǒng)檢測(cè)同樣發(fā)現(xiàn)HCT116-shCARMA3-93細(xì)胞生長減緩，72 h抑制率為50.5%±6.5% (圖4B)。與HCT116和HCT116-sheGFP細(xì)胞相比，HCT116-shCARMA3-93細(xì)胞的集落形成能力受到明顯抑制，2周后集落形成抑制率為78.5%±9.5% (圖5)。細(xì)胞增殖和克隆形成受抑制與細(xì)胞周期改變有關(guān)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示HCT116、HCT116-sheGFP和HCT116-shCARMA3-93的G0/G1期細(xì)胞所占比例分別為45.5%±5.6%、47.1%± 4.3%和60.4%±6.0%；S期細(xì)胞所占比例分別為48.4%±5.0%、46.0%±5.6%和31.9%±2.9%(圖6)。與對(duì)照組相比，HCT116-shCARMA3-93的G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯升高，S期細(xì)胞比例相應(yīng)下降。用Western blot檢測(cè)HCT116、HCT116-sheGFP和HCT116-shCARMA3-93細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)CARMA3受抑制后下游信號(hào)通路分子Bcl10和NF-κB表達(dá)下調(diào)，MALT-1變化不明顯；cyclin D1顯著下調(diào)，cyclin A表達(dá)略有下降(圖11)。

Figure 4.WST-1 assay (A) and RTCA assay (B) for cell viability. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHCT116-sheGFP (72 h).

圖4 WST-1和RTCA法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化

Figure 5.The colony formaion ability of different cell lines (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHCT116-sheGFP.

圖5CARMA3基因敲減對(duì)細(xì)胞集落形成能力的抑制作用

3 敲減CARMA3基因抑制HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力

為深入探討CARMA3在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，本研究應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)和體外遷移實(shí)驗(yàn)分別觀察細(xì)胞水平方向和垂直方向遷移能力的改變，利用體外侵襲實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞侵襲能力的變化。如圖7所示，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，對(duì)照組HCT116細(xì)胞和HCT116-sheGFP細(xì)胞的損傷基本恢復(fù)，而HCT116-shCARMA3-93細(xì)胞的損傷恢復(fù)能力明顯減弱。48 h損傷恢復(fù)率分別為93.5%±5.8%、93.9%±6.1%和68.9%±2.1%。體外遷移實(shí)驗(yàn)表明，HCT116-shCARMA3-93較HCT116和HCT116-sheGFP穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，48 h抑制率分別為57.3%±9.5%和55.7%±9.5%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖8)。為進(jìn)一步分析細(xì)胞侵襲能力的改變，應(yīng)用體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞突破基底膜的情況。同樣可見，HCT116-shCARMA3-93穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，48 h抑制率分別為68.5%±10.2%和67.6%±10.3%(圖9)。說明敲減CARMA3會(huì)降低HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲能力。采用Western blot檢測(cè)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，進(jìn)一步分析機(jī)制。結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，HCT116-shCARMA3-93細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)下調(diào)，MMP-7未見改變。TIMP-1和TIMP-2表達(dá)上調(diào)(見圖11)。

Figure 6.The cell cycle analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHCT116-sheGFP.

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期的變化

Figure 7.Wound healing ability of different cell lines (×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHCT116-sheGFP.

圖7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞創(chuàng)傷愈合能力

4 敲減CARMA3基因逆轉(zhuǎn)HCT116細(xì)胞的EMT

敲減CARMA3后觀察HCT116細(xì)胞形態(tài)的改變，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞HCT116和HCT116-sheGFP細(xì)胞均呈長梭形，細(xì)胞排列松散，細(xì)胞間黏附力弱。而HCT116-shCARMA3-93細(xì)胞則呈卵圓形上皮樣，細(xì)胞排列規(guī)則、細(xì)胞間連接緊密(圖10)。Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)水平升高，N-cadherin、鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和EMT因子Twist表達(dá)水平呈不同程度降低(圖11)。

討 論

研究表明，CARMA3在多種實(shí)體瘤中高表達(dá)，如腸癌[4]、肺癌[5]、乳腺癌[6]、卵巢癌[7]、腎癌[8]、膀胱癌[9]等。趙婷婷等[4]應(yīng)用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織過表達(dá)CARMA3，表達(dá)水平與TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及Ki-67表達(dá)明顯相關(guān)。Miao等[10]在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和HT29中也發(fā)現(xiàn)CARMA3呈高水平表達(dá)。推測(cè)CARMA3在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中具有一定促進(jìn)作用。為了觀察CARMA3對(duì)結(jié)腸癌生長和侵襲轉(zhuǎn)移的影響，本研究通過RNA干擾和慢病毒感染技術(shù)敲減結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中CARMA3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲隨之受到抑制，這與Wang等[11]在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和HT29中觀察到的現(xiàn)象相符，說明CARMA3會(huì)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

Figure 8.CARMA3 knockdown inhibited the migration of the HCT116 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHCT116-sheGFP.

圖8 敲減CARMA3抑制HCT116細(xì)胞遷移能力

Figure 9.CARMA3 knockdown inhibited the invasion of the HCT116 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHCT116-sheGFP.

圖9 敲減CARMA3抑制HCT116細(xì)胞侵襲能力

Figure 10.The morphological changes of the cells withCARMA3 knockdown (×400).

圖10 敲減CARMA3后細(xì)胞形態(tài)的變化

Figure 11.The protein expression in different cell lines determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsHCT116-sheGFP.

圖11 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

腫瘤增殖失控與生長相關(guān)信號(hào)通路異常有關(guān)。持續(xù)性激活NF-κB信號(hào)通路可誘導(dǎo)腫瘤生長相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤的形成。CARMA3作為NF-κB上游的關(guān)鍵信號(hào)分子，通過其CARD結(jié)構(gòu)域與Bcl10的CARD結(jié)構(gòu)域相連，再結(jié)合MALT-1形成CBM復(fù)合物。Bcl10 CARD結(jié)構(gòu)域的Lys63殘基經(jīng)多次泛素化后，被IKK復(fù)合物中的NEMO殘基所識(shí)別，促使IKK與CBM復(fù)合物相互作用，誘發(fā)NF-κB的活化。Western blot結(jié)果顯示，CARMA3受抑制后下游信號(hào)分子Bcl10和NF-κB明顯下調(diào)，與Du等[12]在胰腺癌中得到的結(jié)果一致。說明CARMA3可通過CBM復(fù)合物介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路影響腫瘤生物學(xué)行為。NF-κB通路是CARMA3發(fā)揮促癌作用最主要的信號(hào)通路，這在多種腫瘤中得到證實(shí)。NF-κB過度活化還會(huì)引起細(xì)胞周期相關(guān)蛋白活性異常，導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂。細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的主要功能是推動(dòng)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，cyclin A則促進(jìn)S期向G2期轉(zhuǎn)變。而cyclin D1啟動(dòng)子含有2個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，活化的NF-κB具有促進(jìn)cyclin D1表達(dá)及G1/S期轉(zhuǎn)換的功能。Miao等[10]應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)使結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo過表達(dá)CARMA3，發(fā)現(xiàn)NF-κB和cyclin D1表達(dá)隨之增高。將NF-κB抑制劑BAY 11-7082作用于轉(zhuǎn)染后的LoVo細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長減緩，NF-κB和cyclin D1表達(dá)受到明顯抑制。說明cyclin D1受NF-κB的直接調(diào)控。結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè)，敲減CARMA3基因后結(jié)腸癌細(xì)胞HCT16被阻滯于G0/G1期，生長和克隆形成受抑制。這可能與CARMA3調(diào)控下游NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而下調(diào)cyclin D1有關(guān)。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌高致死率的主要原因。目前已發(fā)現(xiàn)多條信號(hào)通路參與調(diào)控結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移，包括NF-κB信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、TGF-β-Smad信號(hào)通路、Wnt-連環(huán)素信號(hào)通路、整合素激活FAK介導(dǎo)的信號(hào)通路等[13]。其中NF-κB信號(hào)通路尤為重要。CARMA3作為NF-κB上游信號(hào)分子，其過表達(dá)會(huì)持續(xù)激活NF-κB?；罨蟮腘F-κB通過結(jié)合下游MMPs的啟動(dòng)子序列，使其表達(dá)上調(diào)[14]。MMPs能特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)幾乎所有成分，促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移。MMPs的活性還受其抑制劑TIMPs的調(diào)控。MMPs和TIMPs的比例(MMPs上調(diào)或TIMPs下調(diào))可引起腫瘤轉(zhuǎn)移表型的產(chǎn)生。在結(jié)直腸癌組織中，李中信等[15]發(fā)現(xiàn)NF-κB可通過上調(diào)MMP-9促進(jìn)癌細(xì)胞脫落至腹腔形成微轉(zhuǎn)移。本研究體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了CARMA3通過改變侵襲轉(zhuǎn)移分子(MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2)影響結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的遷移和侵襲，與非小細(xì)胞肺癌[5]和膠質(zhì)瘤細(xì)胞[16]中的結(jié)論一致。Qin等[17]應(yīng)用經(jīng)典的NF-κB通路激活劑TNF-α干預(yù)HCT116細(xì)胞證實(shí)NF-κB通路活化后MMP-2和MMP-9表達(dá)量增高，提示NF-κB可直接調(diào)控HCT116細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)。但CARMA3是否通過NF-κB通路直接調(diào)控MMPs和TIMPs影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

EMT亦被認(rèn)為是參與實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制之一。EMT通過肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白的收縮和細(xì)胞黏附的變化改變細(xì)胞形態(tài)，分泌MMPs破壞基底膜，重組細(xì)胞骨架增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力。EMT和MET表型轉(zhuǎn)換是可逆的，大部分由轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist和Sip調(diào)控。這些轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平降低會(huì)引起上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào)、間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和MMPs表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)MET[18]。本研究觀察到敲減CARMA3基因后HCT116細(xì)胞發(fā)生MET，Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)分子亦發(fā)生相應(yīng)改變。其他學(xué)者在膀胱癌中也觀察到CARMA3對(duì)EMT相關(guān)分子和MMPs的影響[19]。Pires 等[18]發(fā)現(xiàn)NF-κB p65可直接結(jié)合于Twist1、Slug和Sip1啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控EMT，進(jìn)而改變MMPs的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。劉寶玉等[20]用NF-κB抑制劑PDTC干預(yù)HCT116細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)EMT形態(tài)受抑制，細(xì)胞侵襲遷移能力減弱。這與NF-κB、N-cadherin表達(dá)下調(diào)，E-cadherin表達(dá)增加有關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)CARMA3參與調(diào)節(jié)EMT，改變MMPs和TIMPs表達(dá)，影響結(jié)腸細(xì)胞HCT116的侵襲轉(zhuǎn)移，這可能是通過改變NF-κB活性實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，敲減結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中的CARMA3基因會(huì)降低細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力。研究結(jié)果證實(shí)CARMA3通過將細(xì)胞阻滯于G0/G1期來抑制腫瘤生長，同時(shí)促進(jìn)EMT逆轉(zhuǎn)，改變侵襲轉(zhuǎn)移分子表達(dá)影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，推測(cè)與其下游NF-κB信號(hào)通路發(fā)生改變有關(guān)。本研究初步探討了CARMA3在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為以CARMA3為靶點(diǎn)治療結(jié)腸癌提供新思路。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

CARMA3 gene knockdown in HCT116 cells inhibits cell growth, migration and invasion

LIU Fang1, 2, LIN Wan-song1, 2, CHEN Shu-ping1, 2, YE Yun-bin1, 2

(1Immuno-OncologyLaboratory,FujianCancerHospital&FujianMedicalUniversityCancerHospital,2FujianKeyLaboratoryofTranslationalCancerMedicine,Fuzhou350014,China.E-mail:zjyunbin@189.cn)

AIM: To study the effcts of caspase recruitment domain membrane-associated guanylate kinase protein 3 (CARMA3) knockdown on the growth, migration and invasion of human colonic carcinoma HCT116 cells and to analyze the mechanism. METHODS: A colonic carcinoma cell line with CARMA3 over-expression was selected. TheCARMA3 gene in the HCT116 cells was knocked down by lentivirus technique. After screening by puromycin, the stably-transfected HCT116-shCARMA3 cell line was constructed. CARMA3 expression at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blot， respectively. The cell proliferation was analyzed by WST-1 assay and RTCA S16 system. The colony formation ability was measured by colony-forming assay. The cell cycle was analyzed by flow cytometry. The cell morphological changes were observed under microscope. The abilities of migration and invasioninvitrowere observed by wound healing assay and Transwell assay. The changes of related molecules were determined by Western blot to explore the mechanism. RESULTS: The expression of CARMA3 at mRNA and protein levels in the HCT116 cells was the highest in the 4 colonic carcinoma cell lines. HCT116-shCARMA3 cells with stably-silencedCARMA3 gene were successfully established. Among them, HCT116-shCARMA3-93 cells showed the greatest inhibition of CARMA3 at mRNA and protein levels. Therefore， HCT116-shCARMA3-93 cells were chosen as the cell model. Compared with control group, the morphological changes of the HCT116-shCARMA3-93 cells had epithelial-mesenchymal transition (EMT) reversion. The abilities of proliferation, colony formation, migration and invasion in the HCT116-shCARMA3-93 cells were obviously suppressed (P<0.01). G0/G1phase proportion was increased and S phase proportion was correspondingly decreased (P<0.05). Bcl10 and NF-κB were down-regulated, and mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1 (MALT-1)showed no change. Cyclin D1 was decreased obviously and cyclin A declined slightly. Metastasis-related mar-kers matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 were reduced， MMP-7 remained unchanged, while tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP)-1 and TIMP-2 were up-regulated. Furthermore, EMT-associated molecule E-cadherin was increased, while N-cadherin, Snail, Slug and Twist were decreased to some extent. CONCLUSION: CARMA3 has an impact on the growth， migration and invasion of colonic carcinoma cell line, which is possibly related to NF-κB signaling pathway to change cell cycle and metastasis-related markers and to regulate EMT.

CARMA3; Colonic carcinoma; Lentivirus; Cell growth; Cell migration; Cell invasion

1000- 4718(2017)06- 1021- 10

2017- 03- 07

2017- 04- 06

國家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目資助；福建省衛(wèi)生廳青年科研課題(No. 2014-1-12)

R730.23； R735.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.011

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