微滴式數(shù)字PCR定量檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5

張佳玲，潘 廣，章桂明，程穎慧，向才玉，陳枝楠，謝忠穩(wěn),*，凌杏園,*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技院，茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036；2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045；3.深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，廣東 深圳 518010）

微滴式數(shù)字PCR定量檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5

張佳玲1，潘 廣2，章桂明2，程穎慧2，向才玉2，陳枝楠3，謝忠穩(wěn)1,*，凌杏園2,*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技院，茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036；2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045；3.深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，廣東 深圳 518010）

建立基于QX100微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）平臺的我國未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的二重微滴式數(shù)字PCR定量檢測方法。該方法選擇基因組中單拷貝的玉米內(nèi)源基因hmg和VCO-01981-5品系邊界序列為定量靶序列，分別設(shè)計(jì)不同的PCR擴(kuò)增引物和TaqMan探針，并對兩種探針用不同的熒光進(jìn)行標(biāo)記，然后將上述探針和引物置于同一個PCR反應(yīng)體系中以同時定量兩個靶標(biāo)序列。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該法只有VCO-01981-5品系的兩個靶序列才都有擴(kuò)增信號。靈敏度、線性和準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在定量結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于25%時，最低可穩(wěn)定定量5 個拷貝的VCO-01981-5品系特異性序列分子和4 個拷貝的內(nèi)源基因hmg分子；而在高達(dá)50 ng模板DNA以下范圍內(nèi)，PCR反應(yīng)模板量與測定樣品拷貝數(shù)之間呈高度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.99以上；平均誤差小于10%。結(jié)果表明本研究建立的該玉米品系定量方法特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，精確性、準(zhǔn)確性以及靈敏度高，定量范圍廣，可用于進(jìn)、出口農(nóng)產(chǎn)品和食品中該轉(zhuǎn)基因玉米品系成分的定量檢測。此外，該法還可為其他轉(zhuǎn)基因玉米品系及其他轉(zhuǎn)基因作物品系建立類似定量檢測方法提供參考。

轉(zhuǎn)基因玉米；品系VCO-01981-5；微滴式數(shù)字PCR；定量檢測

2015年是轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化第20周年，全球轉(zhuǎn)基因作物累計(jì)種植面積達(dá)到空前的20億 公頃。20年來，農(nóng)民收益超過了1 500億 美元。然而轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物在給人們帶來巨大利益的同時也引發(fā)了公眾對其安全性的擔(dān)憂。同歐盟等國家一樣，我國高度重視轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物及食品的安全問題，不僅要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識，還要求對未批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因品系及其產(chǎn)品予以取締，因此，必須對農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行定性和定量的轉(zhuǎn)基因檢測[1-3]。

目前，轉(zhuǎn)基因檢測的方法主要有基于核酸檢測的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)[4]、核酸雜交技術(shù)[5]和基因芯片技術(shù)[6]，基于蛋白質(zhì)檢測的Western Blot[7]、酶聯(lián)免疫吸附測定[8]等。其中應(yīng)用最廣泛的是普通PCR方法和實(shí)時熒光PCR方法。如在定性檢測方面，Matsuoka等[9]利用多重PCR同時檢測玉米內(nèi)源基因Ze1和5 種轉(zhuǎn)基因品系，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度較高，可以檢出0.5%含量的轉(zhuǎn)基因玉米品系。在定量檢測方面，Kim等[10]用構(gòu)建的含小麥內(nèi)源基因acc和小麥品系MON71800特異性序列的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pGEM-M71800制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立的普通PCR方法最低能檢測10 個拷貝品系特異序列分子；而建立的實(shí)時PCR方法最低能檢測5 個拷貝，定量限（limit of quantitation，LOQ）為10 個拷貝，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.23%～1.12%范圍內(nèi)，表明實(shí)時熒光PCR方法靈敏度更高、定量結(jié)果重復(fù)性更好。Wu Gang等[11]同樣采用實(shí)時熒光PCR方法建立了定量檢測轉(zhuǎn)基因油菜品系Topas 19/2的方法，該方法特異性強(qiáng)，只有品系Topas 19/2的內(nèi)源基因HMG-I/Y和品系特異性序列兩者均有擴(kuò)增；品系特異性基因的檢出限（limit of detection，LOD）和LOQ分別約為5 個和50 個拷貝數(shù)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.260%～1.541%范圍內(nèi)，表明方法靈敏度和重復(fù)性較高。

不管是常規(guī)PCR還是實(shí)時熒光PCR定量檢測，首先必須用已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)DNA制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定PCR初始模板拷貝數(shù)與PCR產(chǎn)物量（普通PCR定量）或與Ct值（實(shí)時熒光PCR定量）的關(guān)系；再由PCR產(chǎn)物量或Ct值經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算得到樣品目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。由于樣品DNA與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)DNA在質(zhì)量上（包括DNA降解程度、是否含有反應(yīng)抑制物等）不可能完全一致，勢必造成兩者PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率的差異，從而影響PCR反應(yīng)的產(chǎn)物量或Ct值，進(jìn)而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，常規(guī)PCR定量需要通過瓊脂糖凝膠電泳獲得目標(biāo)條帶產(chǎn)物量，不僅操作繁瑣，且容易污染。實(shí)時熒光PCR盡管比普通PCR特異性強(qiáng)、污染少，但同樣需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測結(jié)果受擴(kuò)增效率影響[12-13]。

微滴式數(shù)字PCR是最近興起的一種核酸單分子擴(kuò)增技術(shù)。其原理是：一個PCR反應(yīng)管中90 μL的油水反應(yīng)體系被微滴發(fā)生器制 備成近20 000 個油包水小微滴；當(dāng)待測DNA模板分子數(shù)低于一定的數(shù)目，微滴只含有一個分子的DNA模板和足夠量的用于熒光PCR反應(yīng)所需的所有其他組分如dNTP、Taq DNA聚合酶以及探針和引物等。待所有微滴實(shí)時熒光PCR反應(yīng)結(jié)束后，逐一檢查每個微滴。只要微滴有熒光信號檢出，就被認(rèn)為有實(shí)時熒光PCR反應(yīng)發(fā)生，記有一個分子的待測模板被檢出；統(tǒng)計(jì)所有陽性微滴數(shù)，就可得出樣品中待測DNA模板的分子數(shù)[14-18]。數(shù)字PCR技術(shù)的上述特點(diǎn)表明其對目標(biāo)序列拷貝數(shù)的定量不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，且定量結(jié)果不受PCR擴(kuò)增效率影響，因此，具有比普通PCR和實(shí)時熒光PCR定量技術(shù)無法比擬的優(yōu)越性[19-22]。

數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因定量檢測方面也有應(yīng)用[23-29]。Corbisier等[25]利用數(shù)字PCR檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810品系外源基因和內(nèi)源參照基因的拷貝數(shù)比例，同時用實(shí)時PCR檢測質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并將兩者的結(jié)果進(jìn)行比較，獲得了一致性，說明兩種方法均能用于MON810品系拷貝數(shù)的分析測定。Demeke等[26]將外源基因和內(nèi)源參照基因的探針引物混合到單個PCR反應(yīng)中，利用二重ddPCR對轉(zhuǎn)基因油菜OXY235品系和大豆DP305423品系進(jìn)行絕對定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含量為1%、0.1%及0.01%的標(biāo)準(zhǔn)品樣品均能被ddPCR和實(shí)時PCR定量，而含量為0.001%的標(biāo)準(zhǔn)品樣品只能被ddPCR檢出。Fu Wei等[27]選取CaMV35s啟動子和NOS終止子作為篩選轉(zhuǎn)基因作物的通用元件，用數(shù)字PCR進(jìn)行定量檢測，并對MON810等9 種轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果獲得LOD為0.1%，這一低于歐盟規(guī)定閾值的結(jié)果，表明該方法特異性好、靈敏度高，適于轉(zhuǎn)基因成分含量的精確定量。

轉(zhuǎn)基因玉米VCO-01981-5是有Genective S.A.公司開發(fā)的抗草甘膦除草劑的新品系，于2013和2014年分別在美國和加拿大獲準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)和利用。該品系未獲我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)，國際、國內(nèi)也未見有相應(yīng)的品系特異性檢測方法公開報(bào)道。本研究以采購的VCO-01981-5標(biāo)準(zhǔn)品為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)文獻(xiàn)公開的外源基因插入位點(diǎn)附件序列設(shè)計(jì)該品系特異性檢測引物和探針，以Bio-Rad公司生產(chǎn)的QX100微滴式數(shù)字PCR為實(shí)驗(yàn)平臺，研究建立了這一我國目前尚未批準(zhǔn)進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因玉米品系的精準(zhǔn)定量方法，以實(shí)現(xiàn)對該轉(zhuǎn)基因玉米成分的定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

本研究共選取26 份實(shí)驗(yàn)材料，分別為轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、MON89034、Bt176、Bt11、MON88017、MON810、MON863、T25、MIR604、ES3272、GA21、59122、MON87460、98140、DAS40278-9、MON87427、VCO-01981-5（100%質(zhì)量百分含量），轉(zhuǎn)基因油菜品系MS1、RF1、Topas19/2，轉(zhuǎn)基因水稻品系KF6，轉(zhuǎn)基因大豆品系A(chǔ)2704-12、MON89788、305423，轉(zhuǎn)基因棉花品系GHB614，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系EH92-527-1，以上材料均于歐盟標(biāo)準(zhǔn)局和美國油脂化學(xué)協(xié)會。

ddPCR Super Mix、ddPCR Droplet Generation Oil、ddPCR Droplet Reader Oil、Droplet Generator DG8 Cartridge、Droplet Generator DG8 Gasket、plate holder和96孔板試劑和耗材 美國Bio-Rad公司；植物基因組DNA提取試劑盒DNeasy Plant Mini kit 德國Qiagen公司。

QX100TMDroplet Digital PCR系統(tǒng)（包括PCR儀、微滴生成儀和微滴讀取儀和封膜儀四部分） 美國Bio-Rad公司；Mcrofuge?16型離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特公司；Vortex genie3型渦旋振蕩儀 德國IKA公司；恒溫水浴鍋 北京市六一儀器廠；Nanodrop 2000c核酸蛋白分析儀 美國Thermo Scientif i c公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

轉(zhuǎn)基因玉米等供試材料的基因組DNA提取參照試劑盒說明書。

1.2.2 探針和引物

轉(zhuǎn)基因玉米內(nèi)源基因選用玉米高速泳動蛋白（high mobility group proteins，HMG）基因，HMG是細(xì)胞核中一種與染色質(zhì)結(jié)合在一起的高度豐富的非組蛋白，其分子質(zhì)量比較小，但在染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能中可能起著重要的作用。該基因在GenBank的檢索號為AJ131373.1，在玉米基因組中僅一個拷貝。

轉(zhuǎn)基因玉米VCO-01981-5品系特有序列選擇外源基因插入位點(diǎn)5’端跨邊界序列，該序列在玉米基因組中為單拷貝。

用于數(shù)字PCR檢測轉(zhuǎn)基因玉米內(nèi)源基因hmg和品系VCO-01981-5特異序列的探針、引物序列及探針標(biāo)記信息見表1。

表1 研究用探針和引物信息Table1 Sequences of probes and primers used in this study

1.2.3 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

每個提取DNA樣品檢測時設(shè)置3 個平行PCR反應(yīng)。

d d P C R反應(yīng)體系共2 0 μ L，其中2×ddPCR Super Mix10 μL，品系特異性序列和內(nèi)參照hmg基因正、反向引物各1 μL（6 μmol/L）、探針各1 μL（3.6 μmol/L），DNA模板（15 ng/μL）2 μL，補(bǔ)水至20 μL。分別將20 μL的反應(yīng)體系和70 μL微滴生成油加在微滴生成卡槽相應(yīng)的小室中，蓋上膠墊后放入微滴生成儀中，由儀器自主振蕩生成微滴。待振蕩結(jié)束后將產(chǎn)生的40 μL左右的微滴轉(zhuǎn)移到96 孔板中，并用熱封膜儀對其進(jìn)行封膜，最后置于PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。

反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火1 min，40 個循環(huán)，98 ℃、10 min酶熱失活，產(chǎn)物4 ℃保存。

擴(kuò)增結(jié)束后，將96 孔板置入微滴分析儀中讀取信號，并使用QuantaSoft V1.3.2軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。樣品中轉(zhuǎn)基因品系含量以樣品基因組DNA中品系特異序列拷貝數(shù)占內(nèi)源基因拷貝數(shù)的百分比即拷貝數(shù)含量表示。

1.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

以1 ng/μL轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5（100%質(zhì)量百分含量）基因組DNA作為模板DNA的工作質(zhì)量濃度，再按照上述反應(yīng)體系要求配制反應(yīng)體系并進(jìn)行PCR反應(yīng)。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個平行，要求3 個重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）不超過25%。

1.2.5 特異性實(shí)驗(yàn)

選用轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、MON89034、Bt176、Bt11、MON88017、MON810、MON863、T25、MIR604、ES3272、GA21、59122、MON87460、98140、DAS40278-9、MON87427、VCO-01981-5（1 0 0%含量），轉(zhuǎn)基因油菜品系M S 1、R F 1、Topas19/2，轉(zhuǎn)基因水稻品系KF6，轉(zhuǎn)基因大豆品系A(chǔ)2704-12、MON89788、305423，轉(zhuǎn)基因棉花品系GHB614，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系EH92-527-1為實(shí)驗(yàn)材料。以這26 種轉(zhuǎn)基因樣品基因組DNA為模板配制ddPCR反應(yīng)體系，并進(jìn)行PCR反應(yīng)。其中VCO-01981-5品系作為陽性對照。

1.2.6 定量線性范圍測定

轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5（100%質(zhì)量百分含量）基因組DNA分別用純水稀釋至25、5、1、0.2、0.04、0.008、0.0016 ng/μL共7 個工作質(zhì)量濃度。以2 μL上述各稀釋DNA作為模板進(jìn)行ddPCR反應(yīng)，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3 個反應(yīng)。計(jì)算各質(zhì)量濃度樣品3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的RSD，以起始樣品用量對RSD不超過25%的各質(zhì)量濃度樣品的定量結(jié)果計(jì)算兩者的線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)。LOQ定義為檢測結(jié)果RSD不超過25%的最低樣品用量或樣品拷貝數(shù)；LOD定義為能夠檢測的樣品最低拷貝數(shù)或樣品用量。

1.2.7 LOQ驗(yàn)證

取定量性范圍下限的DNA樣品用量進(jìn)行LOQ驗(yàn)證，共進(jìn)行10 個平行反應(yīng)，計(jì)算平行反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值和RSD，如RSD不大于25%，則為該方法目標(biāo)序列的LOQ。

1.3 準(zhǔn)確性檢測

本研究實(shí)驗(yàn)材料VCO-01981-5標(biāo)準(zhǔn)品（100%）是玉米種子粉末，種子由轉(zhuǎn)基因父本和非轉(zhuǎn)基因母本雜交產(chǎn)生（F1代）。這種質(zhì)量百分含量100%的雜合型玉米標(biāo)準(zhǔn)品，其拷貝數(shù)含量（品系特異序列和內(nèi)源基因拷貝數(shù)比值）理論上僅為39%左右[25,30]。這里取1.2.6節(jié)中定量線性范圍測定中RSD不大于25%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算不同模板DNA用量測定拷貝數(shù)含量和RSD、平均拷貝數(shù)含量和RSD，定量結(jié)果準(zhǔn)確性以誤差百分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的建立和穩(wěn)定性檢測結(jié)果

反應(yīng)體系參照Morisset[17]建立的MON810品系的二重?cái)?shù)字PCR方法。本實(shí)驗(yàn)檢測VCO-01981-5品系特異性序列探針采用5’-FAM—3’-BHQ1熒光標(biāo)記，檢測內(nèi)源基因hmg探針采用5’-HEX—3’-BHQ1熒光標(biāo)記，從而保證同一個反應(yīng)體系中兩種目標(biāo)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物可以同時檢出。反應(yīng)酶采用Bio-Rad生產(chǎn)的與其平臺相適應(yīng)的預(yù)混液（Super Mix），由于該預(yù)混液對體系中各種成分抗干擾性和適應(yīng)性廣，探針和引物用量等同文獻(xiàn)[17]用量。

由于針對不同目標(biāo)序列設(shè)計(jì)的引物、探針序列不同，其退火溫度不同，因而二重?cái)?shù)字PCR反應(yīng)條件中的退火和延伸溫度特別重要。本研究應(yīng)用合成的內(nèi)、外源基因引物、探針和轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA按1.2.3節(jié)要求配制PCR反應(yīng)體系并測試了7 種（65、63.8、62.0、59.1、55.7、52.9、51 ℃）不同的退火溫度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)55.7 ℃有利于兩個目標(biāo)序列的擴(kuò)增（數(shù)據(jù)未提供）。

56 ℃反應(yīng)條件下3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。圖1A為FAM通道，是各微滴VCO-01981-5品系特異序列擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果；圖1B圖為HEX通道，是各微滴內(nèi)源基因hmg擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果。如圖1A中熒光擴(kuò)增值介于10 000～14 000之間的圓點(diǎn)和圖1B中熒光擴(kuò)增值介于4 000～6 000之間的圓點(diǎn)分別代表發(fā)生PCR擴(kuò)增反應(yīng)的微滴，熒光分析儀判讀為陽性信號；而位于本底熒光值附近的圓點(diǎn)代表未發(fā)生擴(kuò)增的微滴，熒光分析儀判讀為陰性信號。陽性微滴的熒光增量大、信號強(qiáng)，代表擴(kuò)增產(chǎn)物量大，說明該微滴擴(kuò)增效率高；陰性微滴的熒光增量少、信號弱，表明該微滴擴(kuò)增效率低。對數(shù)字PCR來說不管以上陽性微滴熒光信號強(qiáng)弱，均表示一個分子目標(biāo)序列檢出，檢測結(jié)果不受微滴擴(kuò)增效率影響。陽性微滴與陰性微滴熒光信號差別大，圖譜分得很開，表明在同一個PCR反應(yīng)體系（微滴）中可以同時檢測內(nèi)、外源兩個目標(biāo)序列，且本研究所確立的探針、引物、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件等適于該品系內(nèi)源基因和外源序列的擴(kuò)增反應(yīng)。

圖1 各微滴品系標(biāo)準(zhǔn)品DNA內(nèi)源基因和品系特異序列擴(kuò)增反應(yīng)情況Fig.1 Amplification results of endogenous gene and event-specific boundary sequences of standard DNA in the droplets

為考察研究建立方法的穩(wěn)定性，本研究特地重復(fù)進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)，如圖1和表2所示。內(nèi)參基因3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)測的內(nèi)源基因拷貝數(shù)分別為25.6、22.5和25.8，平均檢測拷貝數(shù)為24.63，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）僅為7.51%；品系特異序列3 次擴(kuò)增反應(yīng)所的拷貝數(shù)分別為7.69、8.86和8.77，平均檢測拷貝數(shù)為8.44，RSD僅為7.71%。可見，3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常一致，表明該新建立的定量檢測方法具有很好的穩(wěn)定性。

表2 玉米VCO-01981-5定量方法穩(wěn)定性檢測結(jié)果

Table2 Stability evaluation of the quantitative method for event

表2 玉米VCO-01981-5定量方法穩(wěn)定性檢測結(jié)果Table2 Stability evaluation of the quantitative method for event VCO-01981-5 with droplet digital PCR

2.2 特異性檢測結(jié)果

應(yīng)用本研究建立數(shù)字PCR方法對品系VCO-01981-5和其他25 種轉(zhuǎn)基因玉米、油菜、水稻、大豆、棉花、馬鈴薯品系基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果如圖2所示。17 個轉(zhuǎn)基因玉米品系基因組DNA在HEX通道下都能檢測到熒光信號，而轉(zhuǎn)基因油菜、水稻、大豆、棉花、馬鈴薯品系基因組DNA均未檢測到熒光信號，表明17 個品系的玉米內(nèi)源基因hmg都發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)。在FAM通道下，僅陽性對照樣品VCO-01981-5品系DNA檢測到熒光信號，其余品系的基因組DNA均未檢出熒光信號，說明品系特異性邊界序列發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)。以上結(jié)果表明本研究所建立方法特異性強(qiáng)。圖2顯示陽性微滴很多且與陰性微滴區(qū)分不開，這是樣品DNA用量太多的緣故。

圖2 VCO-01981-5品系特異性雙重?cái)?shù)字PCR定量方法特異性檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Specificity evaluation of the quantitative method for event VCO-01981-5 event with duplex digital PCR

2.3 定量線性范圍測定結(jié)果

表3 玉米VCO-01981-5數(shù)字PCR定量方法的線性范圍測定結(jié)果Table3 Linear range evaluation of the quantitative method for event VCO-01981-5 with droplet digital PCR

應(yīng)用本研究建立二重?cái)?shù)字PCR方法測定不同用量模板DNA目標(biāo)序列拷貝數(shù)的結(jié)果如表3所示。單位是每微升反應(yīng)體系（共20 μL）所含目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，每個測定3 次重復(fù)，以計(jì)算平均拷貝數(shù)和RSD。從表3可以看出，在RSD不大于25%的情況下，玉米內(nèi)源基因hmg可以定量到3.8 拷貝（0.19×20），轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5特異性序列可以定量到4.8 拷貝（0.24×20）。若以PCR模板DNA用量為橫坐標(biāo)，每微升目標(biāo)序列拷貝數(shù)為縱坐標(biāo)繪制曲線，發(fā)現(xiàn)兩者呈線性關(guān)系。從樣品DNA用量與所測品系特異序列拷貝數(shù)之間的關(guān)系圖中發(fā)現(xiàn)在樣品用量50～0.08 ng范圍內(nèi)，本研究方法測定品系特異序列的拷貝數(shù)與樣品用量呈高度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.99以上，其擬合曲線方程為 y=4.673x－0.631 3，表明本研究方法品系特異序列的定量線性范圍在4.8～4 666.6拷貝之間，跨越了3 個數(shù)量級。從樣品DNA用量與所測內(nèi)源基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系圖中發(fā)現(xiàn)在樣品用量50～0.016 ng范圍內(nèi)內(nèi)參基因拷貝數(shù)與樣品用量呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.99以上，其擬合曲線方程為y=13.669x－2.311 5，表明本研究方法內(nèi)源基因序列的定量線性范圍在3.8～13 646.6拷貝之間，跨越了4 個數(shù)量級。以上研究結(jié)果表明本研究建立的數(shù)字PCR方法定量范圍廣、定量精度高，結(jié)果重復(fù)性好。

2.4 LOQ驗(yàn)證結(jié)果

從表3可以看出，品系特異性序列定量線性范圍下限的樣品DNA用量為0.08 ng。取0.08 ng樣品DNA進(jìn)行10 次平行定量檢測，結(jié)果如表4所示，10 次平行定量的品系特異性序列平均拷貝數(shù)為4.8 個，RSD為24%，符合要求（小于25%）。內(nèi)源基因LOQ驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)取用樣品DNA量0.016 ng，10 次定量結(jié)果如表5所示，10 次平行定量的內(nèi)源基因平均拷貝數(shù)為4，RSD為22.91%，符合要求（小于25%）。以上結(jié)果證實(shí)內(nèi)源基因的LOQ為4 拷貝，品系特異性序列的LOQ為4.8 拷貝，表明本研究建立的轉(zhuǎn)基因玉米VCO-01981-5品系特異性定量方法靈敏度高。

表4 玉米VCO-01981-5品系特異性序列LOQ驗(yàn)證結(jié)果Table4 Limit of quantitative analysis for event-specific sequence of event VCO-01981-5 with droplet digital PCR

表5 玉米內(nèi)源基因hmg LOQ驗(yàn)證結(jié)果Table5 Limit of quantitative analysis for endogenous gene of event VCO-01981-5 with droplet digital PCR

2.5 定量準(zhǔn)確性分析結(jié)果

定量準(zhǔn)確性的驗(yàn)證往往用已知準(zhǔn)確含量的標(biāo)準(zhǔn)品或構(gòu)建的質(zhì)粒DNA作為實(shí)驗(yàn)材料。對于轉(zhuǎn)基因玉米，如果供試標(biāo)準(zhǔn)品為葉片等除種子以外的組織，100%質(zhì)量百分含量的轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品，如果是純合子，則拷貝數(shù)含量理論上也為100%；如果是雜合子，則拷貝數(shù)含量理論上僅為50%。玉米種子由胚、果皮、種皮和胚乳4 部分構(gòu)成，前3 部分拷貝數(shù)含量與質(zhì)量百分含量的關(guān)系同葉片組織一樣。玉米種子胚乳細(xì)胞是三倍體，如果胚乳細(xì)胞是雜合基因型，且其外源基因來源于父本，則胚乳細(xì)胞三倍體中只有一個拷貝的外源基因，這樣的胚乳細(xì)胞拷貝數(shù)含量僅有質(zhì)量百分含量的1/3（33.3%）；如果外源基因來源于母本，則胚乳細(xì)胞三倍體中有兩個拷貝的外源基因，這樣的胚乳細(xì)胞拷貝數(shù)含量是質(zhì)量百分含量的2/3（66.6%）。對于全部（100%質(zhì)量百分含量）由轉(zhuǎn)基因玉米整粒種子制成的粉末狀標(biāo)準(zhǔn)品，如果胚乳細(xì)胞是雜合基因型，且其外源基因來源于父本，該標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)含量取決于胚乳在整顆種子中所占的比例。如果胚乳占比越小或無，則拷貝數(shù)含量接近50%；如果胚乳占比越大，則拷貝數(shù)含量接近33%。因此，這種100%的外源基因源于父本的雜合型轉(zhuǎn)基因玉米種子拷貝數(shù)含量在33%～50%之間，而根據(jù)Corbisier[20]和Zhang[30]等的研究，這樣的玉米種子平均拷貝數(shù)含量為39%左右。

依標(biāo)準(zhǔn)品證書說明，本研究實(shí)驗(yàn)材料VCO-01981-5標(biāo)準(zhǔn)品（100%）是玉米種子粉末，種子由轉(zhuǎn)基因父本和非轉(zhuǎn)基因母本雜交產(chǎn)生（F1代），表明其拷貝數(shù)含量為39%左右。該標(biāo)準(zhǔn)品7 種模板DNA用量測定的內(nèi)、外源基因拷貝數(shù)見表3，其中5 個用量測定數(shù)據(jù)的RSD均小于25%，表明精確性較高。本定量準(zhǔn)確性驗(yàn)證采用同樣的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算拷貝數(shù)含量和定量檢測誤差，計(jì)算結(jié)果見表6。結(jié)果發(fā)現(xiàn)最低模板DNA用量（0.08 ng）因內(nèi)、外源序列拷貝數(shù)測定的RSD值已近25%，拷貝數(shù)比值計(jì)算進(jìn)一步放大了誤差，比值計(jì)算結(jié)果的RSD超過25%；其他4 次定量的誤差均在15%以內(nèi)，4 次定量平均誤差僅為9.23%。如果根據(jù)定量方法線性范圍擬合曲線計(jì)算，這4 次定量結(jié)果的誤差同樣都小于15%，有的誤差甚至為0%，平均誤差只有8.76%。以上結(jié)果表明本研究建立VCO-01981-5品系數(shù)字PCR定量方法定量準(zhǔn)確性高。

表6 玉米VCO-01981-5數(shù)字PCR定量方法定量檢測準(zhǔn)確性分析結(jié)果Table6 Accuracy analysis for quantitative detection method of event VCO-01981-5 with droplet digital PCR

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)建立了針對我國未批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5特異性定量方法。數(shù)字PCR是一種近年發(fā)展起來的第3代先進(jìn)定量檢測手段，除具備不需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量結(jié)果不受PCR擴(kuò)增效率等實(shí)時熒光PCR定量不具有的優(yōu)勢外，本研究建立的二重ddPCR定量方法比單重微滴式數(shù)字PCR定量方法優(yōu)勢明顯：其一，同一個微滴PCR反應(yīng)體系在同時定量內(nèi)源和外源兩個靶序列，比一次反應(yīng)只定量一個靶序列更經(jīng)濟(jì)和快速。其二，二重微滴式數(shù)字PCR定量結(jié)果不受樣品DNA用量和質(zhì)量如降解等的影響，因?yàn)橥籇NA樣品，由于降解是隨機(jī)發(fā)生的，同一樣品DNA不同用量之間內(nèi)、外源基因的比例是不會改變的，所以定量結(jié)果更為精確和準(zhǔn)確。二重微滴式數(shù)字PCR上述特點(diǎn)非常重要，不僅避免了單重ddPCR定量因二次取樣所產(chǎn)生的樣品內(nèi)的誤差，也可以消除不同樣品DNA因取樣不一致而造成的樣品間的誤差，因而在操作上使樣品間的比較更為簡單。針對本研究建立方法各項(xiàng)指標(biāo)考察發(fā)現(xiàn)，該定量方法穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、定量范圍廣、定量檢測靈敏度高，同時定量結(jié)果準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，完全可以滿足當(dāng)前和今后對該品系精準(zhǔn)定量的實(shí)際需要。

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Quantitative Detection of Transgenic Maize Event VCO-01981-5 with Droplet Digital PCR

ZHANG Jialing1, PAN Guang2, ZHANG Guiming2, CHENG Yinghui2, XIANG Caiyu2, CHEN Zhinan3, XIE Zhongwen1,*, LING Xingyuan2,*
(1. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, College of Tea and Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518045, China; 3. Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine, Shenzhen5 18010, China)

In this paper, a duplex droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) method was developed to detect the content of unauthorized genetically modified (GM) maize event VC O-01981-5 based on a QX100 ddPCR platform. Towards this goal, PCR primers and TaqMan probes were designed based on the maize endogenous gene hmg and VCO-01981-5 event specific boundary sequences, and the probes were labeled with different chromophores so that the two targets could be detected in one single droplet. Analysis of the specificity of the method showed that both endogenous gene hmg and foreign sequence could be detected only in event VCO-01981-5. Moreover, the sensitivity, linearity and accuracy were evaluated and it was found that when relative standard deviation (RSD) was 25% or less,5 copies of boundary sequences and4 copies of gene hmg could be quantitatively detected, and the quantitative results (target copy) were highly correlated with the amount of DNA template up to 50 ng (R2≥ 0.99), with an average error of less than 10%. All the above results indicated that the established method in this study was very specific, stable, accurate and sensitive, and had a wide quantitative range in quantitative analysis of GM maize VCO-01981-5. Therefore, this method can be applied practically in quantitatively determining this GM maize event in imported and exported agricultural product and foods. Besides, this reported method can be used as a reference to establish a quantitative method for the detection of other GM maize events and GM events of other plants.

transgenic maize; event VCO-01981-5; droplet digital PCR; quantitative detection

47,ebook=254

10.7506/spkx1002-6630-201712038

S513

A

1002-6630（2017）12-0246-07

2016-07-26

公益性行業(yè)（質(zhì)檢）科研專項(xiàng)（201410014-2）；深圳市基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（JC201105190969A）；國家質(zhì)檢總局科技司項(xiàng)目（2009IK257）

張佳玲（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗D(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)。E-mail：1030798546@qq.com

*通信作者：謝忠穩(wěn)（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與代謝生物學(xué)。E-mail：zhongwenxie@ahau.edu.cn凌杏園（1964—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)橹参锘蚬こ毯头肿由飳W(xué)。E-mail：lxy6421@qq.com

張佳玲, 潘廣, 章桂明, 等. 微滴式數(shù)字PCR定量檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)：246-252. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712038. http：//www.spkx.net.cn

ZHANG Jialing, PAN Guang, ZHANG Guiming, et al. Quantitative detection of transgenic maize event VCO-01981-5 with droplet digital PCR[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 246-252. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712038. http：//www.spkx.net.cn