核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)鑒別天然奶油與人造奶油

李 瑋，賈婧怡，李 龍，周瑞澤，周 雅

（北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100041）

核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)鑒別天然奶油與人造奶油

李 瑋，賈婧怡，李 龍，周瑞澤，周 雅

（北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100041）

采用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)天然奶油和人造 奶油的氘代氯仿（CDCl3）提取物進(jìn)行了鑒別研究。結(jié)果表明：與麥淇淋相比，黃油中甾醇、丁酸、1-戊烯、共軛亞油酸含量較高，而總不飽和脂肪酸、亞油酸的含量較低；與植脂奶油相比，稀奶油中甾醇、丁酸、亞麻酸、亞油酸、1-戊烯、共軛亞油酸、總不飽和脂肪酸含量較高，而總飽和脂肪酸含量較低，并且都具有顯著性差異（P＜0.05）。其中脂肪酸的代謝組學(xué)分析結(jié)果與氣相色譜法所得結(jié)果一致。建立的基于NMR代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)天然奶油與人造奶油快速、簡(jiǎn)便的鑒別方法，可以鑒定不同種類奶油的差異化學(xué)成分，為奶油制品的品質(zhì)鑒別和質(zhì)量控制研究提供分析方法。

核磁共振；代謝組學(xué)；黃油；麥淇淋；稀奶油；植脂奶油

天然奶油是從牛奶、羊奶等動(dòng)物乳中提取的黃色或白色脂肪性半固體食品，根據(jù)含脂量的不同可分為稀奶油和黃油（又稱奶油），現(xiàn)行國(guó)標(biāo)[1]中規(guī)定：脂肪含量在10.0%～80.0%的產(chǎn)品為稀奶油，脂肪含量不小于80.0%產(chǎn)品為黃油。由于天然奶油來(lái)源于動(dòng)物乳，所以產(chǎn)能有限，為滿足市場(chǎng)消費(fèi)在1869年出現(xiàn)了人造奶油[2]。目前，國(guó)標(biāo)[3]中定義：人造奶油（又稱人造黃油）系指精制食用油添加水及其他輔料，經(jīng)乳化急冷捏合成具有天然奶油特色的可塑性制品，也就是平時(shí)常說(shuō)的麥淇淋。在20世紀(jì)40年代，美國(guó)人羅伯特·維益發(fā)明了植脂奶油，這種奶油是以食用氫化油、糖和/或甜味劑、增稠劑等為主要原料，經(jīng)過(guò)乳化、殺菌、均質(zhì)、冷卻、灌裝、冷凍等工藝制成的可打發(fā)制品[4]。植脂奶油無(wú)論是配方還是工藝，都和麥淇淋存在很大不同，但由于這兩種奶油都不是來(lái)源于動(dòng)物乳，所以相對(duì)于天然奶油來(lái)說(shuō)，在廣義上都應(yīng)被稱作人造奶油。在本研究中，為避免混淆，分別用黃油、稀奶油、麥淇淋和植脂奶油這4 個(gè)名稱代表上述4 種奶油，其中黃油和稀奶油屬于天然奶油，而麥淇淋和植脂奶油屬于人造奶油。由于天然奶油產(chǎn)能有限，所以導(dǎo)致其價(jià)格居高不下，而人造奶油來(lái)源穩(wěn)定，原料成本低廉，價(jià)格遠(yuǎn)低于天然奶油。但在實(shí)際應(yīng)用和商品流通中，由于黃油與麥淇淋在外觀、特性與用途上較為相近，而稀奶油與植脂奶油較為相似，不法商家為了追求利益，并不在商品上注明所用奶油的種類，混淆人們對(duì)天然和人造奶油的區(qū)別，妄圖以價(jià)格低廉的麥淇淋充當(dāng)黃油，低價(jià)的植脂奶油充當(dāng)稀奶油，損害消費(fèi)者權(quán)益，但目前尚無(wú)健全的鑒別二者的方法。

天然奶油成分復(fù)雜，因其原料乳組分受牧草生長(zhǎng)、飼料來(lái)源、奶牛的年齡和泌乳期的影響，天然奶油脂肪酸的組成呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性和區(qū)域性變化[5]；而人造奶油因制作原料種類、生產(chǎn)工藝及使用添加劑種類和用量的不同，其化學(xué)成分亦存在著較大差異。因此，對(duì)奶油種類的鑒別單純依靠傳統(tǒng)定量分析方法難以實(shí)現(xiàn)，需采用整體研究思路。代謝組學(xué)是有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)、信息學(xué)和基因組學(xué)、表達(dá)組學(xué)等多學(xué)科將結(jié)合的交叉學(xué)科[6]，以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理為手段，具有整體觀的研究思路[7]。核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）是有機(jī)物結(jié)構(gòu)分析的強(qiáng)有力工具，對(duì)食品等復(fù)雜體系的整體分析具有天然優(yōu)勢(shì)[8-11]，與氣相色譜法等動(dòng)植物油中脂肪酸組成的測(cè)定方法[12-14]相比，具有高通量、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便、結(jié)構(gòu)信息豐富等優(yōu)點(diǎn)，已被用于多種植物油及其他脂類成分的分析中[15-19]。由于通過(guò)NMR所得到的樣品信息具有數(shù)據(jù)信息復(fù)雜、多維數(shù)據(jù)矩陣內(nèi)各變量之間具有高度的相關(guān)性等特點(diǎn)，常常無(wú)法用傳統(tǒng)的單變量分析方法進(jìn)行提取，與多元統(tǒng)計(jì)分析手段結(jié)合后不僅可以確定樣本之間的相似性或均一性，而且可以高分辨、高效率地確定出引起組間差異的化學(xué)成分，且能對(duì)那些因?yàn)榛瘜W(xué)結(jié)構(gòu)相似而無(wú)法通過(guò)味道、氣味或顏色進(jìn)行分辨的物質(zhì)進(jìn)行有效區(qū)分。因此，基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)特別適合于食品等復(fù)雜體系真?zhèn)舞b別、質(zhì)量評(píng)價(jià)與分析[20-24]。目前，有采用核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H-NMR）法測(cè)定奶油中主要脂肪酸等成分的報(bào)道[25-26]，但少見(jiàn)NMR法用于天然奶油、人造奶油鑒別及化學(xué)差異成分的研究。

本研究在對(duì)奶油中脂類化學(xué)成分鑒定研究的基礎(chǔ)上，采用1H-NMR法結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析的代謝組學(xué)方法對(duì)市售的天然奶油、人造奶油的氘代氯仿（CDCl3）提取物進(jìn)行分析。并且根據(jù)實(shí)際監(jiān)管需求，分別針對(duì)黃油和麥淇淋、稀奶油和植脂奶油建立了辨別模型，研究不同種類奶油的差異性脂類成分，為天然奶油和人造奶油的快速鑒別提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市場(chǎng)上采集了40 份不同品牌、產(chǎn)地的奶油樣品（表1），其中黃油、稀奶油、麥淇淋和植脂奶油各10 份。黃油、麥淇淋和稀奶油4 ℃存放，植脂奶油－20 ℃存放，使用前常溫融化，避免反復(fù)凍融。所有樣品均在保質(zhì)期前使用。

氘代氯仿（CDCl3，氘代度：99.8%） 美國(guó)CIL公司；Norell5 mm核磁管 美國(guó)Norell公司；37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)樣品 美國(guó)AccuStandard公司；共軛亞油酸混合標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Nu-Chek公司。

表1 用于1H-NMR分析的40 個(gè)奶油樣品信息Table1 Samples used for analysis by1HH--NNMMRR

1.2 儀器與設(shè)備

AVANCE 600MHZ超導(dǎo)傅里葉變換NMR儀（配有BBO探頭和topspin3.2處理軟件） 瑞士Bruker公司；XS204電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Centrifuge 5424R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；TissueLyser II均質(zhì)器 德國(guó)Qiagen公司；7890B氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的制備

稱取適量奶油樣品（黃油、麥淇淋樣品約150 mg，稀奶油、植脂奶油樣品約500 mg）于2 mL EP管中，加入1 mL CDCl3，置于均質(zhì)器中均質(zhì)40 s（30 Hz）后放入離心機(jī)中，4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min。移取600 μL離心后得到的清液于5 mm核磁管中，待測(cè)。

1.3.2 儀器條件

1H-NMR譜測(cè)定條件：NMR儀1H載波頻率為600.13 MHz，使用Bruker標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列noesyig1d，檢測(cè)溫度為297 K，1H的90°脈沖寬度為10.04 μs，譜寬為6 002.40 Hz，中心頻率為2 400.52 Hz，脈沖延遲時(shí)間為10 s，混合時(shí)間為0.01 s，13C的去耦序列90°脈沖為260 μs，掃描次數(shù)為32，空掃次數(shù)為4。

一維全相關(guān)實(shí)驗(yàn)（1D total correlation spectroscopy，1D-TOCSY）譜測(cè)定條件：實(shí)驗(yàn)使用selcssfdizs.2脈沖序列，混合時(shí)間設(shè)為0.8 s，掃描次數(shù)為128。

1.3.3 譜圖處理和數(shù)據(jù)分析

測(cè)得的1H-NMR譜使用Bruker Topspin 3.2軟件處理，變換點(diǎn)數(shù)為64 536，線寬因子為1.00 Hz，用指數(shù)窗函數(shù)處理，基線和相位校正均采用手動(dòng)方式進(jìn)行，四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)信號(hào)（δ 0.00）。處理后的圖譜用MestReNova（version 6.0.1，Spain）軟件，以δ 0.005積分段對(duì)化學(xué)位移區(qū)間δ 0.40～7.00進(jìn)行分段積分并進(jìn)行面積歸一化處理。將上述所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-p 11.0（Umetrics, umea, Sweden）軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminate analysis，PLS-DA），兩種分析均選用帕萊托換算的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式。PLS-DA模型采用交叉驗(yàn)證Q2值、排列檢驗(yàn)對(duì)判別分析所建立的模型進(jìn)行評(píng)判，對(duì)于成立的PLS-DA模型，在對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回溯轉(zhuǎn)換后用Matlab（V7.0.4，Mathworks Inc., U.S.A.）軟件進(jìn)一步繪制針對(duì)每個(gè)變量的皮爾森相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖找出組間有顯著性差異的化學(xué)成分，通過(guò)查閱相關(guān)系數(shù)表，確定相關(guān)系數(shù)r 大于0.63作為臨界值（P＜0.05），小于此系數(shù)忽略不計(jì)。

1.3.4 氣相色譜法測(cè)定主要脂肪酸

參照GB 5413.27—2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測(cè)定》[27]和NY/T 1671—2008《乳及乳制品中共軛亞油酸（CLA）含量測(cè)定 氣相色譜法》[28]測(cè)定4 種奶油中主要脂肪酸的含量。以保留時(shí)間定性，在色譜圖上去除雜峰，檢出所有脂肪酸甲酯，對(duì)脂肪酸甲酯的峰面積求和，每個(gè)脂肪酸甲酯峰面積占總脂肪酸甲酯峰面積的百分?jǐn)?shù)就是其占總脂肪酸的相對(duì)含量。共軛亞油酸采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

色譜條件：HP-88毛細(xì)管柱（100.0 m×0.25 mm， 0.20 μm）；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；進(jìn)樣量：1.0 μL，分流比30∶1。37 種脂肪酸甲酯測(cè)定升溫程序：初始溫為130 ℃，以6.5 ℃/min升至170 ℃，以2.75 ℃/min升至205 ℃，保持15 min，再以2.75 ℃/min升至215 ℃，保持5 min，再以4 ℃/min升至230 ℃，保持6 min。共軛亞油酸定升溫程序：120 ℃，維持10 min，以3.2 ℃/min升溫至230 ℃，維持35 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 采樣參數(shù)的確定

掃描次數(shù)較少會(huì)造成數(shù)據(jù)重復(fù)性差，較多會(huì)使數(shù)據(jù)重復(fù)性好，提高信噪比，但同時(shí)也會(huì)延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間。綜合考慮實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)性及圖譜的穩(wěn)定性，在本研究中選取掃描次數(shù)為32 次即能滿足分析要求。弛豫過(guò)程是NMR現(xiàn)象發(fā)生后得以保持的必要條件，其中縱向弛豫時(shí)間代表縱向磁化強(qiáng)度向平衡態(tài)回復(fù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程常數(shù)。在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選取合適的弛豫延遲時(shí)間，保證譜峰強(qiáng)度不會(huì)被飽和，這樣才有利于得到穩(wěn)定的圖譜結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)選取脈沖延遲時(shí)間為10.0 s時(shí)，即可滿足本研究的分析要求。

2.21H-NMR圖譜指認(rèn)

圖1為黃油、稀奶油、麥淇淋和植脂奶油的CDCl3提取物的1H-NMR譜圖。根據(jù)文獻(xiàn)[29-30]報(bào)道，對(duì)這9 組主要信號(hào)峰進(jìn)行了歸屬，詳見(jiàn)表2。

表2 4 種奶油中脂類成分1H-NMR主要化學(xué)位移歸屬Tabllee 221HH--NNMMRR mmaajjoorr cchheemmiiccaall sshhiifftt aassssiiggnnmmeennttss ooff lliippiiddss iinn bbuutttteerr,, ccrreeaamm,, margarine and non-dairy whip topping

圖2 4 種奶油CDCl3提取物的1H-NMR圖譜放大圖Fig.2 Enlargement of1H-NMR spectra of the lipids of butter, cream, margarine and non-dairy whip topping

圖2為黃油、稀奶油、麥淇淋和植脂奶油的CDCl3提取物的1H-NMR譜圖的放大圖。根據(jù)1H-NMR譜中化學(xué)位移和信號(hào)裂分模式以及1D-TOCSY、1H-1H COSY、J分辨譜等多種NMR圖譜所提供的偶合信息，并參考文獻(xiàn)和相關(guān)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)1H-NMR譜中其他信號(hào)峰進(jìn)行歸屬。在4 種奶油的1H-NMR譜放大圖中，在δ 0.68處都有一個(gè)單峰為甾醇類物質(zhì)13位上角甲基質(zhì)子信號(hào)，黃油和稀奶油圖譜中為膽固醇13位上角甲基質(zhì)子信號(hào)，而麥淇淋和植脂奶油為谷甾醇13位上角甲基質(zhì)子信號(hào)；δ 1.11～1.47為長(zhǎng)鏈脂肪酸一般性亞甲基質(zhì)子信號(hào)，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比分析，得出δ 1.256為飽和脂肪酸鏈上的一般性亞甲基質(zhì)子信號(hào)，δ 1.286為油酸脂肪酸鏈上的一般性亞甲基質(zhì)子信號(hào)，δ 1.298為油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸鏈上的一般性亞甲基質(zhì)子信號(hào)；圖2中10、11號(hào)峰分別為亞麻酸和亞油酸脂肪鏈上兩個(gè)雙鍵之間亞甲基質(zhì)子信號(hào)；12、13、16號(hào)峰為1-戊烯端基雙鍵上的三個(gè)質(zhì)子信號(hào)；14號(hào)峰為1,2-二酰基甘油中2位次甲基質(zhì)子信號(hào)；15、17、18信號(hào)為共軛亞油酸不飽和質(zhì)子信號(hào)。

2.3 PCA結(jié)果

為觀察樣品整體的聚類情況以及是否存在離群點(diǎn)，對(duì)4 種奶油CDCl3提取物NMR譜圖進(jìn)行PCA，結(jié)果見(jiàn)圖3。前兩個(gè)主成分（PC1為67.5%、PC2為16.1%）得分圖可以較好地反映不同種類奶油的叢集分布。其中麥淇淋組、植脂奶油組分別和黃油組、稀奶油組在組間有較好的分離趨勢(shì)，但同屬天然奶油的黃油和稀奶油的分離趨勢(shì)不明顯。這是因?yàn)辄S油和稀奶油的制作原料和工藝較為相似，其甘油三酯中主要脂肪酸的成分也較為相似。同時(shí)得分圖也顯示，植脂奶油組、黃油組和稀奶油組組內(nèi)樣本較為集中，表明這3 組的組內(nèi)差異較??；而麥淇淋組組內(nèi)樣本分布散開，表明其組內(nèi)差異較大。

PCA為無(wú)監(jiān)督的模式識(shí)別方法，這類方法是從數(shù)據(jù)本身出發(fā)，在沒(méi)有任何外界指導(dǎo)的情況下，考察數(shù)據(jù)的整體性質(zhì)以及內(nèi)部變量的各種關(guān)系[31]。但無(wú)監(jiān)督的模式識(shí)別不能忽略組內(nèi)誤差，消除與研究目的無(wú)關(guān)的隨機(jī)誤差，忽略了數(shù)據(jù)的整體特征與變化規(guī)律，不利于尋找組間差異和差異代謝物[7]。因此為了尋找黃油與麥淇淋，稀奶油與植脂奶油之間的化學(xué)差異成分，本研究采用有監(jiān)督的PLS-DA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.4 PLS-D A結(jié)果

PLS-D A是有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，通過(guò)這種處理方法可以最大程度地反映分類組別之間的差異，還可以觀察NMR數(shù)據(jù)和與分類模型相關(guān)的其他變量之間的相關(guān)關(guān)系。分別對(duì)黃油與麥淇淋，稀奶油與植脂奶油的NMR圖譜進(jìn)行PLS-DA，兩個(gè)模型前兩個(gè)主成分的交叉驗(yàn)證Q2分別為0.974和0.963。在此之后，通過(guò)排列實(shí)驗(yàn)隨機(jī)多次（n=200）改變分類變量y的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機(jī)Q2和R2值對(duì)模型有效性做進(jìn)一步的檢驗(yàn)，如圖4所示。以模型可預(yù)測(cè)指標(biāo)Q2并結(jié)合排列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果共同提示，黃油組與麥淇淋組以及稀奶油組與植脂奶油組所建模型成立，說(shuō)明組間出現(xiàn)了顯著性差異。

圖4 黃油與麥淇淋PLS-DA模型（A）、稀奶油與植脂奶油PLS-DA模型（B）排列實(shí)驗(yàn)Fig.4 Permutation test plots for model validation

圖5 PLS-DA得分圖與相關(guān)系數(shù)的載荷圖Fig.5 PLS-DA score plots and loading plots of correlation coefficients for butter against margarine, and cream against non-dairy whip topping

圖5A、C分別為黃油與麥淇淋、稀奶油和植脂奶油的PLS-DA模型得分圖，結(jié)果顯示，在兩個(gè)模型中黃油與麥淇淋、稀奶油和植脂奶油能夠得到很好的區(qū)分。通過(guò)回溯轉(zhuǎn)換得到表示兩個(gè)模型中組間差別的相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖，結(jié)果見(jiàn)圖5B、D以及表3。圖5B顯示：黃油組中的甾醇、丁酸、1-戊烯、共軛亞油酸含量顯著高于麥淇淋組，而總不飽和脂肪酸、亞油酸的含量顯著低于麥淇淋組。同時(shí)，黃油組中的甘油三酯中丙三醇的亞甲基（δ 4.10～4.38）和次甲基（δ 5.24～5.29）信號(hào)顯著高于麥淇淋組，這說(shuō)明黃油比麥淇淋的甘油三酯中所含有更多的短鏈脂肪酸。這些均表明黃油與麥淇淋比較具有顯著性差異（r ＞0.63，n=10，P＜0.05）。圖5D顯示：稀奶油組中的甾醇、丁酸、亞麻酸、亞油酸、1-戊烯、共軛亞油酸、總不飽和脂肪酸含量顯著高于植脂奶油組，而總飽和脂肪酸的含量顯著低于植脂奶油組，表明這兩種奶油比較具有顯著性差異（r ＞0.63，n=10，P＜0.05）。因此，可以看出甾醇、丁酸、共軛亞油酸、1-戊烯、亞油酸、短鏈脂肪酸及總不飽和脂肪酸的含量差異，影響著天然奶油與人造奶油核磁代謝組學(xué)的分類。

表3 黃油與麥淇淋、稀奶油與植脂奶油PLS-DA組間差異化合物及其相關(guān)系數(shù)Table3 Compounds with significant contributions to the discrimination between butter and margarine, and between cream and non-dairy whip topping

此外，在對(duì)黃油與麥淇淋PLS-DA模型相關(guān)系數(shù)的載荷圖（圖5B）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在δ 1.96（a）和δ 2.37（b）兩處的相關(guān)系數(shù)分別為0.80和－0.84，說(shuō)明這兩種物質(zhì)在兩種奶油中的含量具有顯著性差異。由于奶油中甘油三酯結(jié)構(gòu)相似，形成混合甘油酯的1H-NMR譜信號(hào)嚴(yán)重重疊，難以區(qū)分，所以在1H-NMR圖譜中，這兩個(gè)信號(hào)峰與周圍的信號(hào)峰相重疊，難以辨識(shí)，無(wú)法進(jìn)行定性分析。但在相關(guān)系數(shù)的載荷圖中，δ 1.96（a）和δ 2.37（b）信號(hào)被凸顯出來(lái)，有了進(jìn)一步被定性分析的可能。為了進(jìn)一步對(duì)這兩個(gè)峰進(jìn)行定性分析，采用化學(xué)位移選擇性濾波（chemical-shift-selective filter，CSSF）的1D-TOCSY實(shí)驗(yàn)方法，分別對(duì)黃油樣品1H-NMR譜δ 2.37和δ 1.96兩個(gè)化學(xué)位移處進(jìn)行精確激發(fā)，分別得到δ 0.91-1.27～1.35-1.65-2.37和δ 0.90-0.98-1.27～1.37-1.96-5.40兩個(gè)質(zhì)子偶合體系，結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)合2.1節(jié)中對(duì)1H-NMR圖譜指認(rèn)的相關(guān)信息，進(jìn)一步推斷出b為甘油三酯中一飽和脂肪酸，a為單烯烴。

圖6 黃油CDCl3提取物選擇性照射1H的1D-TOCSY的CSSSSFF圖譜Fig.6 1D-TOCSY B (CSSF) spectra of butter extracts obtained with CDCl3with selective excitation of1H

2.5 氣相色譜法測(cè)定脂肪酸

為了對(duì)代謝組學(xué)分析的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，采用氣相色譜法對(duì)B-2（黃油）、M-2（麥淇淋）、C-2（稀奶油）、N-2（植脂奶油）4 種不同具有代表性的奶油中主要的脂肪酸進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。氣相色譜法的測(cè)定結(jié)果表明，與麥淇淋相比，黃油中丁酸、共軛亞油酸含量高于麥淇淋，而總不飽和脂肪酸、亞油酸的含量則低于麥淇淋，同時(shí)黃油中含有的短鏈脂肪酸也要高于麥淇淋；與植脂奶油相比，稀奶油中丁酸、亞麻酸、亞油酸、共軛亞油酸、總不飽和脂肪酸含量高于植脂奶油，而總飽和脂肪酸含量低于植脂奶油。該定量分析結(jié)果與核磁代謝組學(xué)分析結(jié)果基本一致。

表4 4 種奶油中主要脂肪酸含量Table4 Contents of fatty acids in butter, cream, margarine and non-dairy whip topping %

牛乳中脂肪酸組成主要為短鏈脂肪酸（C4～C10）和中鏈脂肪酸（C11～C17），其中含4 個(gè)碳的丁酸為牛乳中所特有的脂肪酸，而天然來(lái)源的共軛亞油酸也是主要存在于反芻動(dòng)物的肉及乳中。植物油中脂肪酸組成主要為中鏈脂肪酸（C11～C17）和長(zhǎng)鏈脂肪酸（大于C18），其中所含的不飽和脂肪酸較多。黃油和稀奶油為天然奶油，均來(lái)源于天然乳脂，所以其脂肪酸組成與牛乳類似，含有丁酸、共軛亞油酸及較多的飽和脂肪酸。麥淇淋則是以植物油為主要原料的人造奶油，其脂肪酸組成與植物油的脂肪酸組成相似，不飽和脂肪酸的含量較高。植脂奶油現(xiàn)多以氫化棕櫚仁油為原料，所以其中的脂肪酸以飽和脂肪酸為主，并且麥淇淋和植脂奶油中均不含有丁酸及共軛亞油酸。因此，代謝組學(xué)的分析結(jié)果與奶油制作原料的脂肪酸組成相符。

3 討 論

由于制作麥淇淋的基料油品種繁多，加上生產(chǎn)工藝的不同，各國(guó)生產(chǎn)的麥淇淋的脂肪成分都存在差別，據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)，目前全世界生產(chǎn)的麥淇淋品種約有500 余種。本研究中PCA及PLS-DA均顯示，與其他3 種奶油相比，麥淇淋的樣本分布較為分散，說(shuō)明其樣本的組內(nèi)差異較大。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步圖譜的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)差異最大的M-7號(hào)樣品所含的不飽和脂肪酸明顯少于另外9 個(gè)麥淇淋樣品。因此，在今后的工作中，需增加麥淇淋的樣本量，使分類模型更加準(zhǔn)確、更具代表性。

奶油中主要的脂類成分為由甘油和脂肪酸形成的甘油三酯，最常見(jiàn)的脂肪酸為棕櫚酸、丁酸等飽和脂肪酸和油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸。由于這些脂肪酸的結(jié)構(gòu)較為相似，形成混合甘油酯的1H-NMR譜信號(hào)嚴(yán)重重疊，難以區(qū)分，同時(shí)脂肪酸的單純甘油酯的標(biāo)準(zhǔn)品也較難獲得，所以使得甘油三酯中的脂肪酸成分的1H-NMR譜分析更加困難。NMR技術(shù)中的1D-TOCSY技術(shù)能夠得到激發(fā)核以及與其在同一個(gè)自旋體系的質(zhì)子的信號(hào)，而非該自旋體系的其他質(zhì)子信號(hào)則不出現(xiàn)在譜圖中。因此，在用NMR方法研究含有多個(gè)脂肪鏈的甘油三酯等化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)時(shí)，可將氫譜中譜峰嚴(yán)重重疊的多個(gè)脂肪酸逐個(gè)分辨出來(lái)。與一般的選擇性1D-TOCSY實(shí)驗(yàn)方法相比，CSSF脈沖序列中有兩個(gè)180梯度選擇可以將J偶合的調(diào)制重聚，并且此序列中的零量子壓制也在一定程度上會(huì)改善圖譜的質(zhì)量，所以對(duì)1D-TOCSY來(lái)說(shuō)CSSF的實(shí)驗(yàn)效果要優(yōu)于不含CSSF的序列，更適于食品等復(fù)雜基質(zhì)的定性圖譜分析。本研究將相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖與CSSF 1D-TOCSY技術(shù)相結(jié)合，對(duì)具有顯著性差異的非目標(biāo)成分進(jìn)行定性分析，為食品安全監(jiān)控工作中非目標(biāo)化合物的定性提供有力技術(shù)支持。

要從根本上解決食品安全性問(wèn)題，首先必需要找到一種判別食品質(zhì)量好壞的方法。目前，紅外、色譜、質(zhì)譜等分析技術(shù)結(jié)合模式識(shí)別的數(shù)據(jù)分析方法在食品摻偽分析、質(zhì)量控制等領(lǐng)域中得到應(yīng)用，但由于這些分析技術(shù)都具有偏性，所以難以完成對(duì)食品復(fù)雜體系的全面分析。與傳統(tǒng)分析方法相比，NMR技術(shù)的脈沖組合豐富多樣，實(shí)驗(yàn)方式靈活多變，在解決非目標(biāo)物的定性分析上更客觀、可靠，大大地提高了所能解決的難度和增加了解決問(wèn)題途徑的多樣性。1H-NMR的譜峰與樣品中各化合物的氫原子一一對(duì)應(yīng)，圖譜中信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)弱反映樣品中各組分的相對(duì)含量，檢測(cè)沒(méi)有偏性，結(jié)合多種NMR手段，能快速實(shí)現(xiàn)對(duì)非目標(biāo)物的定性分析?；贜MR代謝組學(xué)技術(shù)在建立辨別模型、尋找差異化學(xué)成分的同時(shí)，還能結(jié)合多種NMR技術(shù)對(duì)非目標(biāo)成分進(jìn)行定性分析，充分顯示出高場(chǎng)NMR技術(shù)在食品等復(fù)雜混合物體系中對(duì)非目標(biāo)成分快速定性的優(yōu)勢(shì)，為主動(dòng)發(fā)現(xiàn)食品中存在風(fēng)險(xiǎn)積累成功經(jīng)驗(yàn)。并且隨著NMR儀器分辨率的提高、價(jià)格的降低和單次測(cè)試成本降低，基于NMR代謝組學(xué)技術(shù)將在食品安全監(jiān)控工作的實(shí)際應(yīng)用中得到進(jìn)一步發(fā)展。

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Differentiating Butter (Cream) from Margarine (Non-Dairy Whip Topping) Based on Metabolomics by NMR Spectrometry

LI Wei, JIA Jingyi, LI Long, ZHOU Ruize, ZHOU Ya
(Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment, Beijing 100041, China)

Butter and cream are natural food products containing partially saturated animal fat while margarine and non-dairy whip topping contain refine d and preternaturally saturated vegetable oils. Thus, butter and cream are more expensive than margarine and non-dairy whip topping. In the food industry, margarine is widely used as butter while non-dairy whip topping is used as cream. In order to find an analytical tool to differentiate butter (cream) from margarine (non-dairy whip topping), we used1H nuclear magnetic resonance (1H-NMR) to analyze the compositions of extracts (CDCl3) of the four species. We found that the levels of cholesterol, butyrate, 1-penten and conjugated linoleic acid were higher, while total unsaturated fatty acid and linoleic acid were lower in the butter than in the margarine. Cholesterol, butyrate, linoleic acid, linoleic acid, 1-penten, conjugated linoleic acid, and total unsaturated fatty acid were higher while total saturated fatty acid was lower in the cream than in the nondairy whip topping. All these differences were significant (P ＜ 0.05). Partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) was used to find the characteristic components in each group, and the results for fatty acids were consistent with those obtained with gas chromatography (GC). Conclusively, an identification method for butter (cream) and margarine (non-dairy whip topping) based on1H-NMR metabolomics has been established for the first time, which can provide an analytical method for the quality identification and control of butter (cream).

1H nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR); metabolomics; butter; margarine; cream; non-dairy whip topping

10.7506/spkx1002-6630-201712043

TS201.2

A

1002-6630（2017）12-0278-08

李瑋, 賈婧怡, 李龍, 等. 核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)鑒別天然奶油與人造奶油[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 278-285.

10.7506/spkx1002-6630-201712043. http：//www.spkx.net.cn

LI Wei, JIA Jingyi, LI Long, et al. Differentiating butter (cream) from margarine (non-dairy whip topping) based on metabolomics by NMR spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 278-285. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712043. http：//www.spkx.net.cn

2016-07-18

北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助項(xiàng)目（201400002717G316）

李瑋（1984—），女，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：liwei@bjmu.edu.cn