復合菌-荔枝多酚對小鼠抗腹瀉效果及抗氧化性的影響

張軍麗,涂 杜,彭新宇,徐志宏,*

(1.華中農業(yè)大學,湖北武漢 430070;2.廣東省農業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所,廣東廣州 510640)

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復合菌-荔枝多酚對小鼠抗腹瀉效果及抗氧化性的影響

張軍麗1,涂 杜2,彭新宇2,徐志宏2,*

(1.華中農業(yè)大學,湖北武漢 430070;2.廣東省農業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所,廣東廣州 510640)

為研究復合菌-荔枝多酚對小鼠抗腹瀉效果、生長性能及抗氧化的影響,選用96只體重為18～22 g的SPF級昆明小鼠,隨機分為8個處理組:正常組、模型組、陽性對照組、嗜酸乳桿菌組(Lactobacillusacidophilus)、丁酸梭菌組(Clostridiumbutyricum)、荔枝多酚組、復合菌組(Lactobacillusacidophilus和Clostridiumbutyricum)、復合菌-荔枝多酚組,實驗周期為14 d。于實驗第1～14 d分別進行預防性及治療性給藥(除正常組和模型組),定期測所有小鼠體重和采食量,實驗第10 d利用蓖麻油灌胃法制備小鼠腹瀉模型觀察腹瀉指標,實驗第14 d,對各組小鼠血清的SOD和GSH-Px及CAT進行測定。結果表明:造模當天,模型組的體重變化最明顯,腹瀉最嚴重,復合菌-荔枝多酚組抑制小鼠的腹瀉效果最好;抗氧化指標顯示,復合菌組和荔枝多酚組SOD、GSH-Px及CAT含量均顯著高于模型組(p<0.05),而復合菌-荔枝多酚組GSH-Px及CAT含量顯著高于模型組(p<0.05)。本研究表明,對小鼠蓖麻油腹瀉模型,復合菌-荔枝多酚表現(xiàn)出明顯的抗腹瀉和抗氧化效果。

復合菌-荔枝多酚,抗腹瀉效果,生長性能,抗氧化性

腹瀉是許多疾病的共有臨床癥狀,嚴重危害人類健康,對兒童危害極大,是造成兒童營養(yǎng)不良和生長障礙的重要原因,也是造成畜禽幼仔死亡和生長緩慢的主要原因[1]。目前,臨床上多用抗生素治療腹瀉,長期使用抗生素易產生抗藥性以及藥物殘留,同時存在損害胃腸道等問題;益生菌(probiotics)是指含有活菌或死菌,包括菌體成分及代謝產物的生物制品。服用后可改善機體微生物與酶的平衡,通過動物消化道生物的競爭排斥作用,幫助動物建立有利于宿主的胃腸道微生物區(qū)系,具有刺激機體特異性與非特異性免疫、預防腹瀉,促進生長,提高飼料利用率等優(yōu)點[2]。隨著人民生活水平和消費水平的提高,對農產品國際市場競爭壓力的增加以及對濫用抗生素危害認識的深入,益生菌制劑受到越來越多的關注,其在飼料和功能食品領域必將具有十分廣闊的發(fā)展空間[3]。因此尋找安全、高效、無殘留的微生態(tài)制劑或植物源活性成分來替代抗生素成為研究的熱點之一。

作為益生素家族中一員的嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus),是動物腸道中的重要微生物[4]。因其無毒、無害,常被制成微生物添加劑,用于改善動物腸道功能、促進動物生長和預防疾病[5]。丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)又名酪酸菌,具有提供營養(yǎng)、促進代謝、維持人和動物腸道健康等作用,尤其對治療由腸道菌群紊亂引起的炎癥、急慢性腹瀉、腸易激綜合征等疾病效果顯著[6]。荔枝多酚可以抗氧化,有效緩解機體損傷;抑菌消炎,抗病毒,提高機體的免疫力,可以預防疾病,預防癌癥,抗肥胖[7]。荔枝多酚含有豐富的黃酮化合物,Dicarlo等研究發(fā)現(xiàn)一定量的黃酮類化合物能夠通過α2-腎上腺素和鈣系統(tǒng)抑制蓖麻油導致的腹瀉和腸腔積液[8]。本實驗擬建立小鼠蓖麻油致腹瀉模型,模擬人和動物因環(huán)境(溫度、濕度)變化,食物變化等應激反應導致的腹瀉,研究復合菌-荔枝多酚對小鼠的抗腹瀉、抗氧化作用以及生長性能的影響,探討復合菌-荔枝多酚抗腹瀉的生物學機制,為研制出高效、綠色、安全的新型抗腹瀉復方制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級昆明種小鼠 雌雄各半,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證號:SCXK(京)2014-0004,小鼠雌雄分開,正壓通風,空調調節(jié)溫度,溫度為(26±1) ℃,光照周期12 h明12 h暗,小鼠自由飲食與飲水,適應性飼養(yǎng)一周;嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus,GIMCC GIM1.730)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum,GIMCC GIM1.676) 廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心;MRS培養(yǎng)基、梭菌增菌培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;荔枝多酚(荔枝皮提取) 純度95%,由華中農業(yè)大學食品學院實驗室提供;蓖麻油 湖北科田藥業(yè)有限公司;洛哌丁胺 西安楊森制藥有限公司;超氧化物歧化酶試劑盒(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒(GSH-Px)、過氧化氫酶試劑盒(CAT) 南京建成生物工程研究所;其他試劑 均為國產分析純。

UV-3100PC型紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;XS-205DU型Metter-Toledo-xs十萬分一天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州奧華儀器有限公司;ELX-800型全自動酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;Eppendorf-5804R型低溫/高速離心機 德國Eppendorf公司;LRH-150F型系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計 本實驗選用96只體重為18～22 g的SPF級昆明小鼠,雌雄各半,隨機分為8個處理組:正常組、陽性對照組、模型組、嗜酸乳桿菌組、丁酸梭菌組、荔枝多酚組、復合菌、復合菌-荔枝多酚組,實驗周期為14 d。每天各組定時按10 mL/kg體重灌胃藥物或無菌去離子水,正常飲食。每天上午8:00正常組、模型組給予無菌去離子水,陽性對照組按洛哌丁胺3 mg/kg濃度灌胃;荔枝多酚組按荔枝多酚300 mg/kg的濃度灌胃;嗜酸乳桿菌組灌胃濃度1010～1011cfu/mL的嗜酸乳桿菌培養(yǎng)液;丁酸梭菌組灌胃濃度105～106cfu/mL丁酸梭菌培養(yǎng)液;復合菌組按上述丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌菌液1∶1體積混合灌胃;復合菌-荔枝多酚組按上述丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌溶液1∶1體積混合灌胃。每天下午3:00復合菌-荔枝多酚組再按10 mL/kg的體重灌胃300 mg/kg的荔枝多酚,其他組灌胃等劑量的無菌去離子水。第10 d所有小鼠(除正常組)按每只0.5 mL灌胃蓖麻油建立腹瀉模型,之后每天仍按10 d前的方式按時灌胃。第14 d摘眼球取血后,按照實驗動物標準處死小鼠。

1.2.2 菌種培養(yǎng) 嗜酸乳桿菌活化后,接種量為5%于MRS培養(yǎng)基中,培養(yǎng)時間為12 h,丁酸梭菌活化后接種量為5%于梭菌增菌培養(yǎng)基中,培養(yǎng)時間為24 h,溫度均為37 ℃。在上述培養(yǎng)條件下均達到穩(wěn)定期,分別采用MRS培養(yǎng)基、梭菌增值培養(yǎng)基三次重復進行活菌計數(shù),嗜酸乳桿菌近似可達1010～1011cfu/mL,丁酸梭菌近似可達105～106cfu/mL。按時培養(yǎng)后直接灌胃小鼠。

1.2.3 生長性能測定 實驗第1、5、9、10、14 d定時(08:00)及第10 d下午3:00稱量小鼠體重,并計算各處理組小鼠采食量,平均采食量及平均體重。采食量=飼料投放量-第2 d 飼料剩余量;平均采食量=12只小鼠總采食量/12;平均體重=12只小鼠總體重/12。

1.2.4 腹瀉指標的測定 實驗第10 d,除正常組外,其它組均灌胃蓖麻油后8組全部禁食4 h。每只小鼠灌胃0.5 mL蓖麻油后放入鋪有濾紙的鼠籠內,每籠一只,觀察小鼠腹瀉情況后放入原來的籠子繼續(xù)喂養(yǎng)。(小鼠大便大致分為5種:正常便;外形正常,但含水多便;外形不正常的軟便;水樣便;黏液便),前2種為正常便,后3種視為腹瀉便。統(tǒng)計小鼠灌服蓖麻油4 h內的開始腹瀉時間、腹瀉次數(shù)、稀便重量、并計算稀便率以及腹瀉抑制率[9]:

表1 復合菌-荔枝多酚對小鼠體重的影響Table 1 Effects of compound probiotics-litchi polyphenol on the body weight of mice

注:同列肩注無字母表示均值間差異不顯著(p>0.05)。開始腹瀉時間(min)=第一次腹瀉時間-灌胃時間;

稀便重量=腹瀉后濾紙重量-濾紙前重量-正常糞便量;

稀便率(%)=(每只小鼠稀便數(shù)/每只小鼠總便數(shù))×100;

腹瀉抑制率(%)=(模型組腹瀉次數(shù)-處理組腹瀉次數(shù))/模型組的腹瀉次數(shù)×100。

1.2.5 檢測指標及方法 小鼠摘眼球采血靜置后,血樣4000 r/min離心5 min分離血清于-20 ℃保存待測。采用試劑盒法測定各組小鼠血清的SOD、GSH-PX、CAT值,具體操作參照試劑盒說明書進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析計量資料采用平均數(shù)±標準差表示,多組間平均數(shù)比較采用單因素方差分析法,兩兩比較采用Duncan多重比較法。

2 結果與分析

2.1 體重與采食量

由表1可見,造模前后其它各組與模型組比較,小鼠體重均無顯著性差異(p>0.05)。Stanton等研究表明,益生菌能直接產生氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質,補充機體營養(yǎng)成分,促進畜禽生長[10]。復合菌組、嗜酸乳桿菌組、丁酸梭菌組均未表現(xiàn)出促增長的作用,可能是喂養(yǎng)小鼠時間還不夠長。而荔枝多酚組和益生菌-荔枝多酚組均與模型組比較差異不顯著是由于攝入一定量的荔枝多酚具有抗肥胖的作用,與Qi等研究報道一致[11]。由圖1可見,模型組第10 d造模前后體重變化幅度較大,其它各組均與模型組差異顯著(p<0.05),表明給藥組所受蓖麻油腹瀉影響較小,具有抵抗腹瀉的作用。

圖1 復合菌-荔枝多酚對小鼠第10 d體重變化的影響Fig.1 The effects of compound probiotics-litchi polyphenol on the weight change of mice at the 10th day注:1:正常組;2:模型組;3:陽性對照組;4:嗜酸乳桿菌組;5:丁酸梭菌組;6:荔枝多酚組;7:復合菌組;8:復合菌-荔枝多酚組;不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

由圖2可見,由于造模當天(第10 d)正常組無腹瀉處理,飲食正常,其他組受腹瀉的影響飲食量減少,從而采食量與模型組差異顯著(p<0.05),其他時間的采食量各組之間并無差異顯著性。

圖2 復合菌-荔枝多酚對模型小鼠采食量的影響Fig.2 Effects of compound probiotics-litchi polyphenol on the feed intake of mice

2.2 腹瀉指標

由表2可見,造模當天陽性對照組、荔枝多酚組、復合菌組、復合菌-荔枝多酚組的開始腹瀉時間、稀便重量、腹瀉平均次數(shù)、稀便率均與模型組差異顯著(p<0.05),嗜酸乳桿菌組開始腹瀉時間、腹瀉平均次數(shù)與模型組差異顯著(p<0.05),并且復合菌-荔枝多酚組腹瀉抑制率是各組中最高的,達到36%,說明小鼠蓖麻油致腹瀉模型建立成功。荔枝多酚組、復合菌組和復合菌-荔枝多酚組均具有顯著的抗腹瀉效果,主要是荔枝多酚能抑制脂肪酶活性導致蓖麻油在十二脂腸內受脂肪分解酶的這一過程受到阻礙,從而達到抗腹瀉的效果。荔枝皮提取的多酚中含有6種獨立存在的多酚:沒食子酸、綠原酸、兒茶素、咖啡酸、表兒茶素和蘆丁[12],還含有黃酮化合物(槲皮素和山柰酚)和糖苷類物質[13]。槲皮素、蘆丁、兒茶素、山柰酚既屬于多元酚又屬于黃酮類化合物,而多元酚和蛋白具有親和力,與脂肪酶有聚集效應,從而使多元酚能夠抑制脂肪酶的活性[14]。嗜酸乳桿菌組能延遲腹瀉,減輕腹瀉次數(shù)。主要是當其達到一定數(shù)量時,能夠抑制病原微生物在宿主腸道中的存活和生長,起到屏障作用;消除乳糖不耐癥;減輕和抑制腸道腹瀉;增強機體免疫功能;降低膽固醇水平等[15]。由于荔枝多酚和嗜酸乳桿菌的雙重抗腹瀉效果,其中復合菌-荔枝多酚組的腹瀉抑制效果最好,該研究結果表明,荔枝多酚、嗜酸乳桿菌和丁酸梭菌復合比單獨使用效果更好,具有協(xié)同作用。

表2 復合菌-荔枝多酚對小鼠腹瀉的影響Table 2 Effects of compound probiotics-litchi polyphenol on the diarrhea of mice

注:同列相同字母表示差異不顯著(p>0.05);同列不同字母表示差異顯著(p<0.05),表3同。

表3 益生菌-荔枝多酚對小鼠血清SOD、GSH-PX、CAT的影響Table 3 Effects of compound probiotics-litchi polyphenol on the SOD,GSH-PX,CAT of mice serum

2.3 對小鼠血清SOD、GSH-PX、CAT的影響

由表3可知,荔枝多酚組、復合菌組與模型組的SOD、GSH-PX、CAT均差異顯著。表明荔枝多酚、復合菌能夠顯著提高腹瀉后小鼠的抗氧化性。研究發(fā)現(xiàn)荔枝皮中富含荔枝多酚,并且在DPPH和FRAP實驗中荔枝皮中的自由酚和結合酚有明顯的抗氧化效果[12]。在過去十年中,一些研究者認為益生菌能夠減少氧化應激,例如嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌[16]。也有人報道出嗜酸乳桿菌除了防止氧化應激和還可以降低自由基的積累[17]。與本研究結果相一致,測定中嗜酸乳桿菌組GSH-PX和CAT指標與模型組比較差異顯著(p<0.05),荔枝多酚組、復合菌組抗氧化指標與模型組比較均差異顯著(p<0.05)。國外研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加丁酸梭菌能夠提高肉雞血清抗氧化能力并增強機體免疫功能,促進蛋白質代謝,進而改善肉雞的生長性能[18]。本實驗中丁酸梭菌并沒有提高蓖麻油致瀉后小鼠的抗氧化水平,具體原因尚不清楚。復合菌-荔枝多酚組與模型組GSH-PX、CAT值差異顯著,SOD值差異不顯著,可能是丁酸梭菌影響了整體的抗氧化性。

3 結論

由嗜酸乳桿菌、丁酸梭菌和荔枝多酚聯(lián)用,對小鼠的生長性沒有促進作用,而在抗腹瀉和抗氧化方面,復合菌-荔枝多酚對小鼠蓖麻油腹瀉模型體現(xiàn)出明顯的抗腹瀉、抗氧化效果,對于其它腹瀉模型是否具有同樣的效果仍需進一步探究。

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The effect of compound probiotics-litchi polyphenol on antidiarrhea and antioxidation of mice

ZHANG Jun-li1,TU Du2,PENG Xin-yu2,XU Zhi-hong2,*

(1.Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China;2.Institute of Animal Health,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou 510640,China)

Ninety-six SPF Kunming mice with 18～22 g body weight were randomly divided into 8 groups to investigate the effect of compound probiotics-litchi polyphenol on antidiarrhea,growth performance and antioxidation of mice. Health group,model group,positive control group,Lactobacillusacidophilusgroup,Clostridiumbutyricumgroup,litchi polyphenol group,compound probiotics(LactobacillusacidophilusandClostridiumbutyricum)group,compound probiotics-litchi polyphenol group were included in present study. From the 1th to 14th day of the experimental period,the mice were administered for prevention and therapy purpose except for health group and model group,all weight and feed intake were measured regularly. At the 10th day,the diarrhea model in mice was prepared by intragastrical administration of castor oil.At the 14th day,the serum SOD,GSH-Px and CAT were assessed.Results showed that,weight change and diarrhea of model group were most obvious at the 10 th day.The diarrhea inhibition effect of compound probiotics-litchi polyphenol group was best. Antioxidant indexes suggest that compound probiotics group and litchi polyphenol group were significantly higher than that of model group on SOD,GSH-Px and CAT(p<0.05),compound probiotics-litchi polyphenol with the model group had higher difference on GSH-Px and CAT(p<0.05).It is demonstrated that the compound probiotics-litchi polyphenol have obvious antidiarrhea and antioxidant effect in the castor oil diarrhea mice model.

compound probiotics-litchi polyphenol;antidiarrhea effect;growth performance;antioxidation

2016-11-28

張軍麗(1990-),女,在讀碩士研究生，研究方向:食品化學,E-mail:1741318250@qq.com。

*通訊作者:徐志宏(1965-),男,碩士，研究員,研究方向:營養(yǎng),E-mail:545976530@qq.com。

廣東省科技計劃項目(2015A020209080);廣州市科技計劃項目(201604020138)。

TS255.3

A

1002-0306(2017)10-0364-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.062