香蓼總多酚超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性評價

茍體忠,常 飛,王 翔

(1.凱里學(xué)院富硒中草藥研究中心,貴州凱里 556011;2.凱里學(xué)院植物資源綜合利用研究所,貴州凱里 556011;3.黔東南民族藥綜合利用工程技術(shù)研究中心,貴州凱里 556011)

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香蓼總多酚超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性評價

茍體忠1,2,3,常 飛2,王 翔3

(1.凱里學(xué)院富硒中草藥研究中心,貴州凱里 556011;2.凱里學(xué)院植物資源綜合利用研究所,貴州凱里 556011;3.黔東南民族藥綜合利用工程技術(shù)研究中心,貴州凱里 556011)

優(yōu)化香蓼總多酚提取工藝,探討總多酚的抗氧化活性。以超聲波輔助提取方法,乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時間為因素,采用正交實驗,對香蓼總多酚提取工藝進行優(yōu)化,得到優(yōu)化香蓼總多酚的提取條件:提取溫度30 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶50和超聲25 min,提取2次,香蓼總多酚的含量為(94.6±0.15) mg/g,平均回收率為100.07%,變異系數(shù)為1.00%(n=5)。并通過1,1-二苯-2-苦基肼自由基(DPPH·)清除率和總抗氧化活性的測定對香蓼總多酚進行體外抗氧化活性評價,結(jié)果顯示:香蓼總多酚的總抗氧化活性和DPPH·清除率均明顯高于特丁基對苯二酚(TBHQ),且香蓼總多酚DPPH·半數(shù)抑制濃度(EC50=5.5 μg/mL)優(yōu)于TBHQ(EC50=18.0 μg/mL)。香蓼總多酚是一種天然的抗氧化活性劑和自由基清除劑。

香蓼,總多酚,超聲波輔助提取,抗氧化活性

香蓼(PolygonumviscosumBuch.-Ham.ex D.Don.)是蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)植物香蓼的全草,植株具有特殊香味,味辛,性溫,其全草入藥,具有理氣除濕、健胃消食等功效[1],這些功效可能與香蓼中的多酚類物質(zhì)有關(guān)。總多酚是多羥基酚類化合物的總稱,具有抗氧化、清除自由基等活性[2]?？寡趸钚允侵参锟偠喾拥囊粋€重要性質(zhì),其抗氧化能力與多酚類物質(zhì)的含量和種類有關(guān)[3]。因此,植物多酚的提取和抗氧化活性研究已成為關(guān)注的熱點。

目前,植物多酚的提取方法主要包括超聲波輔助提取[4-5]、超聲協(xié)同酶法提取[6]、回流法提取[7]、酶法輔助提取[8]、微波協(xié)同輔助提取[9]等,這些方法均能有效提取植物中的總多酚,然而,由于超聲波產(chǎn)生的機械振動能夠有效破壞細胞結(jié)構(gòu),從而加速了多酚的溶出,有效縮短了提取時間,同時避免了高溫對多酚成分的破壞[10],因此,超聲提取法已廣泛應(yīng)用于植物多酚的提取。

近年來,有關(guān)香蓼的報道較少,大多數(shù)學(xué)者主要對其揮發(fā)成分進行了研究[11-15],然而對香蓼總多酚的超聲波輔助提取工藝及其體外抗氧化活性研究尚未見報道。鑒于此,本文采用L9(33)正交實驗設(shè)計對香蓼中總多酚的超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化,并采用1,1-二苯-2-苦基肼自由基(DPPH·)清除率和總抗氧化活性能力評價其抗氧化活性,以期為香蓼的綜合開發(fā)利用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蓼 采自凱里市菜市場,經(jīng)植物學(xué)博士鑒定為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)植物香蓼(PolygonumviscosumBuch.-Ham.ex D.Don.，PV)的全草,香蓼樣品于70 ℃烘箱中干燥,再用植物粉碎機粉碎并過200目篩,待用;1,1-二苯-2-苦基肼自由基(DPPH·)、三氯乙酸、沒食子酸、Folin & ciocalteu’s酚試劑(F-C)和特丁基對苯二酚(TBHQ) 為aladdin試劑;其它試劑 均為分析純。

UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司;FW200粉碎機 北京科偉永興儀器有限公司;SHA-C水浴振蕩器 鞏義予華儀器有限公司;WH-300超聲波清洗機 濟寧萬和超聲電子設(shè)備有限公司;TD5M低速離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;FA2004電子天平 上海衡平儀器儀表廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 香蓼總多酚的提取 準(zhǔn)確稱取1.0 g香蓼樣品于50 mL離心管中,加入一定比例乙醇溶液,在30 ℃水浴中超聲(超聲波功率300 W)提取2次,離心5 min,合并上清液,用乙醇定容至100 mL,即得香蓼總多酚提取液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取0. 125 g沒食子酸用超純水定容至1000 mL。分別吸取該標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 3、0. 6、0. 9、1.2、1.5 mL于5個25 mL比色管中,加超純水至5.0 mL,搖勻,再加入Folin-Ciocalteu(FC)酚試劑1.0 mL,混勻,然后加入6.0 mL 10% Na2CO3溶液,并用超純水定容至刻度,搖勻。然后在暗室中放置2 h,并于760 nm波長下測定其吸光度。以沒食子酸濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。

1.2.3 香蓼提取液總多酚含量的測定 取香蓼提取液0.2 mL于25 mL比色管中,按1.2.2步驟測定其吸光度,再根據(jù)回歸方程計算香蓼提取液總多酚的濃度,并按下式計算其總多酚含量及得率:

香蓼總多酚含量(mg/g)=(C×VB×10-3×VT)/(VR×m)

式中:C為總多酚濃度(μg/mL);VB為比色管量程(25 mL);VT為提取液總體積(100 mL);VR為反應(yīng)體系中香蓼提取液體積(0.2 mL);m為香蓼質(zhì)量(g)。

香蓼總多酚得率(%)=香蓼總多酚含量×10-3×100

1.3 香蓼總多酚提取工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素實驗設(shè)計 曠慧等[17]研究表明,提取溫度在40 ℃時,多酚的得率達最大值。此外,由于隨著超聲時間的推移,水浴溫度會高于設(shè)定溫度,考慮到提取溫度過高會使多酚發(fā)生氧化或降解等一些不可逆的化學(xué)反應(yīng)[18],從而降低總多酚的得率。因此,本文設(shè)定超聲溫度為30 ℃,并主要考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和超聲時間對香蓼總多酚得率的影響。

1.3.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 固定料液比為1∶20 g/mL、超聲時間為30 min,考察體積分?jǐn)?shù)為10%、30%、50%、70%和90%的乙醇對香蓼總多酚得率的影響。

1.3.1.2 料液比的選擇 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%,超聲時間為30 min,考察1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50 g/mL的料液比對香蓼總多酚得率的影響。

1.3.1.3 超聲時間選擇 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%,料液比為1∶40 g/mL,考察5、15、25、35和45 min的超聲時間對香蓼總多酚得率的影響。

1.3.2 正交實驗設(shè)計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,采用L9(34)正交實驗篩選香蓼總多酚的最佳提取工藝,因素與水平見表1。

表1 香蓼總多酚提取工藝正交實驗因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for the extract process of total polyphenol from P. viscosum

1.4 香蓼總多酚抗氧化活性實驗

1.4.1 總抗氧化活性的測定 總抗氧化活性的測定方法參照文獻[19]。取0.2 mL不同濃度的提取液,并依次加入2.5 mL的 pH=6.6 的磷酸鹽緩沖液和1%(m/v)鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶液,搖勻,置于50 ℃水浴振蕩器中振蕩20 min。然后加入2.5 mL 10%(m/v)三氯乙酸溶液,搖勻并取混液 2.5 mL,再加入2.5 mL 超純水以及 0.1%(m/v)氯化鐵溶液,搖勻,靜置 10 min,在 700 nm 處測定吸光度(A),以超純水代替提取液作為空白并測定其吸光度 A0。則總抗氧化活性可以用ΔA 來表示(ΔA=A-A0),其值越大,總抗氧化活性越強。

1.4.2 DPPH·清除率的測定 DPPH·清除率的測定方法參照文獻[20]。在25 mL比色管中依次加入2 mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液和2 mL不同濃度的提取液,搖勻,并在暗室中放置30 min,以無水乙醇為參比液,在517 nm下測定其吸光值A(chǔ),同時測定2 mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液與2 mL無水乙醇混合液的吸光值A(chǔ)0。根據(jù)下式計算樣品溶液對DPPH·的清除率:

DPPH·的清除率(%)=(1-A/A0)×100

1.5 數(shù)據(jù)處理

運用Excel、SPSS 11.0、Origin8.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以沒食子酸濃度(C)為橫坐標(biāo),以760 nm波長處的吸光度(A)為縱坐標(biāo)作圖,并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為A=0.1093C+0.0519,回歸系數(shù)R2=0. 9998,表明沒食子酸濃度在1.5～7.5 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對香蓼總多酚得率的影響 從圖1可見,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,香蓼總多酚得率逐漸增加,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時,香蓼總多酚得率達到最大值,隨后其得率降低?？赡苁怯捎陔S著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加,其它醇溶性物質(zhì)溶出,從而影響總多酚浸出[21]。因此,乙醇體積分?jǐn)?shù)過低或過高均不利于香蓼總多酚的提取,本文選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、90%進行正交實驗。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對香蓼總多酚得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on total polyphenol yield of P. viscosum注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);圖2、圖3同。

2.2.2 料液比對香蓼總多酚得率的影響 從圖2可見,隨著料液比增加,香蓼總多酚得率逐漸增加,當(dāng)料液比為1∶40 g/mL時,香蓼總多酚得率達到最大值,隨后其得率降低。這可能是由于隨著溶劑體積的增加,部分可溶性雜質(zhì)含量也逐漸增加[21],從而使香蓼多酚含量降低。根據(jù)實驗結(jié)果,選擇料液比為1∶30、1∶40和1∶50三個水平進行正交實驗。

圖2 料液比對香蓼總多酚得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on total polyphenol yield of P. viscosum

2.2.3 超聲時間對香蓼總多酚得率的影響 從圖3可見,當(dāng)超聲時間為15 min時,香蓼總多酚得率達到最大值,隨后得率迅速降低。分析認(rèn)為,隨著超聲時間的增加,部分非酚類物質(zhì)溶出,同時超聲波強大的機械剪切作用對多酚類物質(zhì)造成破壞[22],從而導(dǎo)致香蓼總多酚得率降低。根據(jù)實驗結(jié)果,選擇5、15和25 min三個水平進行正交實驗。

圖3 提取時間對香蓼總多酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on total polyphenol yield of P. viscosum

2.3 正交實驗結(jié)果與分析

正交實驗和方差分析結(jié)果見表2和表3。由表2和表3 可知,每個因素水平的不同,其香蓼總多酚的平均得率不同,此時,可從表2中選擇k值最大的水平A2、B2、C3組合成最優(yōu)水平A2B2C3,而實驗方案中總多酚得率最大的3號實驗處理的水平組合為A1B3C3。因此,對最優(yōu)水平組合A2B2C3與實驗方案中總多酚得率最大的3號實驗處理的水平組合A1B3C3進行驗證實驗。

表3 正交實驗的方差分析Table 3 Analysis variance of the orthogonal experiment

表2 香蓼總多酚提取工藝正交實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results of total polyphenol extraction from P. viscosum

2.4 驗證實驗

為了驗證正交實驗最佳組合的可行性,分別準(zhǔn)確稱取1.0 g香蓼粉末樣品于6個50 mL離心管中,并根據(jù)k值所得組合(A2B2C3)和9組實驗中的最大得率的組合(A1B3C3)參數(shù),在30 ℃水浴條件下,超聲提取2次,每個組合3份平行樣,并按1.2.3節(jié)測定香蓼總多酚的得率。實驗結(jié)果表明,A2B2C3和A1B3C3兩個組合的總多酚的得率分別為9.10%±0. 04%和9.46%±0.04%。分析認(rèn)為,超聲波輔助提取香蓼總多酚的最佳組合為A1B3C3,即乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,料液比1∶50,超聲提取時間25 min。

2.5 香蓼總多酚的含量

在最佳提取工藝條件下,香蓼提取液中總多酚含量為(94.6±0.15) mg/g。

2.6 回收率和重現(xiàn)性實驗

分別準(zhǔn)確稱取1.0 g香蓼粉末樣品和100 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于5個50 mL離心管中,并按正交實驗最佳組合(A1B3C3)的參數(shù)進行同步實驗和測定,測定結(jié)果見表4。

表4 回收率測定結(jié)果Table 4 Determination results of recovery rate

從表4可知,平均回收率為100.07%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.00,變異系數(shù)為1.00%。分析結(jié)果表明,建立的香蓼總多酚提取工藝穩(wěn)定可靠,且重現(xiàn)性好。

2.7 香蓼總多酚體外抗氧化活性分析

2.7.1 香蓼總多酚對總抗氧化活性的影響 香蓼總多酚(PV)及其對照組(TBHQ)總抗氧化活性分析結(jié)果見圖4。從圖4可見,隨著香蓼總多酚(PV)和TBHQ濃度的增加,其總抗氧化活性逐漸增加,且香蓼總多酚(PV)的總抗氧化活性明顯強于對照組(TBHQ)。此外,在45～225 μg/mL濃度范圍內(nèi),香蓼總多酚(PV)與TBHQ的總抗氧化活性均具有良好的線性關(guān)系,其線性方程分別為ΔA=7.7778C+0.1900(r=0.9971),ΔA=2.4083C+0.1613(r=0.9984)。香蓼總多酚濃度與總抗氧化活性之間較高的正相關(guān)關(guān)系也表明在香蓼中的主要抗氧化活性成分為酚類物質(zhì)[23]。分析結(jié)果表明,香蓼總多酚具有較強的總抗氧化活性,是天然的抗氧化活性劑。

圖4 香蓼總多酚對總抗氧化活性能力的影響Fig.4 Effection of total polyphenol on total antioxidant power from P. viscosum注：不同小寫字母表示不同濃度間差異顯著(p<0.05)。

2.7.2 香蓼總多酚(PV)對DPPH·清除能力的影響 香蓼總多酚(PV)及其對照組(TBHQ)DPPH·清除能力見圖5。從圖5可見,香蓼總多酚(PV)的DPPH·清除能力明顯優(yōu)于對照組(TBHQ)。此外,在4.5～22.5 μg/mL濃度范圍內(nèi),它們的DPPH·清除率均存在良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程分別為Y=2.7838X+37.72(r=0.8906)和Y=2.5917X+4.1173(r=0.9959),香蓼總多酚濃度與DPPH·清除率之間較高的正相關(guān)關(guān)系也表明在香蓼中的主要抗氧化活性成分為酚類物質(zhì)[23]。同時,為了量化香蓼總多酚和對照組(TBHQ)的DPPH·清除能力,采用EC50來衡量香蓼總多酚和TBHQ 的EC50值DPPH·清除能力的大小,其EC50表示DPPH·清除率為50%所對應(yīng)的濃度。采用SPPSS 11.0計算香蓼總多酚和TBHQ的EC50,其值越小表示清除DPPH·能力越強。香蓼總多酚和TBHQ 的EC50值分別為5.5 μg/mL和18.0 μg/mL。結(jié)果表明,香蓼總多酚清除DPPH·的能力遠遠高于TBHQ?？梢娤戕た偠喾泳哂休^強的DPPH·清除能力,是天然的抗氧化活性劑。

圖5 香蓼總多酚對DPPH·清除能力的影響Fig.5 Effection of total polyphenol on DPPH· scavenging rate from P. viscosum

3 結(jié)論

香蓼總多酚的最佳提取工藝參數(shù):提取溫度30 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,料液比1∶50 g/mL,超聲提取時間25 min,在以上最優(yōu)條件下,該提取工藝的平均加標(biāo)回收率為100.07%,變異系數(shù)為1.00%,香蓼總多酚得率為9.46%,提取物中總多酚的含量為(94.6±0.15) mg/g。此外,香蓼總多酚的總抗氧化活性和DPPH·清除能力與其濃度有關(guān),且明顯優(yōu)于對照組(TBHQ),是一種天然的抗氧化活性劑和自由基清除劑。

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Optimization of ultrasonic assisted extraction technology of total polyphenol fromPolygonumviscosumand its antioxidant activity evaluationinvitro

GOU Ti-zhong1,2,3,CHANG Fei2，WANG Xiang3

(1.Research Center of Selenium-riched Chinese Herbs,Kaili University,Kaili 556011,China;2.Institute of Comprehensive Utilization of Plant Resource,Kaili University,Kaili 556011,China;3.Qiandongnan Engineering and Technology Research Center for Comprehensive Utilization of National Medicine,Kaili 556011,China)

The extract process of total polyphenol fromPolygonumviscosumwas optimized and the antioxidant activity of total polyphenolinvitrowas evaluated. Ethanol concentration,solid to liquid ratio,and extrction time were chosen as the independent variables using ultrasonic-assisted extration method. The optimum technological parameters of ultrasonic-assisted extraction for total polyphenol fromP.viscosumwere studied via the orthogonal experiment. Finally,the optimal extraction conditions were obtained:extraction temperature 30 ℃,ethanol concentration was 50%(v/v),the ratio of solid to liquid was 1∶50,ultrasonic time was 25 min,and extraction times were 2 times. It was found that the total polyphenols content from theP.viscosumwas (94.6±0.15) mg/g,average recovery rate of total polyphenol was 100.07%,variation coefficient was 1.00%(n=5).The antioxidant activity was determined though 1,1-Dipheny l-2-picrylhydrazyl free radical(DPPH·)scavenging rate and total antioxidant activity test. The results indicated that the antioxidant activity of total polyphenol inP.viscosumwas stronger than that in tertiary butylhydroquinone(TBHQ),and the EC50value(5.5 μg/mL)of DPPH· scavenging rate fromP.viscosumwas better than the EC50value(18.0 μg/mL)of TBHQ. Total polyphenol inP.viscosumis a natural antioxidant and free radical scavenger.

Polygonumviscosum;total polyphenol;ultrasonic-assisted extraction;antioxidant activity

2016-11-08

茍體忠(1981-)，男，博士，副教授，主要從事硒的環(huán)境化學(xué)、生物化學(xué)和天然藥物化學(xué)方面的研究,E-mail:gtz810110@126.com。

國家青年自然科學(xué)基金(41303016);貴州省教育廳優(yōu)秀人才項目(黔教合KY字[2012]099號)；貴州省教育廳“高層次人才引進項目”(院科通[2012]7號)；凱里學(xué)院分析化學(xué)重點學(xué)科(院通字[2014]157號)；貴州省教育質(zhì)量提升工程項目(黔教合KY字[2014]228號);凱里學(xué)院博士啟動基金(BS201503)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)10-0281-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.045