雙參通冠方對心肌梗死模型大鼠VEGF表達(dá)和炎性因子的影響

王永剛，李彩紅，于遠(yuǎn)望，鐘 偉，齊 婧，尚俊平

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)心腦血管病研究所，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二 附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000）

雙參通冠方對心肌梗死模型大鼠VEGF表達(dá)和炎性因子的影響

王永剛1,2，李彩紅1,2，于遠(yuǎn)望1，鐘 偉1,2，齊 婧1,2，尚俊平1,2

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)心腦血管病研究所，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二 附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000）

目的 研究雙參通冠方對急 性心肌梗死模型大鼠的VEGF表達(dá)和炎性因子的影響。方法 SD大鼠分為模型組、空白組、雙參通冠低劑量組(2.5 g/kg)、中劑量組(5 g/ kg)、高劑量組(7.5 g/kg)，采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支建立大鼠心肌梗死模型，灌胃給藥2周后，取大鼠的心肌組織，Western blot法檢測大鼠的心肌組織VEGF蛋白表達(dá)，Elisa法檢測心肌組織勻漿中IL-1、IL-6、TNF-α、CRP的含量。結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠心肌組織中VEGF表達(dá)增高，心肌組織勻漿中IL-1、IL-6、TNF-α、CRP的含量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）；與模型組比較，雙參通冠方低劑量組、中劑量組和高劑量組VEGF表達(dá)增多，雙參通冠方低劑量組IL-6、TNF-α含量均降低，雙參通冠方中劑量和高劑量組IL-1、IL-6、TNF-α、CRP含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與雙參通冠方中劑量組比較，低劑量組IL-1、IL-6、CRP含量增高和VEGF表達(dá)降低，高劑量組TNF-α、CRP含量降低和VEGF表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 雙參通冠方可減輕大鼠心肌炎性反應(yīng)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)缺血部位血管新生，對心肌具有保護(hù)作用，可能與增加VEGF的表達(dá)和抑制心肌的炎性因子有關(guān)。

雙參通冠方；心肌梗死；VEGF；炎性因子

《中國心血管病報(bào)告2015》指出，心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，急性心肌梗死（AM I）病死率總體亦呈現(xiàn)上升態(tài)勢[1]。近年來，國際大型隨機(jī)臨床試驗(yàn)[2]證實(shí)：冠脈血運(yùn)重建療法（冠脈介入治療和冠脈搭橋術(shù)）僅能使部分患者獲益，且治療后出現(xiàn)的無復(fù)流現(xiàn)象、再狹窄、支架內(nèi)血栓形成等問題仍欠缺較好的解決辦法。國內(nèi)外大量臨床試驗(yàn)[3]所證實(shí)，益氣活血類的中藥復(fù)方對冠心病均有一定的治療效果，能夠促使缺血心肌的血管新生和側(cè)支循環(huán)形成。本研究擬采用雙參通冠方干預(yù)心肌梗死大鼠模型，檢測心肌組織VEGF的表達(dá)和白介素-1（IL-1)、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、C反應(yīng)蛋白(CRP）的含量，探索其促血管新生和側(cè)枝循環(huán)形成的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，75只。由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號：SCXK-（軍）2014-005。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食24 h，術(shù)前4 h禁飲。

1.2 儀器與試劑 BW-BM 1103小動物呼吸機(jī)，上海軟隆科技發(fā)展有限公司；GS-15R冷凍離心機(jī)，美國Bekman公司；Ascent全自動酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；紫外分光光度計(jì)，美國Pharmacia公司；DYY-6C電泳儀，北京儀器廠；GDS7600凝膠圖像分析儀，英國UVP公司。ELISA試劑盒（IL-1、IL-6、TNF-α、CRP），上海滬尚生物科技有限公司。

1.3 藥物 雙參通冠方（由丹參、人參、紅景天、三七粉、降香等組成，按2:2:1:0. 5:0. 5 的比例配伍，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室制備），雙參通冠低劑量2.5 g/kg、中劑量5 g/ kg、高劑量7.5 g/ kg（分別相當(dāng)于生藥材的4、8、12 g）。

1.4 方法

1.4.1 分組與給藥 75只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、雙參通冠低劑量組、雙參通冠中劑量組、雙參通冠高劑量組，每組15只?？瞻捉M和模型組給予生理鹽水，雙參通冠低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)濃度的湯藥，10 mL/kg灌胃，1次/d，共14 d。

1.4.2 心肌梗死模型制備 大鼠稱重，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖，氣管插管連接小動物呼吸機(jī)，經(jīng)左前胸3-4肋間開胸，充分暴露心臟，用6-0無創(chuàng)縫線結(jié)扎左冠狀動脈主干支（在動脈圓錐與左心耳之間距主動脈根部約1 mm處），心電示波器顯示Ⅱ?qū)?lián)J點(diǎn)或ST段抬高＞0.2 mV，局部心肌顏色變暗后迅速關(guān)胸縫合。術(shù)后腹腔注射青霉素40萬U，防止感染。

1.5 觀察指標(biāo) 末次給藥后2 h處死大鼠，暴露大鼠心臟，剪取左心室經(jīng)液氮后保存于- 80 ℃的冰箱中保存?zhèn)錂z。1）心肌組織勻漿制備：自冰箱取出大鼠心肌組織，解凍后用冰鹽水漂洗，取0. 3 g心肌組織，用眼科剪刀剪碎，置于預(yù)冷的玻璃勻漿器中，將搗桿垂直充分研磨6～8 min，使組織勻漿化，低溫4 000 r/min離心15 min后取上清液，采用Elisa法檢測心肌組織中IL-1、IL-6、TNF-α、CRP的含量。2）Western blot法檢測VEGF 蛋白表達(dá)：分別取各組大鼠心肌組織，裂解沉淀離心去上清，以冷PBS 洗滌2 次，加入上樣緩沖液，100 ℃ 5 min，取25 μg 蛋白樣品經(jīng)10%SDSPAGE，120 V 80 min 電泳分離總蛋白，以半干式電轉(zhuǎn)儀100 V 80 min 轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜。膜用含5%脫脂奶的PBST 室溫孵育1 h 后，加入羊抗大鼠多克隆VEGF 一抗稀釋度為1: 300，β-actin一抗，4 ℃雜交過夜。次日洗膜3 次，每次15 min，加入兔抗羊IgG 二抗，室溫孵育1 h，TBS漂洗，應(yīng)用ECL 試劑盒行發(fā)光反應(yīng)，圖像掃描分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，組間比較有顯著差異進(jìn)一步行q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，若方差不齊采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般狀況 造模組大鼠可見精神萎靡，毛色枯槁，嗜臥少動，畏冷蜷縮，食量減少，伴腹瀉、稀便，體質(zhì)量減輕等。給予雙參通冠方藥后，上述癥狀部分好轉(zhuǎn)?？瞻捉M大鼠活潑好動，皮毛光亮，體質(zhì)量增加。造模與給藥期間，模型組大鼠死亡5只，雙參通冠方低劑量和中劑量組各死亡3只，雙參通冠方高劑量組大鼠死亡1只。其原因?yàn)榻Y(jié)扎冠狀動脈后出現(xiàn)嚴(yán)重的心律失常死亡。舍棄其他組多余大鼠，各組均取10只。

2.2 對心梗模型大鼠心肌組織勻漿IL-1、IL-6、TNF-α、CRP含量的影響 見表1。

表1 雙參通冠方對心梗模型大鼠心肌組織勻漿IL-1、IL-6、TNF-α、CRP含量的影響（x±s，n=10） ng/L

2.3 對心梗模型大鼠心肌組織VEGF表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠心肌組織VEGF表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.05）；與模型組比較，雙參通冠方低劑量組、中劑量組和高劑量組VEGF表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與雙參通冠方中劑量組比較，低劑量組VEGF表達(dá)降低，高劑量組VEGF表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

3 結(jié)論

心肌梗死屬于中醫(yī)“真心痛”的范疇，其病因多因寒凝氣滯、血瘀痰濁阻絡(luò)，心脈突然閉阻，氣血運(yùn)行中斷而引發(fā)。其病位在心，主要病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí),而在急性期則尤以標(biāo)實(shí)為主。陳可冀院士認(rèn)為主要病機(jī)為“血脈瘀滯、心脈不通”，倡導(dǎo)以活血化瘀法作為基本治法[4]。路志正認(rèn)為病機(jī)為胸中陽氣虛衰, 邪侵陽位, 氣機(jī)痹阻。衛(wèi)氣虛弱，寒邪痹遏胸陽；營氣不足，心失榮養(yǎng)；營衛(wèi)失?？梢鹱跉獠焕绿弁?。故治療以調(diào)和陰陽、調(diào)理脾胃、暢通氣血, 使?fàn)I衛(wèi)和諧、宗氣旺盛、胸陽振奮、血脈貫通, 胸痹自愈[5]。

雙參通冠方由丹參、人參、紅景天、三七粉、降香等組成，具有益氣活血、通絡(luò)止痛的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[6-9]表明：丹酚酸A能有效抑制心肌缺血及心肌梗死引起的血清肌酸磷酸激酶活性升高以及乳酸脫氫酶的釋放，減少心肌耗氧量，可調(diào)節(jié)血脂水平并保護(hù)游離脂肪酸導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，明顯改善冠脈血流量、心肌缺血程度及心肌缺血范圍，減輕心肌梗死。人參皂甙Rg1刺激心肌局部組織分泌G-CSF 而誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞游走至局部缺 血組織, 進(jìn)而發(fā)揮其高度自我復(fù)制和多分化能力向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)缺血心肌組織的毛細(xì)血管再生及血流供應(yīng)的維護(hù)。人參總皂苷可上調(diào)心肌組織VEGF和bFGF 基因表達(dá)、促進(jìn)血管新生而增加血液供應(yīng)，增加梗死區(qū)域及其周邊CD31陽性微血管密度，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建 立，縮小心肌梗死面積，減輕梗死區(qū)心肌纖維化，抑制心室重構(gòu)。紅景天苷通過上調(diào)VEGF 的表達(dá)而促大鼠心肌梗死后心肌組織的血管新生。

研究[10-11]還表明，血管新生受各種因子的影響，促血管新生因子可降解細(xì)胞外基質(zhì)，增加血管壁的通透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。VEGF 在新生血管形成的過程中發(fā)揮著重要的作用，VEGF 與其受體結(jié)合后促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分化、增殖和遷移，是血管新生和心肌側(cè)枝循環(huán)形成的重要信號通路蛋白。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，雙參通冠方可通過改善大鼠心肌的炎性反應(yīng)和VEGF的表達(dá)，促進(jìn)缺血心肌微血管新生和側(cè)枝循環(huán)的形成，減輕心肌梗死的程度。

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Effects ofS huangshen Tongguandecoction on infl ammatory factor and VEGF expression in rats model w ith myocardial infarction

WANG Yonggang1,2, LI Caihong1,2, YU Yuanwang1, ZHONG Wei1,2, QI Jing1,2, SHANG Junping1,2
(1.Cardio-Cerebrovascular Diseases Institute, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712000, Shaanxi Province, China;
2.The Second Affi liated Hospital, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712000, Shaanxi Province, China)

Objective To study the effects of Shuangshen Tongguan decoction on infl ammatory factor and VEGF expression in rats model w ith myocardial infarction. Methods SD rats were divided into model group, blank group, Shuangshen Tongguan decoction low dose group (2.5 g/kg), m iddle dose group (5 g/kg) and high dose group (7.5 g/kg). Myocardial infarction model was established by ligation of left anterior descending coronary artery. A ftertwo weeks of intragastric adm inistration, the myocardial tissue of rats was taken. Western blot method was used to detect the expression of VEGF protein in myocardial tissue of rats, and the content of IL-1, IL-6, TNF-α, CRP were detected by Elisa.Results Compared w ith the blank group, the VEGF expression of model group in rat myocardial tissue was increased, IL-6, IL-1, TNF -α and CRP content in the myocardial tissue homogenate was increased, the difference was statistically signifi cant (P<0.05); Compared w ith model group, the VEGF expression of Shuangshen Tongguan decoction low dose group, m iddle dose group and high dose group was increased, IL-6 and TNF-α content of Shuangshen Tongguan decoction low dose group was decreased, IL-1, IL-6, TNF-α and CRP levels of Shuangshen Tongguan decoction m iddle and high dose group were decreased, the difference was statistically signifi cant (P<0.05); Compared w ith Shuangshen Tongguan decoction m iddle dose group, IL-1, IL-6 and CRP level of slow dose group was increased and the VEGF expression was reduced, TNF-α and CRP of the high dose group were decreased while the VEGF expression was increased, the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion Shuangshen Tongguan decoction could reduce myocardial inflammatory reaction of rats, promote vascular endothelial cell proliferation, induce ischem ia parts of angiogenesis and protect myocardial. This may be related to increased expression of VEGF and inhibition of infl ammatory factor in myocardium.

Shuangshen Tongguan decoction; myocardial infarction; VEGF; infl ammatory factor

R285.5

A

2095-6258（2017）03-0348-04

2016-08-05）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.03.002

陜西省科技廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2015JM 8384）;陜西省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（15-SCJH017）;陜西省第五批重點(diǎn)?？菩哪X血管病科建設(shè)項(xiàng)目；國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)?？菩难懿】平ㄔO(shè)項(xiàng)目。

王永剛（1977 -），男，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥干預(yù)心腦血管疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。