電項(xiàng)針對失眠大鼠腦干單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

吳建麗，王天琪，王永亮，杜冬梅，史文強(qiáng)，王 薇*

（1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)針灸研究所，哈爾濱 150040；2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院， 哈爾濱 150001）

電項(xiàng)針對失眠大鼠腦干單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

吳建麗1，王天琪1，王永亮2，杜冬梅1，史文強(qiáng)2，王 薇1*

（1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)針灸研究所，哈爾濱 150040；2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院， 哈爾濱 150001）

目的 通過觀察不同刺激頻率電項(xiàng)針對PCPA致失眠大鼠腦干內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）和去甲腎上腺素（NE）含量的影響，初步探討電項(xiàng)針促眠的作用機(jī)制及不同刺激頻率電項(xiàng)針的療效差異。方法 將Wistar大鼠50只隨機(jī)分成5組，即正常組，模型組，電項(xiàng)針1組（取刺激頻率2 Hz）、電項(xiàng)針2組（取刺激頻率50 Hz）、電項(xiàng)針3組（取刺激頻率100 Hz）。除正常組外，各組采用腹腔注射對氯苯丙氨酸（PCPA）制備大鼠失眠模型。造模成功后，電項(xiàng)針各組分別按各自刺激頻率給予干預(yù)治療，1次/d，30 min/次，連續(xù)7 d，治療后留取腦干組織檢測單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、NE的含量變化。結(jié)果 模型組大鼠腦干組織中5-HT含量明顯低于正常組，DA、NE含量高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；經(jīng)電項(xiàng)針治療7 d后，失眠大鼠腦干5-HT含量升高，DA、NE含量顯著降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；電項(xiàng)針各組之間療效比較，電項(xiàng)針1組明顯優(yōu)于電項(xiàng)針2和電項(xiàng)針3組（P ＜0.05）；電項(xiàng)針2和電項(xiàng)針3組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 電項(xiàng)針改善失眠的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)失眠大鼠腦干內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、NE的質(zhì)量濃度有關(guān)；電項(xiàng)針2組療效優(yōu)于其他2組，說明2 Hz刺激頻率電項(xiàng)針治療失眠效果更好。

失眠；電項(xiàng)針；腦干；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)

隨著人們工作和生活節(jié)奏加快，失眠的發(fā)病率不斷升高。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，我國普通人群中有45.4%的人存在睡眠問題，其中失眠比例高達(dá)28.0%，失眠已經(jīng)嚴(yán)重困擾了人們的正常生活，甚至?xí)?dǎo)致心理疾病和意外傷害等。西醫(yī)治療失眠主要應(yīng)用鎮(zhèn)靜催眠藥物和抗抑郁藥等，但存在成癮性和依賴性等毒副反應(yīng)，長期應(yīng)用還會損傷認(rèn)知功能[2]。針灸治療失眠有見效快、作用穩(wěn)定、多靶性治療、簡單易行、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。電項(xiàng)針療法[5]是高維濱教授采用傳統(tǒng)針灸學(xué)理論與現(xiàn)代神經(jīng)解剖學(xué)相結(jié)合而創(chuàng)立的治療腦部神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新方法，臨床應(yīng)用治療失眠疾病效果顯著，但是其作用機(jī)理尚未被明確揭示?，F(xiàn)代研究表明腦干內(nèi)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與睡眠和覺醒狀態(tài)密切相關(guān)，故本實(shí)驗(yàn)通過觀察失眠大鼠治療前后對腦干內(nèi)5-HT、DA和NE含量的影響，初步探究電項(xiàng)針治療失眠的療效及作用機(jī)制，同時(shí)評價(jià)不同頻率電項(xiàng)針間的療效差異，為臨床上應(yīng)用電項(xiàng)針治療失眠并采用效果最佳的刺激頻率提供一定治療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量220～250 g，9周齡，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（黑）2013-001。實(shí)驗(yàn)大鼠自由進(jìn)食飼料和水，室內(nèi)飼養(yǎng)溫度為（23±1）℃，濕度維持在45%～65%。

1.1.2 動物分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將50只大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即正常組，模型組，電項(xiàng)針1組（取刺激頻率2 Hz）、電項(xiàng)針2組（取刺激頻率50 Hz）、電項(xiàng)針3組（取刺激頻率100 Hz）。每組各10只，用苦味酸染色標(biāo)記編號。

1.1.3 儀器與試劑 6805-AⅡ型電針儀（汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠有限公司）；一次性無菌針灸針（北京中研太和醫(yī)療器械有限公司）；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）；梅特勒XS105型精密分析天平（瑞士產(chǎn)）；HHS21-6電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；VERSA max酶標(biāo)儀（購自美國Molecular Devices公司）；PCPA（美國Sigma公司）；大鼠5-HT、DA、NE ELISA測定試劑盒（南京建成生物研究所）。

1.2 方法

1.2.1 建立失眠動物模型 根據(jù)肖成榮等[6]文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用PCPA法制備大鼠失眠模型。將PCPA按30 mg/mL溶于弱堿性生理鹽水（pH 7.0～8.0），并用超聲波振蕩器促進(jìn)藥物溶解，配置后藥物呈乳白色混懸液。除正常組外，其余各組連續(xù)2 d于每日上午9:00腹腔注射PCPA，劑量為10 mL/kg，1次/d。大鼠于第1次注射28～30 h后，有以下表現(xiàn)表示造模成功：晝伏夜行節(jié)律消失，白天活動不停，對周圍聲音、光刺激敏感，興奮性增高，容易嘶叫打斗，飲食和二便明顯增多，整體觀察與正常組明顯不同。

1.2.2 干預(yù)治療 造模成功后，每日將大鼠四肢和軀體固定，選用雙側(cè)的“風(fēng)池”和“供血”穴，常規(guī)消毒，取0.25 mm×25 mm無菌針灸針向?qū)?cè)鼻尖方向刺入，深度約7 mm，將電針連于針柄，同一根線上下連接，同時(shí)各治療組選用相應(yīng)的刺激頻率：電項(xiàng)針1組刺激頻率為2 Hz、電項(xiàng)針2組刺激頻率為50 Hz、電項(xiàng)針3組刺激頻率為100 Hz。刺激強(qiáng)度以大鼠出現(xiàn)頭部震動，但使不劇烈掙扎嘶叫為度，1次/d，30 min/次，連續(xù)治療7 d。正常組和模型組大鼠每日以相同方式抓取固定30 min，不做其他處置。

1.2.3 取材 治療7 d后，所有大鼠采用頸椎脫臼法處死，用剪刀從正中將頭皮剪開剝離，從耳孔處插入向另一側(cè)耳孔剪開顱骨，再用骨鉗分開顱骨，在冰盒上迅速分離出腦干，用冰冷生理鹽水沖洗，且用濾紙吸干水分，分別稱重后放入標(biāo)記好的EP管內(nèi)。迅速冰凍于液氮中1 m in，放入-80 ℃保存?zhèn)溆?。測定時(shí)，將腦干組織在冰浴條件下加入按重量1∶9加入冷生理鹽水，用玻璃勻漿器手動勻漿、離心沉淀（4 ℃，6 000 r/min，15 min），取上清液待用。

1.2.4 指標(biāo)檢測 應(yīng)用ELISA方法在VERSA max酶標(biāo)儀上測定腦干組織內(nèi)5-HT、DA、NE的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，結(jié)果用ng/L單位表示。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所用數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析和描述，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，且組間方差齊性的比較采用單因素方差分析（ANOVA），不滿足此條件的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般活動及體征觀察 所有大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)期內(nèi)晝夜節(jié)律正常，精神狀態(tài)良好，飲食和二便正常。在連續(xù)2 d腹腔注射PCPA混懸液后，睡眠—覺醒周期消失，說明造模成功。表現(xiàn)為大鼠白天睡眠減少，精神萎靡，攻擊性強(qiáng)，易激惹。經(jīng)過電項(xiàng)針治療后大鼠的睡眠周期逐漸恢復(fù)，白天活動減少，不易驚醒，閉目倦臥時(shí)間增多，其中電項(xiàng)針1組大鼠失眠狀態(tài)改善最為明顯。

2.2 失眠大鼠腦干內(nèi)5-HT、DA、NE含量比較 見表1。

表1 大鼠腦干組織內(nèi)5-HT、DA、NE含量比較（x±s，n=10） ng/L

3 討論

5-HT能神經(jīng)元主要位于腦干中縫核，研究[7-10]發(fā)現(xiàn)，破壞中縫核或向腦內(nèi)注射神經(jīng)毒素，可以阻斷5-HT的合成導(dǎo)致動物出現(xiàn)完全性失眠，而在失眠期間注射5-HT睡眠將恢復(fù)正常，因此，5-HT被認(rèn)為是腦內(nèi)的“致眠因子”。腦橋藍(lán)斑核是NE能神經(jīng)元最密集的地方，研究發(fā)現(xiàn)，損毀藍(lán)斑核尾部時(shí)NE含量明顯下降，快波睡眠被完全抑制，而損毀頭部則對快波睡眠無影響；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，藍(lán)斑核受損后，腦電圖上快波顯著減少，出現(xiàn)睡眠樣慢波，但此時(shí)動物在行為上仍可行走，可見NE與腦電覺醒和快波睡眠的產(chǎn)生密切相關(guān)。DA在中腦黑質(zhì)系統(tǒng)主要傳遞興奮性作用，但實(shí)驗(yàn)[11]表明，破壞中腦DA系統(tǒng)后，動物腦電圖上出現(xiàn)覺醒的快波，行為上卻不能表現(xiàn)為覺醒，可知行為覺醒與DA水平有關(guān)?？傊?，這3種神經(jīng)遞質(zhì)大多存在于腦干離散部位，通過作用腦干區(qū)域的突觸活動而共同調(diào)節(jié)睡眠—覺醒周期。

風(fēng)池、供血穴是電項(xiàng)針治療失眠的主穴，兩穴的解剖結(jié)構(gòu)下就是與睡眠密切相關(guān)的部位：腦干。脈沖電流通過風(fēng)池、供血穴經(jīng)過脊髓后角到達(dá)腦干，通過腦干上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)增加大腦皮質(zhì)的興奮性，恢復(fù)大腦皮層興奮與抑制的平衡，改善失眠狀態(tài)[12]。同時(shí)二穴位于頸部椎-基底動脈附近，針刺后可以擴(kuò)張腦部血管，增加腦血流量[13]，改善腦干細(xì)胞代謝，使腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的功能恢復(fù)正常，調(diào)整睡眠－覺醒周期。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠腦干組織中5-HT含量明顯低于正常組，DA和NE含量高于正常組（P ＜0.05），表明造模影響了腦干內(nèi)5-HT、DA及NE的含量水平，這3種物質(zhì)的含量異常是導(dǎo)致大鼠失眠的原因之一。與模型組相比，經(jīng)過3種不同頻率的電項(xiàng)針治療后，5-HT水平均上升，DA及NE均下降（P ＜0.05）。表明應(yīng)用電項(xiàng)針治療后能調(diào)節(jié)腦干內(nèi)單胺類遞質(zhì)含量水平，加深慢波睡眠量，促進(jìn)睡眠發(fā)生，恢復(fù)睡眠周期節(jié)律。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)刺激頻率為2 Hz的療效優(yōu)于50 Hz和100 Hz，這可能是頻率快慢與其產(chǎn)生的補(bǔ)瀉作用有關(guān)，一般認(rèn)為，＜3 Hz的低頻具有興奮作用，可“補(bǔ)虛”，而＞50 Hz的高頻具有解痙鎮(zhèn)痛的作用，可“瀉實(shí)”，二者之間的頻率具有平補(bǔ)平瀉的作用。失眠的主要病機(jī)為衛(wèi)強(qiáng)營弱，陽不入陰，其治療原則為補(bǔ)虛瀉實(shí)，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，治療失眠的關(guān)鍵在于恢復(fù)大腦興奮與抑制的平衡。本方法的機(jī)理是白天運(yùn)用低頻脈沖電流刺激項(xiàng)部的風(fēng)池和供血穴，通過腦干網(wǎng)狀上行激活系統(tǒng)增強(qiáng)大腦皮層的興奮性，發(fā)揮低頻“補(bǔ)”的作用，恢復(fù)興奮與抑制之間的平衡。

綜上所述，電項(xiàng)針治療失眠的機(jī)理與增加腦干單胺類遞質(zhì)5-HT含量，降低DA及NE含量有關(guān)，且低頻刺激的效果更優(yōu)。

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Research of electro-nape-acupuncture on the contents of monoam ine neurotransm itters in brainstem of insomnia rats

WU Jianli1, WANG Tianqi1, WANG Yongliang2, DU Dongmei1, SHI Wenqiang2, WANG Wei1*
(1. Research Institute of Acupuncture and Meridians of Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China；2. The Second Affi liated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150001, China)

Objective To observe the effect of different frequencies of electro-nape-acupuncture (ENA) on the contents of monoam ine neurotransm itters 5-hydroxytryptam ine (5-HT), dopam in (DA) and norepinephrine (NE) in brainstem of insomnia rats induced by PCPA, to discuss primarily the mechanism of promoting sleep and therapeutic effi cacy of different frequencies of ENA. Methods Fifty Wistar rats were random ly divided into fi ve groups, those are normal group, model group, ENA groupⅠ(stimulus frequency of 2 Hz), ENA groupⅡ(stimulus frequency of 50 Hz) and ENA group Ⅲ (stimulus frequency of 100 Hz). The animal models of insomnia were established by parachlorophenylalanine (PCPA) intraperitoneal injection in each group except normal group. After duplicating the modelssuccessfully, each ENA group rats were treated by ENA therapy at different stimulus frequencies respectively for seven consecutive days, 1 time/day, 30m in/time. After treatment the brainstems were taken and measured the contents of neurotransmitters 5-HT, DA and NE.Results The content of 5-HT were significantly lower and the contents of DA and NE were higher in the animal model of rats than that in the normal group, there were statistically signifi cant differences (P <0.05); A fter the seven days of ENA treatment, the 5-HT content increased and the DA and NE contents decreased in brainstems of insomnia rats. Compared w ith the model group, there were signifi cant differences (P<0.05). Among the ENA groups, ENA groupⅠwas greatly superior to ENA groupⅡand ENA group Ⅲ at regulating the levels of monoam ine neurotransm itters (P<0.05), however, there were no statistically signifi cant difference between ENA group Ⅱand ENA group Ⅲ (P >0.05).Conclusion The mechanism of ENA improve the structure of sleep may involve the regulation of monoam ine neurotransm itters 5-HT, DA and NE contents in brainstem of insomnia rats．

insomnia; electro-nape-acupuncture; brainstem; monoam ine neurotransm itter

R749.7

A

2095-6258（2017）03-0358-04

2016-10-12）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.03.005

哈爾濱市科技局科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)資金“基于電項(xiàng)針對睡眠剝奪大鼠促眠作用的機(jī)制研究”（2015RAQXJ093）。

吳建麗（1986 -），女，碩士研究生，助理研究員，主要從事針灸治療睡眠障礙性疾病研究。

*通信作者：王 薇，電話-13796190978，電子信箱-1533236349@qq.com