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    人成體神經(jīng)干細(xì)胞長期培養(yǎng)后遺傳穩(wěn)定性研究

    2017-06-19 16:47:44陳世明章瑾王卓然宣丹英毛鐘鳴陳鵬翾
    中國醫(yī)藥生物技術(shù) 2017年3期
    關(guān)鍵詞:端粒酶端粒干細(xì)胞

    陳世明,章瑾,王卓然,宣丹英,毛鐘鳴,陳鵬翾

    人成體神經(jīng)干細(xì)胞長期培養(yǎng)后遺傳穩(wěn)定性研究

    陳世明,章瑾,王卓然,宣丹英,毛鐘鳴,陳鵬翾

    神經(jīng)干細(xì)胞因具有自我更新、增殖和多向分化潛能[1],神經(jīng)干細(xì)胞移植已成為治療神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和神經(jīng)退行性疾病的新方法[2-5]。但神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)仍存在許多技術(shù)難點(diǎn),培養(yǎng)過程中細(xì)胞易分化或凋亡,難以長期培養(yǎng)[6]。且培養(yǎng)過程中易產(chǎn)生遺傳漂變、微生物污染、細(xì)胞交叉污染等問題[7]。培養(yǎng)傳代時(shí),一般使用化學(xué)性酶,如胰蛋白酶等分離神經(jīng)干細(xì)胞球,酶的多次使用對長期培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞可能產(chǎn)生累積損傷[8-11]。因此,經(jīng)體外長期培養(yǎng)后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化能力,尤其是遺傳信息穩(wěn)定性依然未知。我們以物理方法切割分離神經(jīng)干細(xì)胞球,并改良了神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液,成功實(shí)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞的體外長期培養(yǎng)[12]。但該方法是否存在遺傳不穩(wěn)定性仍需要進(jìn)行研究。本文通過對體外傳代培養(yǎng)不同時(shí)間的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行短串重復(fù)序列(STR)分析和端粒酶活性鑒定,為神經(jīng)干細(xì)胞的體外長期培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)基購自美國 Hyclone 公司;人重組表皮細(xì)胞生長因子(rhEGF)、人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子(rhbFGF)、N2 Supplement 均購自美國 Gibco公司;16 位點(diǎn) STR 試劑盒和 2800 M DNA 標(biāo)準(zhǔn)品購自美國 Promega 公司;TeloTAGGG 端粒酶 PCR-ELISA 試劑盒購自瑞士羅氏公司;巢蛋白購自武漢博士德生物工程有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 取流產(chǎn)胎兒腦組織,在無菌條件下分離出海馬組織,D-Hank’s 液清洗,眼科剪剪成小組織塊,加入 0.25% 的 TP-EDTA 消化 10 min,胰酶抑制劑終止其消化。用 100 目不銹鋼細(xì)胞過濾篩過濾,去除大組織塊,離心收集沉淀細(xì)胞。將沉淀細(xì)胞重懸于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基,制成單細(xì)胞懸液。經(jīng)過細(xì)胞計(jì)數(shù)后以(1 ~ 2)× 106/ml接種到 T75 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于 5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài),3 ~ 4 d半量更換神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基一次。每月用自行研制的干細(xì)胞球切割器切割分離傳代一次。

    1.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞球及分化細(xì)胞觀察 分別取神經(jīng)干細(xì)胞球懸液滴于經(jīng)多聚賴氨酸包被的蓋玻片上,置 37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h,使細(xì)胞黏附于載玻片上,倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并照相記錄。

    1.2.3 神經(jīng)干細(xì)胞的 STR 分析法 按 STR 試劑盒說明書操作,檢測體外培養(yǎng) 2、6、12 和 30 個(gè)月的神經(jīng)干細(xì)胞的短串聯(lián)重復(fù)序列。取 1 × 106個(gè)細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,加入裂解液裂解,再加入平衡酚、氯仿、異戊醇提取 DNA,無水乙醇清洗后棄上清,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行 STR 測序。

    1.2.4 神經(jīng)干細(xì)胞端粒酶活性檢測 按端粒酶試劑盒說明書檢測體外培養(yǎng) 2、6、12、24 個(gè)月的神經(jīng)干細(xì)胞。空白對照為 DEPC 水,陰性對照選擇 RNase 處理的神經(jīng)母細(xì)胞瘤 IMR-32 細(xì)胞,陽性對照選擇神經(jīng)母細(xì)胞瘤 IMR-32 細(xì)胞及試劑盒提供的人腎細(xì)胞 293 凍干粉。取培養(yǎng)后的神經(jīng)干細(xì)胞,胰酶消化,臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)。取約 2 × 105個(gè)細(xì)胞,加入裂解液裂解,孵育、離心后取上清進(jìn)行端粒酶催化特異底物反應(yīng)的 PCR。PCR 產(chǎn)物變性后按試劑盒要求用地高辛標(biāo)記的特異探針雜交,而后用偶聯(lián)過氧化物酶的抗地高辛抗體行 ELISA 反應(yīng),酶標(biāo)儀測定 ELISA 結(jié)果(檢測波長為 450 nm,參考波長為 690 nm)。測定值大于 0.25 為端粒酶陽性。

    2 結(jié)果

    2.1 神經(jīng)干細(xì)胞球及分化細(xì)胞觀察

    傳代培養(yǎng) 30 個(gè)月神經(jīng)干細(xì)胞球形態(tài)見圖 1,神經(jīng)干細(xì)胞的分化細(xì)胞形態(tài)見圖 2。

    圖 1 倒置顯微鏡下觀察人神經(jīng)干細(xì)胞球(× 100)

    2.2 STR 分析

    通過檢測發(fā)現(xiàn),2、6、12 和 30 個(gè)月培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞均有相同的短串連重復(fù)序列(表 1)。

    圖 2 神經(jīng)干細(xì)胞球部分分化[A:經(jīng)誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞球(× 100);B:神經(jīng)干細(xì)胞分化后的神經(jīng)細(xì)胞(× 100);C:神經(jīng)干細(xì)胞分化后的神經(jīng)細(xì)胞(× 200);D:神經(jīng)干細(xì)胞分化后的神經(jīng)細(xì)胞(× 400)]

    表 1 不同培養(yǎng)時(shí)間的神經(jīng)干細(xì)胞短串連重復(fù)序列檢測結(jié)果

    2.3 端粒酶活性測定

    結(jié)果(圖 3)顯示,陽性對照和 IMR-32 細(xì)胞具有較高的端粒酶活性。2、6、12、24 個(gè)月培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞均為陰性。

    3 討論

    圖 3 不同培養(yǎng)時(shí)間的神經(jīng)干細(xì)胞端粒酶活性

    神經(jīng)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中極易分化,并發(fā)生微生物污染、細(xì)胞間交叉污染等問題,長期傳代培養(yǎng)又易導(dǎo)致細(xì)胞遺傳信息的漂移和變異[13],進(jìn)而出現(xiàn)異常分化、基因不穩(wěn)定和癌變等現(xiàn)象,因此,在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)過程中,對其遺傳穩(wěn)定性的檢測尤為重要。實(shí)驗(yàn)中神經(jīng)干細(xì)胞球的形態(tài)在30 個(gè)月內(nèi)無明顯變化。體外培養(yǎng) 30 個(gè)月后神經(jīng)干細(xì)胞球分化后,可見典型神經(jīng)元形態(tài)及星型膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài),可判斷此類細(xì)胞仍具有良好的增殖和分化能力。

    短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)在遺傳病及親子鑒定等方面已廣泛應(yīng)用,但在細(xì)胞培養(yǎng)中,主要檢測基因變異和細(xì)胞交叉污染[14]。通常情況下,每一個(gè) STR 位點(diǎn)會(huì)被 5% ~ 20% 的人們所共有,理論上聯(lián)合應(yīng)用 16 個(gè) STR 位點(diǎn),其個(gè)體識(shí)別率可達(dá) 99.9999999998%。在細(xì)胞培養(yǎng)過程及 STR 過程中的微量 DNA 污染,會(huì)造成錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。STR 檢測過程中,DNA 樣品提取純化的質(zhì)量、緩沖液的微小差異、離子強(qiáng)度、引物濃度等,甚至不同的熱循環(huán)條件,都會(huì)引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。本實(shí)驗(yàn)通過對神經(jīng)干細(xì)胞特殊基因位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析,不但檢測了交叉污染情況,也能說明長期培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的 30 個(gè)月時(shí)間內(nèi),Penta E、D18S51、D21S11、TH01、D3S1358,Penta D、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818,F(xiàn)GA、TPOX、D8S1179、vWA、Amelogenin 位點(diǎn)在不同時(shí)間段均具有相同的基因重復(fù)次數(shù),可準(zhǔn)確判斷細(xì)胞具有穩(wěn)定的遺傳信息,且無任何交叉污染,各組之間并無遺傳突變。

    干細(xì)胞在自我更新、增殖分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面與腫瘤細(xì)胞有著相似的生物學(xué)特征,尤其是在自我更新越頻繁的組織中,干細(xì)胞自我更新越快,腫瘤發(fā)生率越高[15]。因此,在神經(jīng)干細(xì)胞長期培養(yǎng)過程中,對其不同階段的癌變可能性檢測十分必要。而對細(xì)胞端粒酶的活性檢測,不僅能滿足以上要求,還能從側(cè)面反應(yīng)出細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性。端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(TRAP)的誕生及應(yīng)用,大大提高了檢測的敏感度,已成為端粒酶活性檢測最常用的方法。端粒酶活性檢測實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞的培養(yǎng)、使用細(xì)胞量、RNA 提取及 ELISA 反應(yīng)條件,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中培養(yǎng)至 2、6、12、24 個(gè)月,神經(jīng)干細(xì)胞的端粒酶活性均為陰性,而神經(jīng)母細(xì)胞瘤 IMR-32 細(xì)胞具有較高的端粒酶活性。端粒酶能修復(fù)延長端粒,可以讓端粒不會(huì)因細(xì)胞分裂而有所損耗,使得細(xì)胞分裂的次數(shù)增加。當(dāng)端粒酶活性不足以抑制端粒長度的縮短,致使細(xì)胞喪失增殖能力[16]。Ostenfeld 等[17]研究表明,人神經(jīng)干細(xì)胞的端粒較短,并隨著細(xì)胞分裂進(jìn)一步縮短,致使神經(jīng)干細(xì)胞不能在體外長期傳代。而腫瘤細(xì)胞端粒酶活性很高,每次腫瘤細(xì)胞分裂后縮短的端粒被端粒酶延長,致使細(xì)胞長期無限增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng) 12 ~ 24 個(gè)月后,端粒酶活性與之前各組并未顯示顯著差異,自我更新、增殖分化能力亦未見異常,可能與神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)和傳代的特殊方法有關(guān),也可能與端粒酶測試方法的敏感度有關(guān),具體原因有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

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    10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.015

    310018 杭州,浙江奧瑞健生物技術(shù)有限公司

    陳世明,Email:1279050771@qq.com

    2017-02-03

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