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    人成體神經(jīng)干細(xì)胞長期培養(yǎng)后遺傳穩(wěn)定性研究

    2017-06-19 16:47:44陳世明章瑾王卓然宣丹英毛鐘鳴陳鵬翾
    中國醫(yī)藥生物技術(shù) 2017年3期
    關(guān)鍵詞:端粒酶端粒干細(xì)胞

    陳世明,章瑾,王卓然,宣丹英,毛鐘鳴,陳鵬翾

    人成體神經(jīng)干細(xì)胞長期培養(yǎng)后遺傳穩(wěn)定性研究

    陳世明,章瑾,王卓然,宣丹英,毛鐘鳴,陳鵬翾

    神經(jīng)干細(xì)胞因具有自我更新、增殖和多向分化潛能[1],神經(jīng)干細(xì)胞移植已成為治療神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和神經(jīng)退行性疾病的新方法[2-5]。但神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)仍存在許多技術(shù)難點(diǎn),培養(yǎng)過程中細(xì)胞易分化或凋亡,難以長期培養(yǎng)[6]。且培養(yǎng)過程中易產(chǎn)生遺傳漂變、微生物污染、細(xì)胞交叉污染等問題[7]。培養(yǎng)傳代時(shí),一般使用化學(xué)性酶,如胰蛋白酶等分離神經(jīng)干細(xì)胞球,酶的多次使用對長期培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞可能產(chǎn)生累積損傷[8-11]。因此,經(jīng)體外長期培養(yǎng)后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化能力,尤其是遺傳信息穩(wěn)定性依然未知。我們以物理方法切割分離神經(jīng)干細(xì)胞球,并改良了神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液,成功實(shí)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞的體外長期培養(yǎng)[12]。但該方法是否存在遺傳不穩(wěn)定性仍需要進(jìn)行研究。本文通過對體外傳代培養(yǎng)不同時(shí)間的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行短串重復(fù)序列(STR)分析和端粒酶活性鑒定,為神經(jīng)干細(xì)胞的體外長期培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)基購自美國 Hyclone 公司;人重組表皮細(xì)胞生長因子(rhEGF)、人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子(rhbFGF)、N2 Supplement 均購自美國 Gibco公司;16 位點(diǎn) STR 試劑盒和 2800 M DNA 標(biāo)準(zhǔn)品購自美國 Promega 公司;TeloTAGGG 端粒酶 PCR-ELISA 試劑盒購自瑞士羅氏公司;巢蛋白購自武漢博士德生物工程有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 取流產(chǎn)胎兒腦組織,在無菌條件下分離出海馬組織,D-Hank’s 液清洗,眼科剪剪成小組織塊,加入 0.25% 的 TP-EDTA 消化 10 min,胰酶抑制劑終止其消化。用 100 目不銹鋼細(xì)胞過濾篩過濾,去除大組織塊,離心收集沉淀細(xì)胞。將沉淀細(xì)胞重懸于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基,制成單細(xì)胞懸液。經(jīng)過細(xì)胞計(jì)數(shù)后以(1 ~ 2)× 106/ml接種到 T75 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于 5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài),3 ~ 4 d半量更換神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基一次。每月用自行研制的干細(xì)胞球切割器切割分離傳代一次。

    1.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞球及分化細(xì)胞觀察 分別取神經(jīng)干細(xì)胞球懸液滴于經(jīng)多聚賴氨酸包被的蓋玻片上,置 37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h,使細(xì)胞黏附于載玻片上,倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并照相記錄。

    1.2.3 神經(jīng)干細(xì)胞的 STR 分析法 按 STR 試劑盒說明書操作,檢測體外培養(yǎng) 2、6、12 和 30 個(gè)月的神經(jīng)干細(xì)胞的短串聯(lián)重復(fù)序列。取 1 × 106個(gè)細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,加入裂解液裂解,再加入平衡酚、氯仿、異戊醇提取 DNA,無水乙醇清洗后棄上清,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行 STR 測序。

    1.2.4 神經(jīng)干細(xì)胞端粒酶活性檢測 按端粒酶試劑盒說明書檢測體外培養(yǎng) 2、6、12、24 個(gè)月的神經(jīng)干細(xì)胞。空白對照為 DEPC 水,陰性對照選擇 RNase 處理的神經(jīng)母細(xì)胞瘤 IMR-32 細(xì)胞,陽性對照選擇神經(jīng)母細(xì)胞瘤 IMR-32 細(xì)胞及試劑盒提供的人腎細(xì)胞 293 凍干粉。取培養(yǎng)后的神經(jīng)干細(xì)胞,胰酶消化,臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)。取約 2 × 105個(gè)細(xì)胞,加入裂解液裂解,孵育、離心后取上清進(jìn)行端粒酶催化特異底物反應(yīng)的 PCR。PCR 產(chǎn)物變性后按試劑盒要求用地高辛標(biāo)記的特異探針雜交,而后用偶聯(lián)過氧化物酶的抗地高辛抗體行 ELISA 反應(yīng),酶標(biāo)儀測定 ELISA 結(jié)果(檢測波長為 450 nm,參考波長為 690 nm)。測定值大于 0.25 為端粒酶陽性。

    2 結(jié)果

    2.1 神經(jīng)干細(xì)胞球及分化細(xì)胞觀察

    傳代培養(yǎng) 30 個(gè)月神經(jīng)干細(xì)胞球形態(tài)見圖 1,神經(jīng)干細(xì)胞的分化細(xì)胞形態(tài)見圖 2。

    圖 1 倒置顯微鏡下觀察人神經(jīng)干細(xì)胞球(× 100)

    2.2 STR 分析

    通過檢測發(fā)現(xiàn),2、6、12 和 30 個(gè)月培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞均有相同的短串連重復(fù)序列(表 1)。

    圖 2 神經(jīng)干細(xì)胞球部分分化[A:經(jīng)誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞球(× 100);B:神經(jīng)干細(xì)胞分化后的神經(jīng)細(xì)胞(× 100);C:神經(jīng)干細(xì)胞分化后的神經(jīng)細(xì)胞(× 200);D:神經(jīng)干細(xì)胞分化后的神經(jīng)細(xì)胞(× 400)]

    表 1 不同培養(yǎng)時(shí)間的神經(jīng)干細(xì)胞短串連重復(fù)序列檢測結(jié)果

    2.3 端粒酶活性測定

    結(jié)果(圖 3)顯示,陽性對照和 IMR-32 細(xì)胞具有較高的端粒酶活性。2、6、12、24 個(gè)月培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞均為陰性。

    3 討論

    圖 3 不同培養(yǎng)時(shí)間的神經(jīng)干細(xì)胞端粒酶活性

    神經(jīng)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中極易分化,并發(fā)生微生物污染、細(xì)胞間交叉污染等問題,長期傳代培養(yǎng)又易導(dǎo)致細(xì)胞遺傳信息的漂移和變異[13],進(jìn)而出現(xiàn)異常分化、基因不穩(wěn)定和癌變等現(xiàn)象,因此,在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)過程中,對其遺傳穩(wěn)定性的檢測尤為重要。實(shí)驗(yàn)中神經(jīng)干細(xì)胞球的形態(tài)在30 個(gè)月內(nèi)無明顯變化。體外培養(yǎng) 30 個(gè)月后神經(jīng)干細(xì)胞球分化后,可見典型神經(jīng)元形態(tài)及星型膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài),可判斷此類細(xì)胞仍具有良好的增殖和分化能力。

    短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)在遺傳病及親子鑒定等方面已廣泛應(yīng)用,但在細(xì)胞培養(yǎng)中,主要檢測基因變異和細(xì)胞交叉污染[14]。通常情況下,每一個(gè) STR 位點(diǎn)會(huì)被 5% ~ 20% 的人們所共有,理論上聯(lián)合應(yīng)用 16 個(gè) STR 位點(diǎn),其個(gè)體識(shí)別率可達(dá) 99.9999999998%。在細(xì)胞培養(yǎng)過程及 STR 過程中的微量 DNA 污染,會(huì)造成錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。STR 檢測過程中,DNA 樣品提取純化的質(zhì)量、緩沖液的微小差異、離子強(qiáng)度、引物濃度等,甚至不同的熱循環(huán)條件,都會(huì)引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。本實(shí)驗(yàn)通過對神經(jīng)干細(xì)胞特殊基因位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析,不但檢測了交叉污染情況,也能說明長期培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的 30 個(gè)月時(shí)間內(nèi),Penta E、D18S51、D21S11、TH01、D3S1358,Penta D、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818,F(xiàn)GA、TPOX、D8S1179、vWA、Amelogenin 位點(diǎn)在不同時(shí)間段均具有相同的基因重復(fù)次數(shù),可準(zhǔn)確判斷細(xì)胞具有穩(wěn)定的遺傳信息,且無任何交叉污染,各組之間并無遺傳突變。

    干細(xì)胞在自我更新、增殖分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面與腫瘤細(xì)胞有著相似的生物學(xué)特征,尤其是在自我更新越頻繁的組織中,干細(xì)胞自我更新越快,腫瘤發(fā)生率越高[15]。因此,在神經(jīng)干細(xì)胞長期培養(yǎng)過程中,對其不同階段的癌變可能性檢測十分必要。而對細(xì)胞端粒酶的活性檢測,不僅能滿足以上要求,還能從側(cè)面反應(yīng)出細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性。端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(TRAP)的誕生及應(yīng)用,大大提高了檢測的敏感度,已成為端粒酶活性檢測最常用的方法。端粒酶活性檢測實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞的培養(yǎng)、使用細(xì)胞量、RNA 提取及 ELISA 反應(yīng)條件,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中培養(yǎng)至 2、6、12、24 個(gè)月,神經(jīng)干細(xì)胞的端粒酶活性均為陰性,而神經(jīng)母細(xì)胞瘤 IMR-32 細(xì)胞具有較高的端粒酶活性。端粒酶能修復(fù)延長端粒,可以讓端粒不會(huì)因細(xì)胞分裂而有所損耗,使得細(xì)胞分裂的次數(shù)增加。當(dāng)端粒酶活性不足以抑制端粒長度的縮短,致使細(xì)胞喪失增殖能力[16]。Ostenfeld 等[17]研究表明,人神經(jīng)干細(xì)胞的端粒較短,并隨著細(xì)胞分裂進(jìn)一步縮短,致使神經(jīng)干細(xì)胞不能在體外長期傳代。而腫瘤細(xì)胞端粒酶活性很高,每次腫瘤細(xì)胞分裂后縮短的端粒被端粒酶延長,致使細(xì)胞長期無限增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng) 12 ~ 24 個(gè)月后,端粒酶活性與之前各組并未顯示顯著差異,自我更新、增殖分化能力亦未見異常,可能與神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)和傳代的特殊方法有關(guān),也可能與端粒酶測試方法的敏感度有關(guān),具體原因有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

    [1] Crane JF, Trainor PA. Neural crest stem and progenitor cells. Annu Rev Cell Dev Biol, 2006, 22:267-286.

    [2] Lee JM, Bae JS, Jin HK. Intracerebellar transplantation of neural stem cells into mice with neurodegeneration improves neuronal networks with functional synaptic transmission. J Vet Med Sci, 2010, 72(8):999-1009.

    [3] Sharma R, McMillan CR, Niles LP. Neural stem cell transplantation and melatonin treatment in a 6-hydroxydopamine model of Parkinson’s disease. J Pineal Res, 2007, 43(3):245-254.

    [4] Bantubungi K, Blum D, Cuvelier L, et al. Stem cell factor and mesenchymal and neural stem cell transplantation in a rat model of Huntington’s disease. Mol Cell Neurosci, 2008, 37(3):454-470.

    [5] Miltiadous P, Kouroupi G, Stamatakis A, et al. Subventricular zone-derived neural stem cell grafts protect against hippocampal degeneration and restore cognitive function in the mouse following intrahippocampal kainic acid administration. Stem Cells Transl Med, 2013, 2(3):185-198.

    [6] Mellodew K, Suhr R, Uwanogho DA, et al. Nestin expression is lost in a neural stem cell line through a mechanism involving the proteasome and Notch signalling. Brain Res Dev Brain Res, 2004, 151(1-2):13-23.

    [7] Mckay R. Stem cells in the central nervous system. Science, 1997, 276(5309):66-71.

    [8] Chen SM. Detection of chromosome mutations//Zhang JT. Modern pharmacology experimental methods (part 2), Beijing: Beijing medical university and Pecking Union Medical College Joint Press, 1998:1864-1899. (in Chinese)陳世明. 染色體突變檢測方法//張均田. 現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法(下冊). 北京: 北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社, 1998: 1864-1899.

    [9] Chen SM, Zhang JT. Establishment of isolation and long-term culture of human embryonic brain neural stem cell (NSC) and discovery of a natural product (NP1) with the effects of promoting NSE cell proliferation//XIVth world congress of pharmacology - the new century of pharmacology. San Francisco, CA: American Society for Pharmacology and Experimetal Therapetutics, 2002:A128.

    [10] Zheng ZH. Isolation, culture and identification of neural stem cells// Stem cell principle, technique and clinical. Zhao CH. Beijing: Chemical Industry Press, 2006:402-421. (in Chinese)鄭志竑. 神經(jīng)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)與鑒定//趙春華. 干細(xì)胞原理、技術(shù)與臨床. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2006:402-421.

    [11] Chen SM. Neural stem cells//Zhang JT, Zhang QZ. Techniques and methods of neural pharmacology. Beijing: People's Medical Publishing House, 2005:156-160. (in Chinese)陳世明. 神經(jīng)干細(xì)胞//張均田, 張慶柱. 神經(jīng)藥理學(xué)研究技術(shù)與方法. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2005:156-160.

    [12] Chen SM, Zhang J, Xuan DY, et al. A new method for the long culture of human neural stem cells. Chin Med Biotechnol, 2017, 12(2):189-192. (in Chinese)陳世明, 章瑾, 宣丹英, 等. 一種長期培養(yǎng)人神經(jīng)干細(xì)胞的新方法.中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(2):189-192.

    [13] American Type Culture Collection Standards Development Organization Workgroup ASN-0002. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nat Rev Cancer, 2010, 10(6):441-448.

    [14] Masters JR, Thomson JA, Daly-Burns B, et al. Short tandem repeat profiling provides an international reference standard for human cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(14):8012-8017.

    [15] Domen J, Weissman IL. Hematopoietic stem cells need two signals to prevent apoptosis; BCL-2 can provide one of these, Kitl/c-Kit signaling the other. J Exp Med, 2000, 192(12):1707-1718.

    [16] Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M, et al. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science, 1998, 279(5349):349-352.

    [17] Ostenfeld T, Caldwell MA, Prowse KR, et al. Human neural precursor cells express low levels of telomerase in vitro and show diminishing cell proliferation with extensive axonal outgrowth following transplantation. Exp Neurol, 2000, 64(1):215-226.

    10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.015

    310018 杭州,浙江奧瑞健生物技術(shù)有限公司

    陳世明,Email:1279050771@qq.com

    2017-02-03

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