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    金黃色葡萄球菌噬菌體效價測定方法的建立

    2017-06-19 16:47:44魏東謝安平陳成王國治
    中國醫(yī)藥生物技術(shù) 2017年3期
    關(guān)鍵詞:噬菌體單層菌液

    魏東,謝安平,陳成,王國治

    金黃色葡萄球菌噬菌體效價測定方法的建立

    魏東,謝安平,陳成,王國治

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起人類及動物化膿性感染的常見致病細(xì)菌,是引起燒傷患者創(chuàng)面感染的主要病原體。對于金黃色葡萄球菌感染的治療藥物,人們一直在努力探索。自從 1928 年 Fleming 發(fā)現(xiàn)青霉素,20 世紀(jì) 40 年代用于治療金黃色葡萄球菌后不久,即出現(xiàn)耐青霉素的金黃色葡萄球菌。20 世紀(jì) 50 年代,Beecham發(fā)現(xiàn)了耐青霉素酶的 β-內(nèi)酰胺類藥物甲氧西林,但僅僅幾年后,耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistan Staphylococcus aureus,MRSA)就相繼在歐洲和美國出現(xiàn)[1]。20 世紀(jì) 80 年代以后,MRSA 感染呈現(xiàn)上升趨勢,甚至引起醫(yī)院的暴發(fā)流行[2-3]。萬古霉素曾被譽為抗感染治療領(lǐng)域的“最后一道防線”,但從 1996 年至今,全球范圍內(nèi)已報道多例對萬古霉素耐藥的病例,引起醫(yī)學(xué)界的高度重視[4-5]。目前,需要一種不同于抗生素的新型金黃色葡萄球菌感染治療方法。

    與傳統(tǒng)治療方法相比,噬菌體治療可避免抗生素的副作用及過敏反應(yīng)[6-7]。隨著 MRSA 等耐藥菌在醫(yī)院和社區(qū)的流行傳播,噬菌體的藥用價值再次受到人們的重視,將噬菌體的臨床研究帶入了一個新的階段[8]。對于金黃色葡萄球菌的噬菌體類治療用生物制品,其效價直接影響著制品的有效性。為此,本研究建立了金黃色葡萄球菌噬菌體效價的測定方法,為噬菌體制劑的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料

    1.1.1 噬菌體及菌種 金黃色葡萄球菌(編號:CMCC(B) 26554)、金黃色葡萄球菌噬菌體(編號:CMCC(B)26554-P1)為中國食品藥品檢定研究院保存。

    1.1.2 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心瓊脂培養(yǎng)基由中國食品藥品檢定研究院培養(yǎng)基室提供;標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌比濁管由中國食品藥品檢定研究院提供;氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl2)、三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、明膠購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司;硫酸鎂(MgSO4·7H2O)購于上海美興化工有限公司。

    1.1.3 實驗儀器 DH6000AB 培養(yǎng)箱購自天津市泰斯特儀器有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 單層瓊脂培養(yǎng)法與雙層瓊脂培養(yǎng)法的比較 單層瓊脂培養(yǎng)法,取 100 μl 金黃色葡萄球菌菌液與 100 μl 適當(dāng)稀釋度的噬菌體混合,室溫吸附,混合液中加入 10 ml 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(含 0.75% 瓊脂),混勻后傾注平皿,每個稀釋度設(shè) 3 個重復(fù),同時以宿主菌作對照。待瓊脂凝固后置37 ℃ 培養(yǎng) 16 ~ 24 h 后計數(shù)空斑,計算噬菌體原液效價,即 1 ml 原液樣品中所含侵染性噬菌體的粒子數(shù)。噬菌體效價(pfu/ml)= 噬菌斑平均數(shù) × 稀釋倍數(shù)。

    雙層瓊脂培養(yǎng)的下層為營養(yǎng)瓊脂(含 1.5% 瓊脂),取100 μl 金黃色葡萄球菌菌液與 100 μl 適當(dāng)稀釋度的噬菌體混合,室溫吸附,混合液中加入 3 ml 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(含0.5% 瓊脂),混勻后將其均勻鋪滿下層營養(yǎng)瓊脂平板表面,培養(yǎng)及計數(shù)同單層瓊脂培養(yǎng)法。

    1.2.2 培養(yǎng)基中氯化鈣濃度對噬菌體效價的影響 采用雙層瓊脂培養(yǎng)法,一種體系的培養(yǎng)基中不含 CaCl2,另一種體系的培養(yǎng)基鋪板之前加入 1 mol/L 的 CaCl2溶液(終濃度為 400 μg/ml),比較兩種體系中氯化鈣對噬菌體效價的影響。

    1.2.3 培養(yǎng)基的選擇 采用雙層瓊脂培養(yǎng)法,一種體系使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,另一種體系使用腦心瓊脂培養(yǎng)基,比較兩種培養(yǎng)基體系對噬菌體效價測定結(jié)果的影響。

    1.2.4 菌液濃度的選擇 采用雙層營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)法,將金黃色葡萄球菌菌液稀釋成 5 × 109、1.5 × 109、5 × 108及1.5 × 108/ml 濃度,分別與適當(dāng)稀釋的噬菌體混合后,測定噬菌體效價。

    1.2.5 吸附時間的選擇 采用雙層營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)法,將金黃色葡萄球菌菌液稀釋成 5 × 108/ml,與適當(dāng)稀釋的噬菌體混合,分別于室溫吸附 0、15 及 30 min 后,測定噬菌體效價。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用 Minitab 16 統(tǒng)計軟件,將噬菌體效價取以 10 為底的對數(shù)后進(jìn)行 t 檢驗,以 P < 0.05 視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 單層瓊脂培養(yǎng)法與雙層瓊脂培養(yǎng)法的比較

    單層瓊脂培養(yǎng)法測定的噬菌體原液效價均值為 5.5 ×107pfu/ml,雙層瓊脂培養(yǎng)法測定的噬菌體原液效價均值為2.6 × 108pfu/ml,雙層瓊脂培養(yǎng)法的測定結(jié)果高于單層瓊脂培養(yǎng)法,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.001),見圖 1。因此,選擇雙層瓊脂培養(yǎng)法進(jìn)行噬菌體效價測定。

    2.2 培養(yǎng)基中氯化鈣濃度對噬菌體效價的影響

    不含 CaCl2培養(yǎng)基所測定的噬菌體效價的對數(shù)均值為(8.42 ± 0.02)與含 CaCl2培養(yǎng)基結(jié)果(8.37 ± 0.12)接近,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P = 0.535)。因此,選擇不含 CaCl2的培養(yǎng)基進(jìn)行噬菌體效價測定。

    2.3 培養(yǎng)基的選擇

    使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基測定的噬菌體效價的對數(shù)均值結(jié)果為(8.42 ± 0.02)與腦心瓊脂培養(yǎng)基結(jié)果(8.37 ± 0.08)基本一致,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P = 0.397)。因此,選擇較為經(jīng)濟的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行噬菌體效價測定。

    2.4 菌液濃度的選擇

    噬菌體分別與 4 種濃度的金黃色葡萄球菌菌液混合所測定的效價結(jié)果基本一致,任何濃度組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05),見圖 2。菌液濃度過高時,所形成的噬菌斑較小,菌液濃度過低時,背景顏色過淺,均不便于觀察計數(shù)。菌液濃度為 5 × 108/ml 時,噬菌斑大小及背景顏色均適于計數(shù)。因此,選擇菌液濃度為 5 × 108/ml。

    圖 1 單層瓊脂培養(yǎng)法與雙層瓊脂培養(yǎng)法效價測定結(jié)果比較(***P < 0.001)

    圖 2 菌液濃度對噬菌體效價的影響

    2.5 吸附時間的選擇

    結(jié)果顯示,吸附 0、15 及 30 min,所測得的效價結(jié)果差異無顯著意義,見表 1。因此,選擇中間時間點,確定吸附時間為 15 min。

    表 1 不同吸附時間對噬菌體效價的影響

    3 討論

    噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的細(xì)菌病毒的總稱,具有抗感染治療的天生潛質(zhì)。噬菌體有溶菌作用和嚴(yán)格的種型特異性,可利用噬菌體作細(xì)菌的鑒定和分型,亦可用于防治某些傳染病[9],特別是在耐藥細(xì)菌感染治療方面具有廣闊前景[10-11]。

    本研究選取一株具有廣譜裂解特性的金黃色葡萄球菌噬菌體,建立噬菌體效價測定的標(biāo)準(zhǔn)化方法。首先,比較了單層瓊脂培養(yǎng)法與雙層瓊脂培養(yǎng)法對噬菌體效價測定結(jié)果的影響。單層瓊脂培養(yǎng)法具有操作簡便的特點[12],但試驗結(jié)果表明,單層瓊脂培養(yǎng)法測定結(jié)果明顯低于雙層瓊脂培養(yǎng)法。因此,選擇雙層瓊脂培養(yǎng)法進(jìn)行金黃色葡萄球菌噬菌體效價測定。氯化鈣有增加細(xì)胞膜通透性的作用,有些噬菌體在制備過程及效價測定時均需要添加氯化鈣,但本研究中氯化鈣對所選取噬菌體株的效價測定無任何影響。本文還分析了可能影響噬菌體效價測定的其他因素,結(jié)果顯示培養(yǎng)基種類、菌液濃度以及吸附時間對噬菌體效價無明顯影響。

    本文建立了金黃色葡萄球菌噬菌體效價的測定方法,為金黃色葡萄球菌噬菌體相關(guān)生物制品的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

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    我會常務(wù)理事謝恬教授獲何梁何利基金科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新獎

    我會常務(wù)理事謝恬教授獲得 2016 年度何梁何利基金科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新獎。這也是我國中醫(yī)學(xué)、中西醫(yī)結(jié)合學(xué)界在此次頒獎大會上唯一的獲獎?wù)摺?/p>

    何梁何利基金由香港愛國金融家何善衡、梁銶琚、何添、利國偉于 1994 年創(chuàng)立,旨在獎勵中國杰出科學(xué)家,促進(jìn)科學(xué)技術(shù)進(jìn)步與創(chuàng)新,下設(shè)科學(xué)與技術(shù)成就獎、科學(xué)與技術(shù)進(jìn)步獎和科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新獎,有“中國的諾貝爾獎”之稱。20 多年來,何梁何利基金共表彰了 1147 位杰出科技工作者,以其公正性和權(quán)威性成為社會力量設(shè)立科技獎的杰出代表,中青年人才和海外歸國人員成為創(chuàng)新主要力量。

    謝恬教授團隊研發(fā)成功具有自主知識產(chǎn)權(quán)的中西醫(yī)結(jié)合抗癌新藥欖香烯脂質(zhì)體以及瀕危珍稀中藥材石斛人工繁育栽培技術(shù),并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化推廣。該團隊設(shè)計建成全球首條脂質(zhì)體靶向制劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)線,首次把第四代藥物制劑的代表脂質(zhì)體運用于中藥并成功產(chǎn)業(yè)化。評委會認(rèn)為,“謝恬教授團隊取得了具有原創(chuàng)性的重大研究成果”,“對醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)及中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合創(chuàng)新發(fā)展具有重要意義?!?/p>

    據(jù)了解,欖香烯脂質(zhì)體正式投產(chǎn)后已使國內(nèi)外 70 多萬癌癥患者受益,目前平均每年國內(nèi)有 3 萬名左右患者使用該藥。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院、中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)北京中醫(yī)院等國內(nèi)多家腫瘤醫(yī)院已通過臨床研究證明,欖香烯脂質(zhì)體的療效不亞于化療,而且沒有化療藥的毒副作用。

    2013 年,欖香烯脂質(zhì)體榮獲中國優(yōu)秀發(fā)明專利獎,謝恬教授團隊還歷經(jīng) 8 年多時間在美國、英國、法國、德國、荷蘭、意大利等歐美國家成功獲得了欖香烯脂質(zhì)體發(fā)明專利。接下來,他們還準(zhǔn)備在這些國家做研究注冊新藥,造福全世界更多癌癥患者。(信息來源:杭州師范大學(xué))

    10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.014

    100050 北京,中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室/衛(wèi)生部生物技術(shù)檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室

    王國治,Email:vaccine2012@126.com

    2017-03-07

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