DMOG對MSCs成骨分化及缺血損傷影響的研究

葛婷婷 余勤 祝莉 周麗萍

浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院 杭州 310053

DMOG對MSCs成骨分化及缺血損傷影響的研究

葛婷婷 余勤 祝莉 周麗萍

浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院 杭州 310053

[目的]研究二甲基乙二?；拾彼幔╠imethyloxalglycine，DMOG）對體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）成骨分化和缺血損傷的影響。[方法]利用全骨髓貼壁法獲得MSCs，誘導其向成骨細胞分化，同時給予20μM、40μM、80μM的DMOG處理，培養(yǎng)3d、7d、14d時分別進行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的定量測定，培養(yǎng)14d時進行硝酸銀染色；建立MSCs缺血損傷模型，同時給予不同濃度DMOG處理，Western blot檢測MSCs中Bcl-2/Bax蛋白的表達，MTT法檢測MSCs增殖能力，臺盼藍染色檢測MSCs細胞活力。[結果]DMOG處理可促進MSCs成骨分化中ALP的表達，且DMOG 20μM處理促進作用最顯著；各組MSCs成骨分化中ALP的表達均呈時間依賴性增加。DMOG 20μM組黑色礦化基質(zhì)分泌明顯多于其余各組。40μM DMOG可以顯著提高缺血損傷MSCs中Bcl-2蛋白的表達、抑制Bax蛋白的表達，可顯著促進缺血損傷MSCs的增殖能力和存活率，DMOG的20μM、80μM處理無顯著促進或抑制作用。[結論]DMOG 20μM可顯著促進MSCs成骨分化能力，DMOG 40μM可有效提高缺血損傷MSCs的增殖能力和存活率。

MSCs；DMOG；成骨分化；缺血損傷；細胞凋亡

股骨頭壞死是由多種原因引起的股骨頭缺血性破壞或骨細胞變性導致整個髖關節(jié)功能喪失的一類臨床常見骨科疾病，致殘性高[1-2]，多數(shù)患者不得不進行人工關節(jié)置換，尋求保存患者自身關節(jié)的有效治療方法實有必要[3]。近年來，隨著人們對間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs）成骨分化作用認識的深入，為股骨頭壞死的治療提供了一種新的選擇。但是，MSCs移植后的生存環(huán)境惡劣，需要借助藥物加強MSCs的成骨分化能力并提高其移植后存活率，因而本課題通過研究二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxalglycine，DMOG）對MSCs成骨分化能力的影響，以及通過建立MSCs缺血損傷模型，明確不同濃度DMOG對MSCs缺血損傷的影響，有望為DMOG聯(lián)合MSCs治療股骨頭壞死疾病提供一定的理論依據(jù)和實驗基礎。

1 材料

1.1 實驗動物 SD大鼠，清潔級，雄性，體質(zhì)量為（60～80）g，浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 主要試劑 DMEM/F-12培養(yǎng)基（Invitrogen公司，批號：12400-024），胎牛血清（FBS，GiBco公司，批號：10099-141），0.25%胰蛋白酶-1mmoL EDTA（Invitrogen公司，批號：25300054），青-鏈霉素（Invitrogen公司，批號：10378016），Triton X-100裂解液（Biosharp公司，批號：BS363A），多聚甲醛（天津市化學試劑研究所，批號：980227），硝酸銀、硫代硫酸鈉（Sigma公司，批號：S8157、72049），臺盼藍染料、MTT（Amresco公司，批號：K940、0793），二甲基亞砜(北京鼎國生物技術有限公司，批號：DH105-9)、DMOG（Cayman公司，批號：71210），成骨分化培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物技術有限公司，批號：RASMX-90021），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測試劑盒（聯(lián)科生物技術有限公司，批號：AP0013），兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體（聯(lián)科生物技術有限公司，批號：ab36715），兔抗大鼠Bax單克隆抗體（聯(lián)科生物技術有限公司，批號：ab689），兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（聯(lián)科生物技術有限公司，批號：ab008），HRP標記的山羊抗兔二抗（聯(lián)科生物技術有限公司，批號：GAR0072）。

1.3 主要儀器設備 倒置相差顯微鏡（TE2000-S，Nikon公司），電熱鼓風干燥箱（VBLC310，美國Heraeus公司制造），純水儀（PN PAL-CAXXXLSM2，美國PALL公司），超凈工作臺（SW-CF-2FD，蘇州凈化設備有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（3111，美國FORMA公司），電子天平（ARA-520，Adventurer），離心機（LDZ5-2型，北京醫(yī)用離心機廠），高壓滅菌鍋（YXQ-LS-50A，上海云泰儀器代表有限公司），冰箱（BCD-216E/B，Haier），酶標儀（SpectraMax 190，美國MD公司），臺式高速冷凍離心機（3K-15，德國Sigma公司），超聲波細胞粉碎機（JY92-IIDN，寧波新芝生物科技股份有限公司），脫色搖床（TS-1型，海門其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 MSCs的體外分離培養(yǎng) 將SD大鼠脫頸處死，用75%的乙醇浸泡消毒2min；無菌條件下解剖大鼠，取出股骨、脛骨，剔除骨上附著的軟組織，用5mL PBS液將骨髓沖出，1000r/min離心5min；加入含10% FBS、1%青-鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)液，輕輕吹打制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24h后換液，棄去未貼壁的細胞；隨后每2~3d換1次液，待細胞融合至80%~90%，結束原代培養(yǎng)。取出細胞融合接近80%~90%的培養(yǎng)瓶，棄去舊培養(yǎng)液，PBS清洗，用2mL 0.25%胰蛋白酶-1mmoL EDTA消化3~5min，待細胞形態(tài)開始皺縮變圓，間隙變寬時加等量的含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細胞于離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，加入含10%FBS、1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基5mL輕輕吹打細胞，制成細胞懸液，將細胞以1×105個/mL接種于培養(yǎng)瓶中進行傳代培養(yǎng)。

2.2 MSCs成骨誘導分化、分組及DMOG干預 將P3代MSCs以1×104個/mL接種于6孔板中，每孔接種2mL細胞懸液，24h后將MSCs的培養(yǎng)基更換為含不同濃度DMOG的成骨誘導分化培養(yǎng)基，根據(jù)不同濃度的DMOG實驗分為4組：正常組、DMOG 20μM組、DMOG 40μM組、DMOG 80μM組，各組每3d更換1次培養(yǎng)基，誘導分化14d。

2.3 ALP定量測定 分別在成骨誘導分化分組換液培養(yǎng)3d、7d、14d后，收集細胞并以0.05%的Triton X-100裂解液進行裂解。按照ALP活性檢測試劑盒說明書測定，取50μL的裂解物于96孔板中，再加50μL顯色底物混勻，37℃避光孵育 5min，加入100μL終止液終止反應，在405nm處檢測各組樣品的吸光度，每組設3個復孔，通過標準曲線進行計算各組細胞ALP活力。

2.4 硝酸銀染色 在成骨誘導分化分組換液培養(yǎng)14d后，吸干成骨誘導分化各組6孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，用4%的多聚甲醛固定15min，雙蒸水洗2次，自然晾干后，每孔加入2mL新配制的2%硝酸銀溶液染色5min，用去離子水充分洗滌后，放置于紫外線下照射15～30min，雙蒸水漂洗2次，再用5%硫代硫酸鈉處理2min，雙蒸水洗2次，倒置相差顯微鏡下觀察。

2.5MSCs缺血損傷模型建立、分組及DMOG干預 取P3代MSCs細胞懸液5mL（1×105個/mL）接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)。培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后，用PBS洗滌3次，更換培養(yǎng)基為無血清且含不同濃度DMOG的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，建立MSCs缺血損傷模型。實驗共分為3組：正常組（用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)）、缺血清組（用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)）、不同濃度DMOG干預組（在無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中加入DMOG使其終濃度分別為20μM、40μM、80μM培養(yǎng)）。

2.6 Western blot檢測MSCs中Bcl-2/Bax蛋白的表達 缺血清培養(yǎng)MSCs 24h后，提取各組細胞蛋白。BCA法測定蛋白濃度，變性后上樣，以10%分離膠、5%濃縮膠的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，常規(guī)方法轉膜，5%脫脂奶粉封閉1h，分別加兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體(1∶1000稀釋)，兔抗大鼠Bax單克隆抗體（按1∶1000稀釋）或兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（1∶5000稀釋），4℃孵育過夜，HRP標記的山羊抗兔二抗室溫孵育1.5h，曝光顯影。

2.7 MTT法檢測MSCs增殖能力 將MSCs(1×104個/mL）接種96孔板內(nèi)，待細胞貼壁后，按照“2.5 MSCs缺血損傷模型建立、分組及DMOG干預”方法分為正常組、缺血清組、不同濃度DMOG干預組。分別在培養(yǎng)1d、3d、5d、7d時，棄上清，每孔加入20μL濃度5mg·mL-1的MTT，37℃孵育4h，小心吸棄孔內(nèi)上清，每孔加入150μL DMSO溶液，待充分溶解后，在酶標儀上測量490nm處OD值，每組設5個復孔，按下列公式計算其平均OD值。

OD490-均=（OD490-1+OD490-2+OD490-3+OD490-4+OD490-5）/5（公式1-1）

2.8 臺盼藍染色檢測MSCs活力 正常組、缺血清組、不同濃度DMOG干預組各組細胞培養(yǎng)3d時分別制備單個細胞懸液，調(diào)整至細胞濃度為1×105個/mL。取1滴0.4%臺盼藍溶液和9滴細胞懸液混勻，在3min內(nèi)用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細胞和死細胞，鏡下活細胞拒染，死細胞被染成淡藍色。按下列公式計算細胞活力：

細胞活力（%）=[（總細胞數(shù)-死細胞數(shù)）/細胞總數(shù)]× 100%（公式1-2）

2.9 統(tǒng)計學方法 利用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 不同濃度DMOG處理后MSCs中ALP定量測定結果(±s，U·L-1)Tab.1 The quantitative results of ALP in different DMOG concentration groups(±s,U·L-1)

表1 不同濃度DMOG處理后MSCs中ALP定量測定結果(±s，U·L-1)Tab.1 The quantitative results of ALP in different DMOG concentration groups(±s,U·L-1)

注：同一時間點，與正常組比較，*P<0.05；與DMOG 20μM組比較，△P<0.05；與DMOG 40μM組比較，□P<0.05。同一組內(nèi)，與3d比較，■P<0.05；與7d比較，☆P<0.05。Note:At the same time,compared with control group,*P<0.05;Compared with DMOG 20μM group,△P<0.05;Compared with DMOG 40μM group,□P< 0.05.In the same group,compared wtih 3d,■P<0.05;Compared wtih 7d,☆P<0.05.

組別正常組DMOG 20μM組DMOG 40μM組DMOG 80μM組誘導分化時間3d 7d 14d 31.46±0.48 35.86±0.45*32.68±0.58*△32.96±0.36*△86.89±2.76■142.55±0.16*■99.12±0.98*△■97.80±22.28*△■122.62±1.75■☆175.98±1.29*■☆166.65±1.42*△■☆140.43±2.14*△□■☆

3 結果

3.1 MSCs形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)3d時，可見放射狀排列的細胞集落，伸出長短不一、粗細不均的突起，并開始大量增殖（圖1A）；原代培養(yǎng)8d時，單個細胞為長梭形，細胞呈漩渦狀生長，且細胞密度增大，融合度達到80%~90%（圖1B）。傳代后的MSCs生長迅速（圖1C、圖1D），細胞形態(tài)主要表現(xiàn)為梭形、紡錘形，少數(shù)為多角形，趨向于均一化，且懸浮的雜細胞逐漸減少，說明通過不斷的傳代和換液MSCs純度提高。

3.2 不同濃度DMOG處理后MSCs中ALP定量測定結果 實驗結果（表1）。誘導分化3d時，與正常組比較，DMOG 20μM組、DMOG 40μM組和DMOG 80μM組ALP活力均顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；與DMOG 20μM組比較，DMOG 40μM組、DMOG 80μM組ALP活力顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與DMOG 40μM組比較，DMOG 80μM組ALP活力差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。誘導分化7d時，與正常組比較，DMOG 20μM組、DMOG 40μM組和DMOG 80μM組ALP活力差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）；DMOG的20μM、40μM組、80μM三組之間兩兩比較，DMOG 20μM組ALP活力最高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。誘導分化14d時，與正常組比較，DMOG 20μM組、DMOG 40μM組和DMOG 80μM組ALP活力顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；DMOG 20μM、40μM、80μM三組之間兩兩比較，DMOG 20μM組ALP活力最高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在同一組內(nèi)，ALP活力增加呈時間依賴性，誘導分化14d時各組ALP活力均最高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果顯示：DMOG處理可促進MSCs成骨分化中ALP的表達，且DMOG 20μM處理促進作用最顯著，各組MSCs成骨分化中ALP的表達均呈時間依賴性增加。

圖1 大鼠骨髓MSCs形態(tài)圖（40×）Fig.1 Morphology of rat bone marrow MSCs（40×）

3.3 不同濃度DMOG處理后MSCs成骨分化的硝酸銀染色結果 各組細胞成骨誘導分化14d后，硝酸銀染色可見細胞間散有黑色顆粒，顆粒大小不一，表明有礦化基質(zhì)沉淀。圖2A、2B、2C、2D分別是MSCs成骨分化正常組、DMOG 20μM組、DMOG 40μM組、DMOG 80μM組的染色情況，結果顯示：DMOG 20μM組黑色礦化基質(zhì)分泌明顯多于其余各組。

3.4 不同濃度DMOG處理缺血損傷MSCs中Bcl-2/ Bax蛋白的表達 提取各組細胞蛋白，進行Western blot實驗，可見大小26kDa的Bcl-2蛋白，20kDa的Bax蛋白及42kDa的β-actin蛋白（圖3C）。對顯影結果進行統(tǒng)計分析，與正常組比較，缺血清組、20μM DMOG組、80μM DMOG組Bcl-2蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），40μM DMOG組無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；與缺血清組比較，20μM DMOG組、40μM DMOG組、80μM DMOG組Bcl-2蛋白表達均顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中，40μM DMOG組Bcl-2蛋白表達水平最高（圖3A）。與正常組比較，各組Bax蛋白表達均顯著提高（P<0.01）；與缺血清組比較，20μM DMOG組、40μM DMOG組Bax蛋白表達均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01），80μM DMOG組表達水平顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中，40μM DMOG組Bax蛋白表達水平最低（圖3B）。結果顯示：40μM DMOG可以顯著提高缺血損傷MSCs中Bcl-2蛋白的表達，抑制缺血損傷MSCs中Bax蛋白的表達。

圖2 各組MSCs成骨分化硝酸銀染色結果圖（200x）Fig.2 Von Kossa stain results of MSCs osteogenetic differentiation in each group（200x）

表2 不同濃度DMOG處理對缺血損傷MSCs增殖能力的影響（OD490，n=5，±s)Tab.2 The effects of multiplication capacity of ischemic injury MSCs with different concentration DMOG treated (OD490，n=5，±s)

表2 不同濃度DMOG處理對缺血損傷MSCs增殖能力的影響（OD490，n=5，±s)Tab.2 The effects of multiplication capacity of ischemic injury MSCs with different concentration DMOG treated (OD490，n=5，±s)

注：同一時間內(nèi)，與正常組比較，*P<0.05；與缺血清組比較，#P<0.05；與20μM DMOG組比較，△P<0.05；與40μM DMOG組比較，□P<0.05。Note:At the same time,compared with control group,*P<0.05;Compared with ischemic injury group,#P<0.05;Compared with 20μM DMOG group,△P<0.05;Compared with 40μM DMOG group,□P<0.05.

時間1d 3d 5d 7d組別正常組 缺血清組 20μM DMOG組 40μM DMOG組 80μM DMOG組0.322±0.008 0.729±0.003 0.839±0.010 0.988±0.010 0.177±0.009*0.206±0.012*0.227±0.014*0.238±0.012*0.177±0.012*0.206±0.018*0.229±0.016*0.236±0.009*0.196±0.009*#△0.221±0.006*#△0.247±0.005*#△0.268±0.005*#△0.176±0.006*□0.208±0.018*□0.232±0.021*□0.242±0.009*□

3.5 不同濃度DMOG處理對缺血損傷MSCs增殖能力的影響 實驗結果（表2）。缺血損傷1d、3d、5d、7d時，與正常組比較，缺血清組、20μM DMOG組、40μM DMOG組、80μM DMOG組的OD值均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與缺血清組比較，20μM DMOG組、80μM DMOG組的OD值均無統(tǒng)計學差異（P>0.05），40μM DMOG組的OD值顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與20μM DMOG組比較，40μM DMOG組的OD值顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05），80μM DMOG組的OD值無統(tǒng)計學差異（P> 0.05）；與40μM DMOG組比較，80μM DMOG組的OD值降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果顯示：DMOG 40μM處理可顯著促進缺血損傷MSCs的增殖能力，DMOG的20μM、80μM處理無顯著促進或抑制作用。

圖3 不同濃度DMOG處理缺血損傷MSCs中Bcl-2/Bax蛋白表達水平Fig.3 The expression level of Bcl-2/Bax protein from ischemia injury MSCs in different DMOG concentrations

表3 不同濃度DMOG處理組MSCs的臺盼藍染色結果（±s,%）Tab.3 Trypan blue stain results of MSCs in different DMOG treated groups(±s,%)

表3 不同濃度DMOG處理組MSCs的臺盼藍染色結果（±s,%）Tab.3 Trypan blue stain results of MSCs in different DMOG treated groups(±s,%)

組別正常組缺血清組20μM DMOG組40μM DMOG組80μM DMOG組活細胞比例95.65±0.012 82.74±0.032*83.50±0.106*89.45±0.066*#△83.87±0.086*□

3.6 不同濃度DMOG處理對缺血損傷MSCs活力的影響 各組MSCs培養(yǎng)3d時，進行臺盼藍染色，測定細胞活力，即測定活細胞占細胞總數(shù)的比例，結果（表3）。與正常組比較，缺血清組、20μM DMOG組、40μM DMOG組和80μM DMOG組活細胞比例顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與缺血清組比較，20μM DMOG組和80μM DMOG組活細胞比例無統(tǒng)計學差異（P>0.05），40μM DMOG組活細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與20μM DMOG組比較，40μM DMOG組活細胞比例明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），80μM DMOG組活細胞比例差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與40μM DMOG組比較，80μM DMOG組活細胞比例明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果顯示：DMOG 40μM處理可顯著提高缺血損傷MSCs的存活率，DMOG的20μM、80μM處理無顯著促進或抑制作用。

4 討論

MSCs來自于中胚層，是一類未分化的多能成體干細胞，擁有多向分化的潛力[4]。在體內(nèi)或體外適宜的條件下具有分化為成骨細胞[5]、心肌細胞[6]、神經(jīng)細胞[7]、脂肪細胞[8]等多種細胞的能力。MSCs來源廣泛，易于提取分離、體外培養(yǎng)、擴增和純化，不存在倫理問題的爭議，所以現(xiàn)已成為組織工程、細胞和基因治療方面研究的熱點，有著可觀的應用前景。本課題選擇全骨髓貼壁篩選法對MSCs進行培養(yǎng)，并定期換液除去雜細胞，達到純化細胞的目的。同時，全骨髓貼壁篩選法幾乎保留所有的骨髓前體細胞，還提供細胞生長所需的細胞因子，促使細胞更好的生長。

DMOG作為一種小分子酮戊二酸類似物，通過與內(nèi)源性的2-酮戊二酸競爭從而抑制脯氨酸羥化酶（proline hydroxylase,PHD），使得細胞在正常氧環(huán)境下也“感覺”低氧，對動物及人類均無毒性，可作為高效安全的缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）穩(wěn)定劑。目前，有研究[9-10]表明DMOG在MSCs成骨分化中有一定的促進作用，可能是其作用形成的低氧環(huán)境促使細胞向成骨細胞分化，研究同時表明HIF-1在MSCs的成骨分化中發(fā)揮重要作用。DMOG作為一種缺氧模擬劑，可以有效降低HIF-1α的降解，穩(wěn)定HIF-1的表達，從而促進MSCs成骨分化。本課題給予MSCs不同濃度DMOG處理，根據(jù)ALP的定量測定可知DMOG處理可促進MSCs成骨分化中ALP的表達，且DMOG 20μM處理促進作用最顯著；各組MSCs成骨分化中ALP的表達均呈時間依賴性增加。同時，硝酸銀染色結果也顯示，在DMOG的給藥濃度為20μM時，礦化基質(zhì)沉淀最多，表示DMOG 20μM的給藥濃度能有效促進MSCs的成骨分化。

研究表明，DMOG與HIF-1α關系密切，且對細胞凋亡具有調(diào)控作用[11]。DMOG作為缺氧模擬劑可以抑制HIF-1α亞基降解，提高其活性，高度表達的HIF-1α可進入細胞核與HIF-1β亞基形成有活性的二聚體HIF-1，HIF-1再與下游靶基因作用發(fā)揮相應生物學功效。DMOG能抑制MSCs因缺血損傷引起的凋亡，其機制可能為對凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2/Bax表達的調(diào)控[12-13]。本課題通過Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)40μM DMOG可以顯著提高缺血損傷MSCs中抑凋亡蛋白Bcl-2的表達，抑制缺血損傷MSCs中促凋亡蛋白Bax的表達。通過MTT法檢測各組MSCs增殖能力，以此研究DMOG對MSCs缺血損傷的保護作用，實驗結果表明，40μM濃度組OD值高于缺血清組，但低于正常組，提示40μM DMOG給藥濃度對MSCs在缺血損傷環(huán)境下有一定的保護作用。而20μM DMOG和80μM DMOG組OD值皆低于缺血清組，提示該兩組DMOG給藥濃度不能提高MSCs在缺血損傷環(huán)境下的存活率。同時，臺盼藍染色結果也表明40μM DMOG組的活細胞比例顯著高于20μM和80μM組。

綜上所述，本研究結果提示DMOG 20μM可顯著促進MSCs成骨分化能力，DMOG 40μM可有效提高缺血損傷MSCs的增殖能力和存活率。研究結果中，DMOG促進MSCs成骨分化和提高缺血損傷MSCs的增殖能力、存活率的濃度不一致，可能與MSCs缺血清損傷前后對DMOG敏感程度不同有關，具體機制我們將在后續(xù)實驗中展開更為深入的研究。在低濃度DMOG對各種細胞作用的研究中，Marchbank等[14]發(fā)現(xiàn)10~70μM濃度的DMOG能呈劑量依賴的促進人HT29細胞增殖，6.25~25μM濃度的DMOG能呈劑量依賴的促進人HT29細胞遷移能力，且本研究結果發(fā)現(xiàn)DMOG 20μM處理對MSCs成骨分化有顯著促進作用，這也給予我們啟示：在后續(xù)實驗中開展更低濃度DMOG對MSCs成骨分化能力影響的實驗研究十分必要，可為進一步完善和豐富本研究成果提供一定的理論基礎。

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The Effects of DMOG on MSCs Osteogenic Differentiation and Ischemic Injury

GE Tingting,YU Qin,ZHU Li,et al
College of Life Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

[Objective]Isolating and culturing rat bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)in vitro,we aimed to understand the effects of different concentrations of DMOG on their osteogenic differentiation and ischemic injury.[Methods]Whole bone marrow adherent method was used to obtain the MSCs, MSCs were induced to differentiate into osteoblast while giving 20μM,40μM,80μM concentrations of DMOG,and conducted the quantitative measurement of alkali quantitative phosphatase(ALP)at the time when cultivated 3d,7d and 14d,respectively,and performed Von Kossa staining when cultured 14d; Established MSCs ischemic injury model,while treated with different concentrations of DMOG,protein level of Bcl-2/Bax was detected by Western blot, then MTT method was used to detect the MSCs proliferation ability,and trypan blue staining was used to detect the MSCs viability.[Results]DMOG treatment may promote the ALP expression in osteogenic differentiation of MSCs,and DMOG 20μM treatment had the most significant role in promoting; ALP expression of each group in the osteogenic differentiation of MSCs increased in a time-dependent manner.In DMOG 20μM group,the black mineralizing matrix secretion was significantly more than other groups.40μM DMOG can significantly improve the expression of Bcl-2 protein,inhibit the expression of Bax protein in ischemic injury MSCs,and significantly promote proliferation and survival ability of ischemic injury MSCs,DMOG 20μM,80μM treatment had no significant promotion or inhibition effect.[Conclusion]DMOG 20μM could significantly promote osteogenic differentiation ability of MSCs; DMOG 40μM could effectively improve the proliferation ability and survival rate of ischemic injury MSCs.

mesenchymal stem cells;dimethyloxalglycine;osteogenic differentiation;ischemic injury;apoptosis

R331

：A

：1005-5509（2017）05-0400-08

10.16466/j.issn1005-5509.2017.05.014

2016-12-27）

浙江省新苗人才計劃項目(2015R410048)；浙江省教育廳科研項目（Y20163679）

Fund projects:Xinmiao Talent Project of Zhejiang Province(2015R410048);Foundation of Zhejiang Education Committee (Y20163679)

周麗萍，E-mail：lipingzhou1219@126.com