尖孢鐮刀菌侵染下香蕉幼苗抗病生理響應(yīng)研究

董鮮+馬玉楠+馬曉惠+李維蛟+徐福榮

摘 要 香蕉枯萎病由土傳病菌尖孢鐮刀菌侵染引起，為探究病原菌侵染過程中香蕉植株的抗病生理響應(yīng)，本研究利用溫室培養(yǎng)植株接種病原菌的方法，測定病原菌侵染之后葉綠素含量、抗病防御酶活性、總酚含量、木質(zhì)素含量、可溶性糖含量和氨基酸含量。結(jié)果表明：（1）隨著病原菌的侵染，葉綠素含量顯著降低。在侵染第16天時(shí)，發(fā)病植株葉綠素含量相對于健康植株降低44%；（2）病原菌侵染之后，植株各部位抗病防御酶苯基丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性顯著提高；（3）隨著病情的加劇，酚類物質(zhì)和木質(zhì)素逐漸在植株體內(nèi)累積；（4）病原菌侵染之后，香蕉植株葉片和假莖可溶性糖含量顯著增加，但根系可溶性糖含量顯著降低。當(dāng)植株發(fā)病等級為I級時(shí)，葉片和假莖可溶性糖含量增加至未侵染植株的1.53和1.62倍，根系可溶性糖含量降低至未侵染植株的67%；（5）當(dāng)植株發(fā)病等級為II級時(shí)，葉片和假莖氨基酸含量分別增加至未侵染植株的的3.01、5.38和1.99倍。綜上所述，病原菌侵染之后，香蕉植株會(huì)通過提高抗病防御酶活性，合成抗病物質(zhì)酚類和木質(zhì)素，同時(shí)，也會(huì)主動(dòng)累積可溶性糖和氨基酸，來緩解由于病原菌侵染之后所造成的滲透脅迫。

關(guān)鍵詞 香蕉 ；尖孢鐮刀菌 ；抗病防御酶 ；可溶性糖 ；氨基酸

中圖分類號 S668.1 ；Q945.8 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.05.011

Physiological Resistance Response of Banana Seedlings to

Fusarium oxysporum

DONG Xian MA Yunan MA Xiaohui LI Weijiao XU Furong

（College of Chinese Medical Materials， Yunnan University of Chinese Medical Sciences，

Kunming， Yunnan 650500）

Abstract Banana wilt disease was caused by soil-borne pathogen Fusarium oxysporum. Hydroponic experiments with pathogen inoculation were conducted in the greenhouse to observe the resistance response of banana seedlings to F. oxysporum. The banana seedlings infected with F. oxysporum were determined in terms of chlorophyll， total phenolic， lignin， soluble carbohydrate and amino acid and defense enzyme activity. When infected with the pathogen， the banana seedlings reduced their chlorophyll content significantly， and at the day 16 their chlorophyll content was decreased by 44% compared with the healthy plants.After infected with the pathogen， the banana seedlings increased significantly the activities of the defense enzymes like phenylalanine ammonia lyase （PAL）， peroxidase （POD） and polyphenol oxidase （PPO）. When seriously infected with the pathogen， they increased gradually their contents of total phenolic acid and lignin. After infected with the pathogen， the banana seedlings increased significantly their soluble carbohydrate content in the leaves and pseudostem， but decreased their soluble carbohydrate content in roots. When the disease grade was ranked I， the infected banana seedlings increased the content of soluble carbohydrate in the leaves and pseudostem by 1.53 times and 1.62 times as against the non-infected plants， and reduced their content of soluble carbonhydrate in the root by 67%. At the disease grade II， the infected banana seedlings increased their amino acid content by 3.01 times， 5.38 times and 1.99 times in the leaves， pseudostem and root as against the noninfected plants， respectively. It is concluded that when infected with the pathogen banana plants synthesized the phenols and lignin to increase the activity of disease defense enzyme and at the same time， accumulated actively the soluble carbohydrates and amino acids to ease the osmotic stress caused by the pathogenic infection.

Keywords banana ； Fusarium oxysporum ； defense enzyme ； soluble carbohydrate ； amino acid

香蕉（Musa spp.）為芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa）多年生單子葉草本植物。香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubense（E. F. Smith） Snyder and Hansen）侵染引起的土傳維管束病害[1-2]。病原菌通過根系侵入，并沿著維管束向地上部擴(kuò)展，導(dǎo)致植物細(xì)胞膜破裂、維管束堵塞等，最終使植株枯萎死亡[3-4]。在寄主植物與病原微生物相互作用過程中，病原菌入侵寄主后能產(chǎn)生激素、酶類和毒素等物質(zhì)，這些物質(zhì)有利于病原菌更好地在寄主中生存和繁殖[5]。

香蕉枯萎病作為一種土傳病害，在防治上難度比較大，其發(fā)生及危害程度與土壤物理和化學(xué)性質(zhì)、耕作制度、管排水、施肥種類與措施、苗床管理、化學(xué)藥品種類與用量、香蕉品種等有關(guān)。有研究表明，香蕉枯萎病抗病品種的根系分泌物抑制病原菌孢子的萌發(fā)，并且抑制能力隨植株的衰老而減弱[6]。Ana等[7]用分離的病原菌細(xì)胞壁激發(fā)子處理香蕉根系后能引發(fā)細(xì)胞壁的木質(zhì)化，并伴隨著苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）等植物防御相關(guān)酶活性的增強(qiáng)。Patel[8]研究表明，激發(fā)子處理香蕉植株后，水楊酸（SA）含量相比對照植株顯著增加，上述防御酶活性也顯著提高。Thangavelu等[9]用病原菌處理香蕉后，得到相似的結(jié)論。現(xiàn)國內(nèi)外研究多停留在用病原菌或其產(chǎn)物離體處理植株，單一研究某一方面的生理響應(yīng)，缺乏對植物與微生物相互作用及植株抗病生理響應(yīng)的系統(tǒng)研究。故本研究采用活體接種病原菌，分析接種病原菌的香蕉植株在不同發(fā)病程度下抗病生理響應(yīng)方式，為降低香蕉枯萎病發(fā)生率、發(fā)展香蕉生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉（Musa paradisiaca） 品種：巴西香牙蕉，感病品種，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)海南試驗(yàn)基地提供。香蕉枯萎病病原菌：尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種，來自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物營養(yǎng)與施肥系菌種保存室。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

組培香蕉苗栽培在無菌石英砂中，待組培苗長至2葉1心時(shí)，移栽至2.5 L塑料桶，每個(gè)塑料桶里培養(yǎng)4株，移苗后每4 d換營養(yǎng)液1次，采用Hoagland營養(yǎng)液配方[10]，培養(yǎng)溫度28℃，相對濕度（70±10）%，每天光照時(shí)間14 h。待香蕉幼苗長至5～6葉期時(shí)，隨機(jī)選取幼苗30株在濃度為1×106的尖孢鐮刀菌懸浮液中浸根2 h，另選取幼苗30株在無菌水中浸根相同時(shí)間作為空白對照。試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)處理，即對照和接種病原菌處理。

尖孢鐮刀菌懸浮液的制法：尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種接種在PDA 培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲長滿整個(gè)平板的時(shí)候取出，刮下菌絲用無菌水懸浮，搖床上搖勻，4層紗布過濾制得孢子懸浮液。

1.2.2 指標(biāo)測定

1.2.2.1 病原菌侵染植株病情分級

待香蕉幼苗接種病原菌16 d后，根據(jù)病情嚴(yán)重程度將病害分為以下3個(gè)等級。

NI：未侵染植株，無菌水對照；

I：輕病株，有1～3片下位葉表現(xiàn)失綠病癥；

Ⅱ：重病株，有4～5片下位葉表現(xiàn)失綠病癥。

1.2.2.2 葉綠素含量的測定

葉綠素含量用 SPAD-502 型葉綠素儀對新完全展開葉進(jìn)行測定，每片葉測定6次然后取平均數(shù)，以 SPAD 值表示。

1.2.2.3 苯基丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性測定

苯基丙氨酸解氨（wujuns）酶活性的測定參照Else[11]的方法并有少許改變。準(zhǔn)確稱取1 g葉片組織，在內(nèi)含14 mmol/L的2-巰基乙醇硼酸鉀緩沖液（100 mmol/L，pH 8.8）中磨成勻漿，之后在轉(zhuǎn)速為12 000 g下離心20 min，上清液即為酶提取物。100 μL酶提取物與1 mL的硼酸鉀緩沖液（100 mol/L，pH 8.8）和2 μL的 100 mmol/L L-苯丙氨酸混勻后在37℃水浴中保溫60 min后，加入1 mL 1 mol/L HCl反應(yīng)終止液?？瞻讓φ占礊槊柑崛∥锱c L-苯丙氨酸混合液。在分光光度計(jì)下得到波長在290 nm下的吸光度，其中一個(gè)單位酶活性被定義為每小時(shí)吸光度增加1。

準(zhǔn)確稱取1 g 葉片組織，在5 mL含有0.1 g聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）的磷酸緩沖液中（100 mmol/L，pH 7.0）磨成勻漿，提取物用來測定過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性[12]。

POD的活性測定采用如下方法：1 mL上述酶提取物上清液與3 mL含有20 mmol/L愈創(chuàng)木酚的磷酸緩沖液（20 mmol/L，pH 7.0）混勻，當(dāng) 20 μL H2O2添加之后，立即測定其在波長為 470 nm下吸光度的增加值，其中一個(gè)單位酶活性被定義為每分鐘吸光度增加1。

PPO 的活性測定采用如下方法[13]：1 mL上述酶提取物上清液與1 mL磷酸緩沖液（100 mmol/L，pH 7.0）和1 mL鄰苯二酚（50 mmol/L）混勻，之后測定其在410 nm下的吸光度增加值。一個(gè)單位酶活性被定義為每分鐘吸光度增加1。

可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)試劑測定，方法參照李合生[14]中描述，酶活性表示為U mg-1 protein。

1.2.2.4 總酚含量測定

植株總可溶性酚類含量測定采用福林酚法進(jìn)行測定[2]。取0.5 g新鮮植株組織樣品在液氮中充分磨碎，加入5 mL甲醇浸提1 h，12 000 g下離心10 min，取0.2 mL上清液，與福林酚試劑反應(yīng)，在765 nm下測定吸光度。

1.2.2.5 木質(zhì)素含量測定

木質(zhì)素含量采用乙酰溴方法測定[2]。0.2 g 葉片干樣用 95%乙醇提取3次，再用乙醇與正己烷（1∶2，V/V）溶液清洗3次，沉淀干燥后即為細(xì)胞壁。干燥的細(xì)胞壁（20 mg）置于含有5 mL 25%（V/V）乙酰溴醋酸溶液的試管中，封口，在70℃水浴中放置 30 min。待冷卻至室溫后，試管中的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一只含有0.9 mL 2 mol/L NaOH 和 0.1 mL 7.5 mol/L氯化羥胺中，用醋酸定容，上清液用于測定其在280 nm下的吸光度，不加樣品的作為空白調(diào)零。木質(zhì)素含量按照如下公式[15]：木質(zhì)素（%）=吸光度×100 ÷吸光系數(shù)×樣品濃度（g/L），其中特異性吸光系數(shù)為20 g-1 l cm-1[16]。

1.2.2.6 可溶性糖含量測定

植株可溶性糖含量采用蒽酮法進(jìn)行測定[14]。取烘干植物組織0.05 g，加入5 mL蒸餾水后沸水浴30 min（提取2次），冷卻后過濾并定容至25 mL。將上清液酌情稀釋后，取2 mL稀釋液，加入0.5 mL的蒽酮乙酸乙酯試劑和5 mL濃硫酸，充分混勻后立即沸水浴1 min，冷卻至室溫后于630 nm處比色，測定其吸光值。

1.2.2.7 氨基酸含量測定

植株氨基酸含量測定采用茚三酮法進(jìn)行測定[14]。取新鮮植株組織0.5 g放入研缽中，加入5 mL pH 5.4，0.2 mol/L醋酸鹽緩沖液充分磨碎，2 500 g下離心15 min，取0.2 mL上清液稀釋至2 mL，在580 nm下測定吸光度。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel和SAS 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理、統(tǒng)計(jì)分析和顯著性水平檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均為5個(gè)重復(fù)，“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”格式。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌侵染對植株葉綠素含量的影響

隨著病原菌侵染植株的進(jìn)行，植株葉綠素含量逐漸降低。在病原菌侵染10 d后，葉綠素含量相對于未侵染植株顯著降低。在病原菌侵染植株第12天時(shí)，發(fā)病植株葉綠素含量降低了22%；第14天時(shí)，葉綠素含量降低了25%；第16天時(shí)，發(fā)病植株葉綠素含量相對于健康植株降低了44%（圖1）。

2.2 病原菌侵染對植株抗病防御酶活性的影響

在本研究中，測定了3種抗病相關(guān)酶（PAL，POD，PPO）隨病原菌侵染過程的活性變化。結(jié)果表明，3種酶的活性隨著病情的加劇，活性逐漸升高。在發(fā)病等級為I級時(shí)，酶活性顯著高于未侵染植株，相對于對照植株，PAL、POD和PPO的活性分別增加了6.47、1.82和5.31倍。當(dāng)發(fā)病等級為II級時(shí)，PAL，POD和PPO的活性分別增加了11.29、3.67和13.77倍（圖2）。

2.3 病原菌侵染對植株酚類含量的影響

在本研究中，在發(fā)病等級為Ⅰ級時(shí)，即植株開始表現(xiàn)失綠癥狀時(shí)，酚類物質(zhì)開始積累。葉片、假莖和根系的酚類物質(zhì)含量分別增加至未侵染植株的1.37、1.96和1.52倍。隨著病情的加劇，酚類物質(zhì)繼續(xù)在植株體內(nèi)累積。當(dāng)發(fā)病等級為Ⅱ級時(shí)，葉片、假莖和根系的酚類物質(zhì)含量分別增加至未侵染植株的1.28、3.38和1.77倍（圖3）。

2.4 病原菌侵染對植株木質(zhì)素含量的影響

隨著病原菌入侵植株，葉片、假莖和根系中木質(zhì)素含量都顯著增加。發(fā)病等級為I級植株，葉片，假莖和根系木質(zhì)素含量分別增加至健康植株的1.17、1.64和1.23倍；當(dāng)發(fā)病等級為II級時(shí)，葉片，假莖和根系木質(zhì)素含量分別增加至健康植株的1.20、1.92和1.12倍（圖4）。

2.5 病原菌侵染對植株可溶性糖含量的影響

病原菌侵染之后，香蕉植株葉片和假莖可溶性糖含量顯著增加，但根系可溶性糖含量顯著降低。當(dāng)植株發(fā)病等級為I級時(shí)，葉片和假莖可溶性糖含量增加至未侵染植株的1.53和1.62倍，根系可溶性糖含量降低至未侵染植株的67%（圖5）。

2.6 病原菌侵染對植株氨基酸含量的影響

病原菌侵染之后，香蕉植株各個(gè)部位氨基酸含量顯著增加，當(dāng)植株發(fā)病等級為I級時(shí)，葉片、假莖和根系氨基酸含量分別增加至未侵染植株的1.42、1.95和2.09倍。當(dāng)植株發(fā)病等級為II級時(shí)，葉片和假莖氨基酸含量分別增加至未侵染植株的的3.01、5.38和1.99倍（圖6）。

3 討論與結(jié)論

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是引起植物枯萎病的重要病原菌，為了定殖于寄主植物，病原真菌必須調(diào)節(jié)其形態(tài)、生理和代謝以適應(yīng)寄主植物的各種不利于其生長繁殖的環(huán)境[17]。尖孢鐮刀菌的侵染過程主要分為以下幾個(gè)過程：侵染初期寄主與病原菌的信號識別、寄主根表面的定殖、對寄主植物物理和化學(xué)防御屏障的抵抗，直至成功進(jìn)入寄主體內(nèi)進(jìn)行繁殖[18]。當(dāng)尖孢鐮刀菌到達(dá)木質(zhì)部導(dǎo)管時(shí)，能夠靠菌絲的繁殖進(jìn)行大量擴(kuò)增，并產(chǎn)生大量小型分生孢子，隨著木質(zhì)部蒸騰流迅速向植株地上部蔓延[19-20]。

植物發(fā)病是寄主植物與病原物相互識別、相互作用的結(jié)果。在植物與病原微生物的相互作用中，植物以多種抗病機(jī)制抵御病原的侵染。植物與病原相互識別，交換信息，同時(shí)植物體內(nèi)也發(fā)生了一系列的信號傳遞，各信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間相互交叉形成網(wǎng)絡(luò)[5]。本研究結(jié)果表明，病原菌侵染植株使葉綠素含量顯著降低，并且隨著侵染時(shí)間的延長，葉綠素含量降低幅度越大（圖1）。病原菌的侵染會(huì)導(dǎo)致葉綠素的降解及葉綠素含量的降低，使植株失綠發(fā)黃。曹學(xué)仁等[21]的研究表明，小麥感染白粉病后葉綠素含量顯著降低。此外，Gamliel等[22]的研究也表明，馬鈴薯感染黃萎病后，葉綠素含量下降，葉綠素含量與病情指數(shù)存在顯著負(fù)相關(guān)，發(fā)病程度越嚴(yán)重，葉綠素含量越低。

當(dāng)植株被病原菌侵染之后，抗病或感病取決于植株是否能阻止病原菌的生長和繁殖。在此過程中，很多不同的反應(yīng)例如通過細(xì)胞壁木質(zhì)素的沉積和酚類物質(zhì)的合成來增加細(xì)胞壁的強(qiáng)度、抗性相關(guān)酶例如苯基丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性提高等[23]涉及到植株的抗性過程。在病原菌侵染過程中，酚類物質(zhì)的沉積是重要的防御機(jī)制，因?yàn)槠湓诔舴磻?yīng)和細(xì)胞壁增強(qiáng)中起重要作用[24]。木質(zhì)素是分布較為廣泛的一種多聚體，能夠增強(qiáng)抵抗病原菌酶降解的能力，在維管束植物防衛(wèi)反應(yīng)中有重要作用[25]。苯基丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）在被侵染植株中顯著增加。這3種酶的增加通常伴隨著受傷害、傷口修復(fù)或者抗性反應(yīng)等。同樣，在本研究中，總酚類物質(zhì)隨著病原菌侵染有顯著累積，這個(gè)結(jié)果與Kar和Mishra[26]研究結(jié)果一致。酚類是木質(zhì)素和植保素合成的前體[27]，通常，PAL活性的提高、酚類物質(zhì)的積累以及酚類物質(zhì)被PPO或者POD氧化導(dǎo)致褐變反應(yīng)[12]。PPO以及酚類物質(zhì)底物通常位于液泡中，因此當(dāng)細(xì)胞受傷害這些物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生褐變。POD在過氧化氫存在時(shí)可以氧化酚類物質(zhì)變成奎寧類物質(zhì)[28]。 因此，這3種酶活性的提高與細(xì)胞受傷害、傷口修復(fù)和病害抗性顯著相關(guān)[29]。

對于維管束枯萎病害的水分關(guān)系國外已有研究報(bào)道[30]，其萎蔫癥狀被認(rèn)為是由于水分脅迫或毒素引起的，尖孢鐮刀菌的侵染會(huì)擾亂植株體內(nèi)的水分平衡，最終導(dǎo)致植株的萎蔫[31]。在病原菌侵染過程中，碳水化合物可作為病原菌的養(yǎng)分來源。Vidhyasekara等[32]的研究指出，病原菌侵染后，寄主植物體內(nèi)糖代謝會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致體內(nèi)大量積累糖類物質(zhì)。在本研究中，病原菌侵染后銨態(tài)氮植株葉片可溶性糖含量顯著升高，而根系可溶性糖含量顯著降低。一方面，這可能是由于病原菌侵染后阻礙了葉片中糖向莖和根的運(yùn)輸；另一方面，也可能是由于病原菌侵染使得根系細(xì)胞膜系統(tǒng)受損，導(dǎo)致可溶性糖滲漏。

氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物，植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式進(jìn)行運(yùn)輸。大多數(shù)氨基酸在低濃度范圍內(nèi)可作為一種碳源，被微生物所吸收利用，因此對病原微生物的生長是有益的，但其被吸收利用的過程目前還不是十分清楚[33]。在本研究中，病原菌侵染后，植株各個(gè)部位氨基酸總量都顯著提高。病原菌為了定殖于寄主植物，它需要適應(yīng)寄主環(huán)境，并且調(diào)節(jié)自己的形態(tài)，生理代謝以及分泌的次生代謝產(chǎn)物和蛋白等。所以，病原菌為了侵染植株并在其體內(nèi)生長，它會(huì)使得植株合成更多的有利于其定殖的氨基酸種類并運(yùn)輸?shù)礁倒┢湮绽?。同時(shí)，可溶性糖和氨基酸又是植物在水分脅迫環(huán)境下的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，病原菌侵染之后，由于根系活力降低，維管束堵塞，細(xì)胞膜系統(tǒng)破壞等原因，會(huì)造成植株體內(nèi)水分缺失，故植物合成大量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以緩解體內(nèi)水分脅迫環(huán)境。

綜上所述，尖孢鐮刀菌侵染植株，隨著病情的加劇，會(huì)降低植株葉綠素含量，使得植株發(fā)黃萎蔫。植株通過抗病反應(yīng)提高抗病防御酶（PAL，POD和PPO）的活性，合成酚類和木質(zhì)素以抵御病原菌和次生代謝產(chǎn)物對植株的損害。病原菌的侵染使植株體內(nèi)水分平衡被打破，植株通過在體內(nèi)累積可溶性糖和氨基酸以緩解體內(nèi)的水分脅迫環(huán)境。所以，植株會(huì)通過合成抗病物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以抵御病原菌入侵對植株造成的傷害，但其涉及的分子和生理機(jī)制有待進(jìn)一步的分析研究。

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