鐵皮石斛多倍體誘導(dǎo)研究

馬仲強(qiáng) 劉太林 施梅 付璐璐 張雨琦

摘要[目的]研究鐵皮石斛的多倍體誘導(dǎo)。[方法]以鐵皮石斛蒴果為材料，誘導(dǎo)萌發(fā)出鐵皮石斛圓球莖，研究不同濃度的NAA、6-BA對(duì)鐵皮石斛圓球莖增殖的影響；以秋水仙素作為誘導(dǎo)劑，研究不同濃度秋水仙素、處理時(shí)間對(duì)多倍體鐵皮石斛誘導(dǎo)的影響。[結(jié)果]NAA濃度為1.5 mg/L、6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，鐵皮石斛圓球莖增殖效果最好；秋水仙素濃度越低、處理時(shí)間越短時(shí)，成活率越高、誘導(dǎo)率相對(duì)較低；隨著秋水仙素濃度增大，處理時(shí)間延長，誘導(dǎo)率升高，但死亡率增大。[結(jié)論]秋水仙素濃度在0.15%、處理時(shí)間為48 h時(shí)，成活率達(dá)40%，誘導(dǎo)率為30%，效果最好。

關(guān)鍵詞鐵皮石斛；秋水仙素；多倍體；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)S567.23文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）21-0135-03

Study on Polyploid Induction of Dendrobium officinale

MA Zhongqiang，LIU Tailin*，SHI Mei et al

（Tianjin Tianshi College， Tianjin 301700 ）

Abstract[Objective] The research aimed to study the polyploid induction of Dendrobium officinale.[Method]Dendrobium officinale capsule were used as materials to induce round bulb，the effects of different concentrations of NAA and 6BA on the proliferation of round bulbs of Dendrobium officinale were studied.The effects of different concentrations of colchicines and treatment time on the induction of polyploid Dendrobium officinale were studied by using colchicine as an inducer.[Result]When the concentration of NAA was 1.5 mg/L， the concentration of 6BA was 2.0 mg/L， the effect of the proliferation of round bulbs of Dendrobium officinale was the best.The colchicine concentration was lower， treatment time was shorter， the survival rate was higher， the induction rate was relatively low；with the increase of colchicine concentration and treatment time prolonged， the induction rate increased， but increased mortality.[Conclusion] When the concentration of colchicine was 015% and the treatment time was 48 h， the survival rate was up to 40%， and the induction rate was the best， which was 30%.

Key wordsDendrobium officinale；Colchicine；Polyploid；Tissue culture

鐵皮石斛 （Dendrobium officinale）是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是國家重點(diǎn)保護(hù)藥用植物[1]，多附生于海拔500～1 600 m林中石上或樹上，喜溫暖濕潤氣候，好半陰半陽環(huán)境，不耐寒，但有報(bào)道其在-5 ℃的低溫下仍能存活[2]。鐵皮石斛含有石斛堿、石斛多糖、蛋白質(zhì)、17種氨基酸和7種無機(jī)元素[2-3]，具有益胃生津、潤肺止咳、滋陰清熱、養(yǎng)陰生津、潤喉護(hù)嗓、溫胃明目、補(bǔ)腎益力、延年益壽等功效，可增強(qiáng)免疫力、提高抵抗力、消除腫瘤、抑制癌癥，對(duì)白內(nèi)障、關(guān)節(jié)炎、胃腸道疾病、慢性咽炎及血栓閉塞性脈管炎等疾病有很好的治療效果[1-4]。石斛屬植物主要集中生長在亞洲熱帶、亞熱帶和大洋洲等地區(qū)，我國藥用石斛主要分布于安徽、江西、浙江、福建、四川、廣西和云南等地，其中以云南的產(chǎn)量最大。

鐵皮石斛對(duì)自然的生長條件要求十分苛刻，自然產(chǎn)量極為稀少，而傳統(tǒng)的扦插和分株等人工繁殖方式速度慢、效率低，隨著其藥用價(jià)值逐漸被消費(fèi)者熟知和認(rèn)可，市場日益擴(kuò)大，過量采集加上生態(tài)環(huán)境的破壞導(dǎo)致了野生資源瀕臨枯竭[5]。為了滿足日益增大的市場量需求，用多倍體誘導(dǎo)的方法來增大鐵皮石斛的產(chǎn)量[6-8]，提高活性成分的含量，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。筆者以鐵皮石斛蒴果為材料，誘導(dǎo)萌發(fā)出鐵皮石斛圓球莖，探討不同濃度的NAA、6-BA對(duì)鐵皮石斛圓球莖增殖的影響；以秋水仙素作為誘導(dǎo)劑，研究不同濃度秋水仙素、處理時(shí)間對(duì)多倍體鐵皮石斛誘導(dǎo)的影響。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與試劑

未萌發(fā)的鐵皮石斛蒴果購于樂清海上名山鐵皮石斛基地，部分鐵皮石斛組培苗由生物與食品工程學(xué)院提供；MS培養(yǎng)基及相關(guān)激素NAA、6-BA購于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；秋水仙素購于東洋紡生物科技有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1無菌體系的建立。

打開超凈工作臺(tái)，紫外滅菌30 min，用酒精棉球?qū)⒊瑑艄ぷ髋_(tái)擦拭干凈，然后開始進(jìn)行無菌體系的建立。

即用流水將鐵皮石斛蒴果表面沖洗干凈，沖洗3～5 min；

將沖洗干凈的鐵皮石斛蒴果放在0.1%氯化汞溶液中浸泡大約15 min；

然后放在75%乙醇中消毒30 s；

取出消毒完的蒴果用無菌水沖洗4～5遍，用滅菌的濾紙吸干表面水分，放置于滅菌的培養(yǎng)皿中；

用刀片將鐵皮石斛蒴果切開，均勻地播種于種子萌發(fā)的培養(yǎng)基中。

1.2.2種子的萌發(fā)培育。

根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]得知，選用1/2MS培養(yǎng)基，加入0.2 mg/L NAA，圓球莖增殖效果最好，根據(jù)以上數(shù)據(jù)配置鐵皮石斛種子萌發(fā)培育的培養(yǎng)基，將購買的鐵皮石斛蒴果接種于培養(yǎng)基上，獲得鐵皮石斛圓球莖（圖1）用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3鐵皮石斛圓球莖的增殖培養(yǎng)。選用MS培養(yǎng)基，加入不同濃度的NAA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）；選取直徑為0.5～1.0 cm的圓球莖接種到上述培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

1.2.4鐵皮石斛圓球莖的誘導(dǎo)處理。取出大約8 mL的秋水仙素放入15 mL離心管中，滅菌；取出滅菌的秋水仙素冷卻至室溫，用滅菌的去離子水將其稀釋成不同濃度的秋水仙素溶液（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%）；將選取的鐵皮石斛

圓球莖放入上述不同濃度秋水仙素溶液的離心管中，秋水仙素處理鐵皮石斛到達(dá)不同時(shí)間（12、24、36、48、60 h）后，倒出秋水仙素，用無菌水沖洗3～5次；將無菌水沖洗完的圓球莖放入滅菌培養(yǎng)皿中，用滅菌的濾紙吸干多余水分；最后將處理完的鐵皮石斛圓球莖接種到培養(yǎng)基中[6-8]。

1.2.5多倍體植株的鑒定。

1.2.5.1

材料前處理。取分生組織較強(qiáng)的部位，如根尖、愈傷組織等，取根尖大約0.5 cm左右，置于秋水仙素、8-羥基喹啉或?qū)Χ缺降热芤褐械蜏靥幚硪欢ǖ臅r(shí)間。

1.2.5.2植株鑒定。

用卡諾式固定液固定30 min以上，

用蒸餾水浸泡沖洗20 min以上（注意換水）。

用纖維素酶和果膠酶各2.5%的混合酶酶解30 min，

洗去材料表面殘留的酶液。

用1 mol/L HCL在60 ℃水浴中解離10 min。

最后用改良品紅溶液染色5～10 min，壓片，鏡檢[10]。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度NAA、6-BA對(duì)鐵皮石斛圓球莖繼代培養(yǎng)的影響

從表1可以看出，當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，隨著6-BA濃度增加，增殖強(qiáng)度逐漸增大，而后減小，當(dāng)NAA濃度達(dá)2.5 mg/L時(shí)，增殖強(qiáng)度普遍較低，6-BA濃度在1.5、20 mg/L時(shí)，增殖強(qiáng)度較高，當(dāng)6-BA濃度達(dá)2.0 mg/L以上時(shí)，增殖強(qiáng)度明顯過低。

當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，隨著NAA濃度的增大，增殖強(qiáng)度逐漸增大，而后減小，但效果不明顯，NAA濃度在1.0、1.5、20 mg/L時(shí)，增殖強(qiáng)度相對(duì)較好；NAA濃度在0.5、2.5 mg/L時(shí)，增殖強(qiáng)度較差。

由以上數(shù)據(jù)可以得出，細(xì)胞生長素與細(xì)胞分裂素在不同

比例時(shí)，鐵皮石斛圓球莖增殖效果不同，當(dāng)NAA濃度為1.5 mg/L、6-BA濃度為2.0 mg/L，45 d時(shí)增殖率高達(dá)80%，增殖效果最好。

2.2不同濃度的秋水仙素及處理時(shí)間對(duì)鐵皮石斛誘導(dǎo)的影響

從表2可以看出，秋水仙素濃度越低、處理時(shí)間越短時(shí)，成活率越高、誘導(dǎo)率相對(duì)較低；隨著秋水仙素濃度增大，處理時(shí)間延長，誘導(dǎo)率升高，但死亡率增大。當(dāng)秋水仙素濃度在一定時(shí)，處理時(shí)間在24 h以下時(shí)，成活率基本在70%以上；

當(dāng)處理時(shí)間在60 h以上時(shí)，成活率基本低于50%；當(dāng)處理時(shí)

間在24～48 h時(shí)，誘導(dǎo)率基本在20%～30%，成活率相對(duì)較高，效果較好，隨著秋水仙素濃度的增加，當(dāng)秋水仙素濃度達(dá)0.15%、0.20%時(shí)，誘導(dǎo)率較高，高達(dá)30%。

根據(jù)綜合情況考量，秋水仙素濃度為0.15%、處理時(shí)間為48 h時(shí)，成活率達(dá)40%，誘導(dǎo)率達(dá)30%，效果最好。

2.3多倍體植株的鑒定通過植物顯微技術(shù)，觀察得到的鐵皮石斛圓球莖如圖2～4。誘導(dǎo)處理過的鐵皮石斛圓球莖多為二倍體與四倍體混合形成的，為嵌合體。培育形成的多倍體鐵皮石斛具有較好的抗逆性、較高的適應(yīng)性。

3結(jié)論與討論

秋水仙素濃度越低，處理時(shí)間越短時(shí)，成活率越高、誘導(dǎo)率相對(duì)較低；隨著秋水仙素濃度增大，處理時(shí)間延長，誘導(dǎo)率升高，但死亡率增大。綜合考量，秋水仙素濃度在0.15%、處理時(shí)間為48 h時(shí)，成活率達(dá)40%，誘導(dǎo)率為30%，效果最好。當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，隨著6-BA濃度增加，增殖強(qiáng)度逐漸增大，而后減?。划?dāng)6-BA濃度一定時(shí)，隨著NAA濃度的增大，增殖強(qiáng)度逐漸增大，而后減小。綜合考量，NAA濃度為1.5 mg/L、6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，鐵皮石斛圓球莖增殖效果最好。

誘導(dǎo)處理過的鐵皮石斛圓球莖多為二倍體與四倍體混合形成的，為嵌合體，后期應(yīng)以嵌合體圓球莖培育出來的幼

苗，用根尖觀察鑒定，進(jìn)一步確定形成的多倍體鐵皮石斛數(shù)量。

培育形成的多倍體鐵皮石斛具有較好的抗逆性、較高的適應(yīng)性，將培育好的鐵皮石斛圓球莖培育成幼苗，成長成植株，可以通過氣孔觀察、葉片厚實(shí)程度、有效成分含量來進(jìn)一步驗(yàn)證多倍體鐵皮石斛在原有基礎(chǔ)上的優(yōu)勢(shì)。

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