分光光度法測定藜麥中總皂苷的含量

熊成文 李曉偉 徐得娟 賈燕花

摘要[目的]建立一種測定藜麥中總皂苷的分光光度法，研究藜麥中總皂苷的含量。[方法]采用超聲波提取、香草醛-高氯酸分光光度法，以藜麥皂苷A為對照品，檢測波長482 nm，樣品提取采用60%乙醇溶液，料液比1∶30（g∶mL），提取時間30 min，提取2次，回收乙醇后用水飽和的正丁醇萃取3次。[結果]藜麥中總皂苷濃度在0.021 12～0.063 36 mg/ mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系，線性方程為A=12.169C-0.071 4，相關系數(shù)0.999 9。[結論]建立了超聲波提取-分光光度法測定藜麥中總皂苷含量的新方法，該方法簡便、準確，可用于藜麥加工工藝的評價。

關鍵詞藜麥；總皂苷；含量測定；分光光度法；藜麥皂苷A

中圖分類號TS207文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）26-0096-03

Determination of Total Saponins in Quinoa by Spectrophotometry

XIONG Chengwen1，LI Xiaowei2，XU Dejuan2 et al（1.Qinghai Province Institute for Food Control，Xining，Qinghai 810000；2.Qinghai Gaoyuanjinhe Ecological Agriculture and Animal Husbandry Science and Technology Co.，Ltd.，Xining，Qinghai 810016 ）

Abstract[Objective] To establish a method for determination of Quimoa saponins by spectrophotometry，and study the content of total saponins in quinoa.[Method] By ultrasonic extraction and vanillinperchloric acid spectrophotometry，with quinoa saponins A as the reference substance，detection wavelength was 482 nm，the samples extracted with 60% ethanol solution，solidliquid ratio was 1∶30 ，extraction time was 30 minutes，twice extraction，watersaturated nbutanol extracted three times after the recovery of ethanol .[Result] The concentration of total saponins in quinoa has a good linear relationship in 0.021 12 ～ 0.063 36 mg/mL.The linear equation was A=12.169C-0.071 4，and the correlation coefficient was 0.999 9.[Conclusion] A new method was established for determination of content of total saponins in quinoa by ultrasonic extraction and Spectrophotometry.The method is convenient and exact.It can be used for the evaluation of processing techniques of quinoa.

Key wordsQuinoa；Total saponins；Assay；Spectrophotometry；Quinoa saponins A

莧科藜屬植物（Chenopodium spp.）通常被稱為“昆諾阿藜”，大約有250種，在眾多未被充分利用作物中，最具有發(fā)展前景[1]。藜麥的原產(chǎn)地為安第斯山脈地區(qū)，當?shù)厝艘延屑s7 000年的種植歷史[2]。19世紀70年代中期，藜麥特殊的營養(yǎng)價值被發(fā)現(xiàn)，越來越多的消費者開始食用藜麥[3]。藜麥籽實富含蛋白質，葉片可作為菜用，其生產(chǎn)和食用方式與谷物類似。由于谷物是單子葉植物，藜麥是一種雙子葉植物，因而藜麥并非是真正的谷物，而是一種假谷物。

藜麥皂苷存在于藜麥植物各部位中，如葉片、花、果實、籽實和種皮。藜麥皂苷主要為三萜皂苷，通過異戊二烯途徑生成，齊墩果酸型和商陸酸型為常見類型，糖苷配基主要為半乳糖阿拉伯糖與葡萄糖。藜麥種皮含有大量的皂角苷，是藜麥中主要的抗營養(yǎng)物質[4]，已有研究指出，藜麥皂角苷會妨礙某些營養(yǎng)元素的吸收[5]，因此在食用和制作食物的過程中，一般需要先用水洗去藜麥皂苷。建立一種簡便、準確的藜麥皂苷含量測定方法，可為藜麥的加工工藝提供有利的評價手段，同時藜麥皂苷也被廣泛用于化妝品、食品添加劑、生物農(nóng)藥等行業(yè)，因此藜麥皂苷含量測定方法的建立是十分有用和必要的。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與試劑。

供試藜麥為青藜一號，產(chǎn)自青海省海西蒙古族藏族自治州都蘭縣，平均海拔3 100 m；藜麥皂苷A對照品，青海高遠錦禾生態(tài)農(nóng)牧科技有限公司制備。香草醛、乙醇、甲醇、冰醋酸、高氯酸，均為分析純；實驗室用水為超純水。

1.1.2主要儀器設備。Lambda 35 紫外可見分光光度計，美國PE公司；FA2004電子分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；101-1S電熱鼓風干燥箱，邦西儀器科技（上海）有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司；JP-030S超聲波清洗機，深圳市潔盟清洗設備有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

1.2樣品測定

1.2.1標準溶液的配制。藜麥籽實中的皂苷為三萜皂苷，在沒有藜麥皂苷對照品的情況下通常選用齊墩果酸為對照品，但藜麥皂苷因含有糖苷配基分子量一般在700以上，而齊墩果酸不含糖苷配基分子量為456.71，故實驗室通過高效液相色譜純化制備了藜麥皂苷A，分子結構見圖1，分子量810.44，并以藜麥皂苷A為對照品建立含量測定方法。

準確稱取藜麥皂苷A對照品6.60 mg，置25 mL量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成0.264 mg/ mL的標準儲備溶液。

1.2.2標準曲線[6] 。分別精密量取藜麥皂苷A標準儲備溶液各0、400、600，800、1 000、1 200 μL置于干燥的具塞試管中，60 ℃蒸干，取出放冷，依次加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻，于60 ℃水浴中保溫15 min，取出，用冰水浴冷卻10 min，加入4 mL冰醋酸，搖勻。選取藜麥皂苷A 800 μL的標準溶液，于400～760 nm范圍進行掃描，選定最大吸收波長為測定波長。在最大吸收波長處測定各標準溶液的吸光度A，以吸光度A為縱坐標，以相應對照品濃度（mg/mL）為橫坐標，分別繪制標準曲線。

1.2.3供試品溶液的制備。

1.2.3.1乙醇體積分數(shù)的確定。將一定量的藜麥種子粉碎后過60目篩，分別稱取藜麥粉5份，每份1 g，置于100 mL錐形瓶中，按料液比1∶30（g∶mL）分別加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇水溶液，超聲提取15 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液，殘渣重復提取1次，合并上清液回收乙醇至無醇味，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次10 mL，合并萃取液，揮干溶劑，殘渣用甲醇溶解，轉移至50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液400 μL，置于具塞試管中，60 ℃蒸干，取出放冷，采取與標準溶液相同的方法測定其吸光度A。根據(jù)標準曲線查得供試品溶液中總皂苷的濃度（mg/mL），按照公式計算出藜麥中總皂苷的含量，確定最佳的乙醇體積分數(shù)。

總皂苷含量（mg/g）=CV/W

式中，C為供試品溶液中總皂苷的濃度（mg/mL）；V為供試品溶液的總體積（mL）；W為藜麥重量（g）。

1.2.3.2料液比的確定。分別稱取粉碎過篩后的藜麥粉5份，每份1 g，置于100 mL錐形瓶中，分別加入60%乙醇溶液10、20、30、40、50 mL[料液比依次為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL）]，超聲提取15 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液，殘渣重復提取1次，合并上清液回收乙醇至無醇味，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次10 mL，合并萃取液，揮干溶劑，殘渣用甲醇溶解，轉移至50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液400 μL，置于具塞試管中，60 ℃蒸干，取出放冷，采取與標準溶液相同的方法測定其吸光度值A，在標準曲線上查得供試品溶液中總皂苷的濃度（mg/mL），按照公式計算出藜麥中總皂苷含量，確定最佳的料液比。

1.2.3.3提取時間的確定。分別稱取粉碎好的藜麥粉 5份，每份1 g，置于100 mL錐形瓶中，按照確定好的料液比和乙醇體積分數(shù)加入乙醇溶液，分別提取15、30、45、60、90 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液，殘渣重復提取1次，合并上清液回收乙醇至無醇味，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次10 mL，合并萃取液，揮干溶劑，殘渣用甲醇溶解，轉移至50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液400 μL，置于干燥的具塞試管中，60 ℃蒸干，取出放冷，采取與標準溶液相同的方法測定其吸光度值A。根據(jù)標準曲線查得供試品溶液中皂苷的濃度，確定最佳的提取時間。

1.2.3.4萃取次數(shù)的確定。分別稱取粉碎好的藜麥粉 5份，每份1 g，置于100 mL錐形瓶中，按照確定好的料液比和乙醇體積分數(shù)加入乙醇溶液，超聲提取30 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液，殘渣重復提取1次，合并上清液回收乙醇至無醇味，分別用水飽和的正丁醇萃取1、2、3、4、5次，每次10 mL，合并萃取液，揮干溶劑，殘渣用甲醇溶解，轉移至50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液400 μL，置于干燥的具塞試管中，60 ℃蒸干，取出放冷，采取與標準溶液相同的方法測定其吸光度值A。根據(jù)標準曲線查得供試品溶液中皂苷的濃度（mg/mL），確定最佳的萃取次數(shù)。

1.2.4藜麥樣品中總皂苷的測定。取藜麥籽實、藜麥葉、藜麥莖稈和藜麥種皮樣品粉碎后過60目篩，分別稱取粉碎好的樣品粉各2份，每份1 g，置于100 mL錐形瓶中，加入60%乙醇溶液30 mL，超聲提取30 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液，殘渣重復提取1次，合并上清液回收乙醇至無醇味，用水飽和的正丁醇萃取4次，每次10 mL，合并萃取液，揮干溶劑，殘渣用甲醇溶解，轉移至50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液400 μL，置于干燥的具塞試管中，60 ℃蒸干，取出放冷，采取與標準溶液相同的方法測定其吸光度值A。根據(jù)標準曲線查得供試品溶液中皂苷的濃度，確定各樣品中藜麥總皂苷的含量。

2結果與分析

2.1檢測波長的測定

由圖2可知，藜麥皂苷A對照品在400～700 nm處的最大吸收波長為482 nm，因此，選用482 nm作為檢測波長。

2.2標準曲線的繪制

通過數(shù)據(jù)處理得到的藜麥皂苷A對照溶液回歸方程為y=12.169 x-0.071 4，r=0.999 9，在0.0211 2～0.063 36 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好（圖3）。

2.3供試品溶液制備條件的確定

2.3.1乙醇體積分數(shù)對藜麥總皂苷提取效果的影響。從圖4可以看出，當乙醇的體積分數(shù)從50%提高到60%時，提取出的藜麥總皂苷含量逐漸增加；當乙醇的體積分數(shù)從60%提高到90%時，提取出的藜麥總皂苷含量逐漸減少，乙醇的體積分數(shù)為60%時，提取出的藜麥總皂苷含量最大，為24.72 mg/g。因此，確定乙醇的最佳體積分數(shù)為60%。

2.3.2料液比對藜麥總皂苷提取效果的影響。由圖5可知，當料液比為1∶10～1∶30（g∶mL）時，提取出的藜麥總皂苷含量明顯增加；當料液比為1∶30～1∶50（g∶mL）時，提取出的藜麥總皂苷含量不再明顯增加，故確定料液比的值為1∶30（g∶mL）。

2.3.3提取時間對藜麥總皂苷提取效果的影響。從圖6可以看出，隨著提取時間的增加，藜麥總皂苷的提取量逐漸增大，當提取時間大于30 min后藜麥總皂苷的提取量不再明顯增加，考慮到提取效率確定提取時間為30 min。

2.3.4萃取次數(shù)對總皂苷提取效果的影響。從圖7可以看出，隨著萃取次數(shù)的增加，總皂苷的提取量也隨著增大，當萃取次數(shù)為4次時，提取出的總皂苷含量為24.74 mg/g，萃取5次時提取出的總皂苷含量為24.79 mg/g，說明萃取大于4次時，提取出的總皂苷含量不再增加。因此，確定提取過程中萃取4次即可。

2.4藜麥樣品中總皂苷的測定結果

藜麥籽實、藜麥葉、藜麥莖稈和藜麥種皮中均檢測出藜麥總皂苷，含量依次為27.26、49.89、9.78、97.68 mg/g，其中藜麥種皮中總皂苷含量最多。

3結論

藜麥皂苷是藜麥中主要的抗營養(yǎng)物質，味苦，可防止鳥類和昆蟲的食用，起到保護藜麥葉片和籽實的作用，不利于作為食物和飼料應用。同時，皂苷類物質具有一定的生物活性，可用于保健食品、化妝品、生物農(nóng)藥、食品添加劑中，建立一種簡便、可靠的藜麥總皂苷測定方法十分必要。采用超聲波提取，香草醛-高氯酸比色法測定藜麥中皂苷含量，以藜麥皂苷A為對照品，檢測波長482 nm，樣品提取采用60%乙醇溶液，料液比1∶30（g∶mL），提取時間30 min，提取2次。配制不同濃度對照品溶液建立標準曲線，通過在標準曲線上查得的供試品溶液皂苷濃度計算樣品中藜麥總皂苷的含量。對藜麥籽實、藜麥葉、藜麥莖稈和藜麥種皮樣品中藜麥總皂苷含量的測定表明，藜麥種皮中含有的總皂苷最多，為97.68 mg/g；其次為藜麥葉片和藜麥籽實；藜麥莖稈中含有的總皂苷最少，為9.78 mg/g。

參考文獻

[1]

GIUSTI L.El género chenopodium en argentina： I.Números de cromosomas[J].Darwiniana，1970，16： 98-105.

[2] GARCIA CARDENAS M.Agroclimatic study and drought resistance analysis of quinoa for an irrigation strategy in the Bolivian Altiplano[D].Leuven：Katholieke Universiteit Leuven，2003.

[3] MAUGHAN P J，BONIFACIO A，COLEMAN C E，et al.Quinoa（Chenopodium quinoa）[M]//KOLE C.Genome mapping and molecular breeding in plants.Heidelberg： Springer，2007：147-158.

[4] ESTRADA A，LI B，LAARVELD B.Adjuvant action of Chenopodium quinoa saponins on the induction of antibody responses to intragastric and intranasal administered antigens in mice[J].Comparative immunology，microbiology and infectious diseases，1998，21（3）： 225-236.

[5] IMPROTA F，KELLEMS R O.Comparison of raw，washed and polished quinoa （Chenopodium quinoa Willd.） to wheat，sorghum or maize based diets on growth and survival of broiler chicks[J].Livestock research for rural development，2001，13（1）： 10.

[6] 谷利偉，谷文英.比色法測定大豆中的總皂甙[J].中國糧油學報，2000，15（6）： 38-42.

安徽農(nóng)業(yè)科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（26）：122-125