食管鱗癌細(xì)胞系TE7放射照射后miRNAs及DNA修復(fù)相關(guān)因子的表達(dá)*

趙曉靜，馬 軍#，袁 翎，王昆侖，李 南，張中冕，孫 佳

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，河南省腫瘤醫(yī)院放療科 鄭州 450014 3)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450014

食管鱗癌細(xì)胞系TE7放射照射后miRNAs及DNA修復(fù)相關(guān)因子的表達(dá)*

趙曉靜1)，馬 軍1)#，袁 翎2)，王昆侖2)，李 南3)，張中冕3)，孫 佳3)

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，河南省腫瘤醫(yī)院放療科 鄭州 450014 3)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450014

#通信作者，男，1966年8月生，博士，副教授，研究方向：消化道腫瘤，E-mail:843093451@qq.com

食管癌；miR-126；miR-21；miR-101；DNA-PKcs；RAD21；放射照射

目的：探討食管鱗癌細(xì)胞系TE7放射照射后miRNAs及DNA修復(fù)相關(guān)因子表達(dá)的關(guān)系。方法：采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同劑量(0、2、4、6、8 Gy)X射線照射后TE7中miR-126、miR-21、miR-101、DNA-PKcs mRNA及RAD21 mRNA的表達(dá)，蛋白免疫印跡法檢測(cè)DNA-PKcs和RAD21蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：X射線照射后，隨吸收劑量的增加，TE7中miR-126表達(dá)逐漸升高(P<0.05)，miR-101表達(dá)降低(P<0.05)，DNA-PKcs和RAD21 mRNA表達(dá)逐漸升高(P<0.05)；磷酸化DNA-PKcs、總DNA-PKcs及RAD21蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)。當(dāng)吸收劑量是4 Gy時(shí)，TE7細(xì)胞中miR-126、miR-101與RAD21蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.899、-0.853，P均<0.05)。結(jié)論：miR-126及miR-101可能通過(guò)調(diào)節(jié)RAD21的表達(dá)影響TE7細(xì)胞的放療敏感性。

食管癌死亡率位于所有腫瘤的第6位，5 a生存率小于20%[1]。放療是進(jìn)展期食管癌主要的治療方法，其主要通過(guò)誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂來(lái)殺傷細(xì)胞，而DNA雙鏈斷裂的修復(fù)通常導(dǎo)致治療失敗，抑制DNA損傷修復(fù)可提高癌細(xì)胞的放療敏感性[2]。DNA 雙鏈斷裂修復(fù)主要有非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重組(homologous recombination repair,HRR)兩條途徑。DNA-PK(DNA-dependent protein kinase)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中參與NHEJ的主要分子之一，由Ku70、Ku80、DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)3個(gè)亞基組成，其中DNA-PKcs是中心因子，在DNA斷裂修復(fù)中起著重要作用[3-4]。RAD21是凝集復(fù)合體的一個(gè)組分，凝集復(fù)合體參與姐妹染色單體的結(jié)合、DNA雙鏈斷裂的修復(fù)及細(xì)胞周期的調(diào)控[5]。RAD21可以直接或間接地促進(jìn)HRR[6]。microRNA(miRNA)作為一種內(nèi)源性小單鏈非編碼RNA，一般包含18～25個(gè)核苷酸，其主要通過(guò)與RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)結(jié)合形成非對(duì)稱的復(fù)合物，再與靶基因mRNA的3’-非編碼區(qū)域(UTR)結(jié)合，從降解靶基因mRNA或者抑制靶基因轉(zhuǎn)錄后翻譯的角度調(diào)控靶基因的表達(dá)[7-9]，其參與許多生理和病理性進(jìn)程，包括放療相關(guān)的信號(hào)通路[10]。作者用X射線照射食管鱗癌細(xì)胞系TE7，觀察照射前后DNA修復(fù)相關(guān)因子DNA-PKcs、RAD21以及miR-101、miR-21、miR-126表達(dá)的變化，探討miRNAs與TE7放療敏感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源及分組處理 TE7細(xì)胞由課題組實(shí)驗(yàn)室保存，用6 cm培養(yǎng)皿，含體積分?jǐn)?shù)10%新生牛血清、青鏈霉素(各100 U/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，分5組進(jìn)行X射線(瑞典醫(yī)科達(dá)公司直線加速器，型號(hào)：Synergy,速率2 Gy/min)照射，吸收劑量分別為0、2、4、6和8 Gy，照射24 h后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2 細(xì)胞中mRNAs和miRNAs的檢測(cè) 采用Trizol法(Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA，行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察完整性。miRNAs引物購(gòu)于GenePharma公司，mRNAs引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。根據(jù)Thermo Scientific試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所有操作均在冰上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括2×qPCR Master Mix(SYBR) 10 μL、10 μmol/L引物0.4 μL、5 U/μL Taq DNA 多聚酶0.2 μL、模板cDNA 3 μL，雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。采用ABI PRISM 7500 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。mRNAs反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 min,94 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,40個(gè)循環(huán)。miRNAs反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s,62 ℃ 40 s,40個(gè)循環(huán)。miRNAs的表達(dá)水平用內(nèi)參U6 snRNA標(biāo)準(zhǔn)化，DNA-PKcs和RAD21 mRNA的表達(dá)水平用內(nèi)參β-actin標(biāo)準(zhǔn)化，用 2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3 細(xì)胞中DNA-PKcs、RAD21蛋白的檢測(cè) 用蛋白裂解液提取細(xì)胞中的蛋白[11]。用1×裂解液制備蛋白樣品，(50～160) g/L梯度分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜12 h×250 mA。體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加一抗4 ℃振蕩過(guò)夜孵育。磷酸化DNA-PKcs(p-DNA-PKcs)和RAD21抗體購(gòu)于Abcam公司，總DNA-PKcs(t-DNA-PKcs)購(gòu)于Cell Signaling Technology公司，p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs、RAD21抗體稀釋度均為1:3 000，內(nèi)參β-actin抗體稀釋度為1:5 000。然后TBST洗膜3次，二抗孵育60 min，洗膜3次后ECL染色，用FluorChem FC3成像儀采集圖像，進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，5組間各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)指標(biāo)之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 5組TE7細(xì)胞中miRNAs及mRNAs的表達(dá)情況 見(jiàn)表2。隨照射劑量的增大，TE7細(xì)胞中miR-126、DNA-PKcs mRNA和RAD21 mRNA的表達(dá)逐漸升高，miR-101的表達(dá)降低。

表2 5組TE7細(xì)胞中miRNAs及mRNAs的表達(dá)

*：與0 Gy組比較，P<0.05；#：與2 Gy組比較，P<0.05；△：與4 Gy組比較，P<0.05；▲：與6 Gy組比較，P<0.05。

2.2 5組TE7細(xì)胞中DNA-PKcs及RAD21蛋白的表達(dá)情況 5組TE7細(xì)胞中p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs、RAD21蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1、表3。

圖1 5組TE7細(xì)胞中DNA-PKcs及RAD21蛋白的表達(dá)

表3 5組TE7細(xì)胞中DNA-PKcs及RAD21蛋白的表達(dá)

2.3 放射照射后TE7細(xì)胞中miR-126、miR-21和miR-101水平與DNA修復(fù)蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 采用Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)吸收劑量為4 Gy時(shí)，miR-126、miR-101與RAD21蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，r分別為-0.899(P=0.008)、-0.853(P=0.019)。

3 討論

食管癌的放療抵抗是導(dǎo)致治療失敗的主要原因，因此提高癌細(xì)胞的放射敏感性可提高食管癌的治療效果。放療抵抗的主要機(jī)制之一是PI3K/Akt信號(hào)通路的過(guò)度激活，AKT可激活DNA-PKcs，從而促進(jìn)DNA雙鏈斷裂的修復(fù)，降低腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[2]。Toulany等[12]研究發(fā)現(xiàn)雙重作用于PI3K 和MEK可以增強(qiáng)A549 和H460 細(xì)胞的放療敏感性。DNA-PK中的Ku70、Ku80是組成Ku蛋白的調(diào)節(jié)亞基，在DNA雙鏈斷裂修復(fù)中起著辨認(rèn)、結(jié)合排列DNA末端并募集催化亞基DNA-PKcs的作用。DNA-PKcs可磷酸化LigaseⅣ、XRCC4，從而使得后者發(fā)揮連接雙鏈斷裂DNA的作用。腫瘤細(xì)胞中任意一個(gè)組分缺陷均可導(dǎo)致DNA-PK活性喪失，而致放射敏感性增強(qiáng)[4]。RAD21最初在酵母粟酒中被發(fā)現(xiàn)，其可以保持姐妹染色單體的結(jié)合并確保復(fù)制染色體正確分離并進(jìn)入子細(xì)胞，可以直接或間接地促進(jìn)HRR[6]。de Andrade等[11]發(fā)現(xiàn)放射照射后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中DNA-PKcs的表達(dá)顯著升高。Yang等[13]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞HepG2 中DNA-PKcs 蛋白表達(dá)升高，60Co γ電離輻射可進(jìn)一步增強(qiáng)DNA-PKcs的表達(dá)，而DNA-PK抑制劑NU7441能夠增強(qiáng) HepG2 細(xì)胞的放療敏感性。Bauerschmidt等[5]發(fā)現(xiàn)10 Gy X射線照射后，宮頸癌細(xì)胞中RAD21表達(dá)升高。該研究結(jié)果顯示， X射線照射后，食管鱗癌細(xì)胞TE7中DNA-PKcs和RAD21 mRNA表達(dá)水平升高，且兩者的表達(dá)隨照射劑量的增大而增加，但在蛋白水平上并沒(méi)有顯示出這種效應(yīng)。

miRNA是一類非編碼的小RNA，可綁定多個(gè)靶向mRNAs的3′-UTR，通過(guò)阻斷靶基因翻譯或下調(diào)靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡、代謝、死亡等過(guò)程的調(diào)控[14]。因此識(shí)別并調(diào)控針對(duì)DNA雙鏈斷裂修復(fù)的miRNAs，有可能提高腫瘤細(xì)胞的放療敏感性。該研究對(duì)X射線照射后TE7細(xì)胞中miR-101、miR-21、miR-126的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。

Nie等[15]的研究結(jié)果顯示，人食管鱗癌組織中miR-126低表達(dá)，miR-126可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制EC109細(xì)胞的增殖和遷移。Templin和Vincenti等[16-17]發(fā)現(xiàn)放療后患者外周血中miR-126表達(dá)升高，提示其可以作為放療敏感性的一個(gè)標(biāo)志物。Yan等[18]用熒光素酶報(bào)告法證明了miR-101可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)DNA-PKcs和ATM來(lái)增強(qiáng)肺癌細(xì)胞株的放療敏感性。該研究結(jié)果顯示，X射線照射后食管鱗癌細(xì)胞TE7中miR-126表達(dá)升高，miR-101表達(dá)降低，且兩者的表達(dá)隨照射劑量的增大而變化；當(dāng)吸收劑量為4 Gy時(shí)，TE7中miR-101、miR-126與RAD21蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，與p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs的表達(dá)無(wú)相關(guān)性，提示miR-126及miR-101可能通過(guò)調(diào)節(jié)HRR通路蛋白R(shí)AD21的表達(dá)影響TE7細(xì)胞的放療敏感性。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)X射線照射后TE7細(xì)胞存在放射性抵抗現(xiàn)象，DNA-PKcs mRNA及RAD21 mRNA表達(dá)升高。miR-126及miR-101可能通過(guò)調(diào)節(jié)HRR通路蛋白R(shí)AD21的表達(dá)來(lái)影響TE7細(xì)胞的放療敏感性，這為食管癌的臨床治療提供了新思路。

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(2016-11-18收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Expressions of miRNAs and DNA damage repair factors in esophageal squamous cell carcinoma cell line TE7 after X-ray radiation

ZHAOXiaojing1),MAJun1),YUANLing2),WANGKunlun2),LINan3),ZHANGZhongmian3),SUNJia3)

1)DepartmentofDigestiveDiseases,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)DepartmentofRadiotherapy,theAffiliatedCancerHospital,ZhengzhouUniversity;HenanProvincialCancerHospital,Zhengzhou450014 3)DepartmentofOncology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

esophageal carcinoma;miR-126；miR-21；miR-101；DNA-PKcs；RAD21；radiation

Aim: To explore the expressions of miRNAs and DNA repair factors in esophageal squamous cell carcinoma cell line TE7 after radiation. Methods: Real-time PCR was used to detect the expressions of miR-126, miR-21, miR-101, DNA-PKcs, and RAD21 mRNA in TE7 cells treated with different doses(0, 2, 4, 6, 8 Gy) of X-ray radiation, and Western blot was used to detect the expressions of DNA-PKcs and RAD21 protein. Results: In TE7 cells treated with X-ray radiation, the expressions of miR-126, DNA-PKcs and RAD21 mRNA were up-regulated with the dose increasing(P<0.05), that of miR-101 was down-regulated (P<0.05), and the expressions of phospho-DNA-PKcs, total DNA-PKcs and RAD21 protein had no statistical changes(P>0.05). The expressions of miR-126 and miR-101 were negatively correlated with that of RAD21 protein(r=-0.899,-0.853，P<0.05) in TE7 cells treated with 4 Gy radiation.Conclusion: MiR-126 and miR-101 may influence the radio-sensitivity of TE7 cells by regulating the expression of RAD21.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.002

*河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目 152300410164

R735.1