正常宮頸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)體系的改良*

李 雅，榮守華，智艷芳，樊婷婷，邱 翠，李肖甫

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院細(xì)胞室 鄭州 450052

正常宮頸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)體系的改良*

李 雅，榮守華，智艷芳，樊婷婷，邱 翠，李肖甫#

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院細(xì)胞室 鄭州 450052

#通信作者，男，1964 年7 月生，碩士，教授，研究方向：腫瘤細(xì)胞病理學(xué)，E-mail：lixiaofu1964@163.com

原代培養(yǎng)；宮頸上皮細(xì)胞；中性蛋白酶；角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基

目的：探索一種高效、可重復(fù)的正常宮頸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。方法：取60例正常宮頸組織，分成2組，分別采用Ⅱ型中性蛋白酶聯(lián)合0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA(中性蛋白酶聯(lián)合法)及Ⅰ型膠原酶消化分離后進(jìn)行原代培養(yǎng)，比較兩種分離效果；觀察采用中性蛋白酶聯(lián)合法消化不同時間對分離效果的影響。觀察添加體積分?jǐn)?shù)5%FBS dK-SFM培養(yǎng)基與單純dK-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)原代宮頸上皮細(xì)胞的生長曲線差異，并用形態(tài)學(xué)、廣譜角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定細(xì)胞來源。結(jié)果：正常宮頸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)總成功率為40%。中性蛋白酶聯(lián)合法成功率、分離所得細(xì)胞密度、原代細(xì)胞融合時間及細(xì)胞純度均高于Ⅰ型膠原酶消化法(P<0.05)。中性蛋白酶消化20 h的分離效果優(yōu)于消化16和24 h(P<0.05)。體積分?jǐn)?shù)5%FBS dK-SFM培養(yǎng)基原代培養(yǎng)的宮頸上皮細(xì)胞增殖活性高于單純dK-SFM培養(yǎng)基(P<0.05)。細(xì)胞生長狀況良好，可在體外傳代至5～6代，并可凍存與復(fù)蘇，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示廣譜角蛋白表達(dá)陽性。結(jié)論：Ⅱ型中性蛋白酶聯(lián)合0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA分離法和體積分?jǐn)?shù)5% FBS dK-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)原代正常宮頸上皮細(xì)胞，高效、可重復(fù)性好。

剛離體的原代細(xì)胞保留有原有的生物學(xué)遺傳特性，能反映體內(nèi)細(xì)胞生長的一般特征，適用于藥物及癌癥治療等研究[1-2]。正常宮頸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)對于深入研究人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制至關(guān)重要。從理論及實際操作的角度而言，建立正常宮頸上皮細(xì)胞及攜帶HPV的宮頸上皮細(xì)胞的體外細(xì)胞模型，有利于更好地了解HPV 感染宮頸上皮細(xì)胞的病理改變，而且較體內(nèi)動物實驗更為簡便易行。但原代細(xì)胞獲得過程較復(fù)雜、細(xì)胞純度低且培養(yǎng)困難，限制了宮頸原代細(xì)胞的應(yīng)用。雖然目前已有少量對正常宮頸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的研究[3-5]，但一直尚無公認(rèn)且成熟穩(wěn)定的正常宮頸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。因此，該研究通過比較不同分離方法、不同培養(yǎng)基對正常宮頸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的影響，旨在探尋一種最佳的正常宮頸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，為宮頸癌發(fā)病機(jī)制的研究打下堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型中性蛋白酶購于美國Sigma公司，無血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基dK-SFM購于美國Gibco公司，DMEM/F12培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司，0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA、D-PBS、Ⅰ型鼠尾膠原均購于北京索萊寶科技有限公司，鼠抗人廣譜細(xì)胞角蛋白單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司，兔抗人波形蛋白多克隆抗體、即用型免疫組織化學(xué)試劑盒購于上海生工生物工程有限公司，CCK-8購于日本同仁公司，無菌細(xì)胞爬片購于無錫耐思生物科技有限公司。CO2培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產(chǎn)品，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司產(chǎn)品)。1.2 正常宮頸上皮組織來源 選取2015年9月至2016年4月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科因良性子宮病變(如子宮肌瘤、子宮腺肌病等)行子宮全切術(shù)患者的宮頸標(biāo)本60例，患者年齡43～54歲，中位年齡47歲；術(shù)前液基細(xì)胞學(xué)及HPV檢測結(jié)果均為陰性，且術(shù)后追蹤組織學(xué)結(jié)果提示無宮頸異常病變。所有患者均簽署知情同意書。無菌條件下術(shù)中子宮離體后立即取宮頸鱗柱交界區(qū)上皮組織2～3塊，每塊大小約1 cm×1 cm×1 cm，置于含10 mL提前預(yù)冷的DMEM-F12轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的離心管中，轉(zhuǎn)移至含雙抗(青、鏈霉素)的培養(yǎng)基內(nèi)，20 min內(nèi)4℃低溫轉(zhuǎn)運(yùn)。1.3 實驗分組 分為2組，每組30例，分別采用中性蛋白酶聯(lián)合法及Ⅰ型膠原酶法進(jìn)行分離及原代培養(yǎng)。

1.4 正常宮頸上皮細(xì)胞的體外分離

1.4.1 宮頸上皮細(xì)胞的分離 將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至含雙抗預(yù)冷D-PBS溶液的培養(yǎng)皿中，剪去血污及結(jié)締組織，浸泡5 min，并用預(yù)冷D-PBS溶液沖洗5次。①中性蛋白酶聯(lián)合法：將標(biāo)本平均分為3份，加入5 mL(2.4 U/mL)Ⅱ型中性蛋白酶溶液并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，4 ℃ 過夜消化，分別消化16、20和24 h后，室溫下于超凈工作臺靜置1 h，用眼科彎鑷沿一個方向完整分離整塊上皮組織，再次用含雙抗的D-PBS溶液沖洗3次，用眼科剪將其剪碎，加入0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA 5 mL，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，37 ℃消化10 min后，加入體積分?jǐn)?shù)10%完全基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化，吹打離散2 min，靜置2 min。②Ⅰ型膠原酶法：用眼科剪將組織剪碎至糊狀，加入Ⅰ型膠原酶(0.2 g/mL)溶液5 mL并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，37 ℃消化50 min，待組織邊緣模糊、酶消化液變稍渾濁，加入體積分?jǐn)?shù)10%完全基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋終止消化。吸取上清液，用200目濾網(wǎng)過濾至15 mL離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清，用5 mL的dK-SFM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

1.4.2 原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)：調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為3×105mL-1，接種于Ⅰ型鼠尾膠原(2 μg/cm2)預(yù)包被的25 cm2培養(yǎng)瓶，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行原代培養(yǎng)。48 h后首次換液，之后每2 d更換新鮮培養(yǎng)液。若細(xì)胞背景干凈，可每2 d給予半換液，細(xì)胞對數(shù)生長期除外。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀況及細(xì)胞融合時間。 傳代培養(yǎng)：當(dāng)細(xì)胞生長至70%～80%融合，PBS沖洗，加入1 mL 0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA，室溫下放置0.5 min，吸棄胰酶，置于37 ℃培養(yǎng)箱3 min，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞逐漸變亮、變圓，并出現(xiàn)流沙樣運(yùn)動時，立即加入完全培養(yǎng)基終止消化，將單細(xì)胞懸液分為兩等份，1 500 r/min分別離心5 min，棄上清液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實驗分為兩組，一組為原代和傳代培養(yǎng)均添加體積分?jǐn)?shù)5%FBS的dK-SFM組，另一組為原代和傳代培養(yǎng)均采用的單純dK-SFM組。

1.5 細(xì)胞計數(shù) 倒置相差顯微鏡下用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)所得的細(xì)胞密度及中性蛋白酶聯(lián)合法消化不同時間所得的細(xì)胞數(shù)量。實驗重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞活力的測定 將細(xì)胞懸液與0.4 g/mL臺盼藍(lán)以體積比9:1混勻，3 min內(nèi)在倒置相差顯微鏡下計數(shù)活細(xì)胞與死細(xì)胞，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞呈透明狀，不著色。細(xì)胞活力=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。實驗重復(fù)3次。

1.7 正常宮頸上皮細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 選取廣譜細(xì)胞角蛋白抗體為上皮細(xì)胞鑒定標(biāo)志物，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白抗體為陰性對照，將細(xì)胞接種于同樣預(yù)包被的6孔培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞密度為(1～2)×105mL-1，生長約3 d細(xì)胞融合至70%～80%，用40 g/L多聚甲醛常溫固定 20 min后，加入廣譜細(xì)胞角蛋白抗體和波形蛋白抗體，4 ℃過夜孵育，按二抗試劑盒操作說明加入二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。以胞質(zhì)呈棕黃色為陽性染色細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下隨機(jī)選取5個高倍視野(×400)，計數(shù)陽性細(xì)胞和同一視野下細(xì)胞總數(shù)。正常宮頸上皮細(xì)胞的純度/(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，實驗重復(fù)3次。

1.8 CCK-8法繪制細(xì)胞生長曲線 取第2代對數(shù)生長期添加體積分?jǐn)?shù)5%FBS dK-SFM培養(yǎng)基和單純dK-SFM培養(yǎng)基的細(xì)胞。常規(guī)0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA消化，調(diào)整細(xì)胞密度至1×104mL-1，將細(xì)胞懸液接種于96孔板，100 μL/孔，每組設(shè)5個復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后第1天開始，每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃繼續(xù)孵育2 h，檢測450 nm處吸光度(OD)值。實驗重復(fù)3次，繪制第1～7天細(xì)胞生長曲線。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析。兩種分離方法分離的細(xì)胞密度、原代細(xì)胞融合時間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗，成功率的比較采用χ2檢驗，細(xì)胞純度的比較采用Fisher精確概率法。中性蛋白酶聯(lián)合法不同消化時間的分離細(xì)胞密度、細(xì)胞活力、原代細(xì)胞融合時間、原代所獲細(xì)胞數(shù)量比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonfrroni檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的原代培養(yǎng)情況 共收集標(biāo)本60例，培養(yǎng)成功24例(總培養(yǎng)成功率為40%)。其中中性蛋白酶聯(lián)合法培養(yǎng)成功16例，Ⅰ型膠原酶法培養(yǎng)成功8例。

2.2 兩種分離方法對細(xì)胞原代培養(yǎng)效果的影響 中性蛋白酶聯(lián)合法成功率、分離所得細(xì)胞密度、原代細(xì)胞融合時間及細(xì)胞純度均高，見表1。中性蛋白酶聯(lián)合消化法分離所得細(xì)胞數(shù)量明顯多于Ⅰ型膠原酶法，見圖1。

表1 不同方法分離效果的比較

#：精確概率法。

A:Ⅰ型膠原酶消化法；B:中性蛋白酶聯(lián)合法。圖1 兩種方法分離所得的原代正常宮頸上皮細(xì)胞(×200)

2.3 中性蛋白酶聯(lián)合法不同消化時間對培養(yǎng)效果的影響 中性蛋白酶聯(lián)合法在消化20 h時所得細(xì)胞密度、細(xì)胞活力、原代細(xì)胞融合時間及原代所獲細(xì)胞量均高于消化16和24 h，見表2。

表2 中性蛋白酶聯(lián)合法不同消化時間培養(yǎng)效果的比較

*:與培養(yǎng)16和24 h比較，P<0.05。

2.4 細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察 經(jīng)中性蛋白酶聯(lián)合消化分離、采用體積分?jǐn)?shù)5% FBS dK-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，可見細(xì)胞大部分貼壁伸展，呈多角形或圓形，成團(tuán)聚集分布，胞核明顯，少量成纖維細(xì)胞呈紡錘形，圍繞上皮細(xì)胞呈旋渦狀或放射狀排列。細(xì)胞從第5天開始增殖速度明顯加快，生長至大約第12天細(xì)胞融合可達(dá)70%～80%，細(xì)胞之間緊密相連，胞核清晰，呈典型鋪路石樣形態(tài)，見圖2A。

傳代細(xì)胞于24 h即可貼壁伸展，第3～4代細(xì)胞形態(tài)略大小不等，呈多角形或圓形，胞體飽滿，胞質(zhì)豐富，胞核清晰，可見明顯核仁，增殖速度較快，第7～8天細(xì)胞融合可達(dá)70%～80%，見圖2B。第5～6代細(xì)胞形態(tài)大小不等，胞體增大，胞質(zhì)顆粒增多，胞核較大，空泡化明顯，增殖速度較前減慢，約8～10 d細(xì)胞融合達(dá)70%左右，見圖2C。正常宮頸上皮細(xì)胞在體外可傳至5～6代，最終衰老從瓶底脫落。原代培養(yǎng)的正常宮頸細(xì)胞可進(jìn)行凍存及復(fù)蘇，細(xì)胞復(fù)蘇后可保持正常形態(tài)，見圖2D，且可繼續(xù)傳1～2代。

A：原代正常宮頸上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)12 d；B：第2次傳代的正常宮頸上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)7 d; C：第4次傳代的正常宮頸上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)9 d；D：正常凍存宮頸上皮細(xì)胞復(fù)蘇后7 d。圖2 正常宮頸上皮細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特征(×200)

2.5 宮頸上皮細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果 培養(yǎng)的原代細(xì)胞95%以上角蛋白染色陽性表達(dá)，見圖3。

A：抗廣譜角蛋白抗體染色；B：抗波形蛋白抗體染色。圖3 原代正常宮頸上皮細(xì)胞免疫細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果(×400)

2.6 兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的第2代細(xì)胞生長曲線 體積分?jǐn)?shù)5% FBS dK-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞增殖活性高于單獨(dú)dK-SFM培養(yǎng)基，見圖4。

A:體積分?jǐn)?shù)5%FBS dK-SFM培養(yǎng)基;B:dK-SFM培養(yǎng)基。圖4 兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的第2代細(xì)胞生長曲線

3 討論

既往研究[6]報道，單獨(dú)采用0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA分離法和單獨(dú)采用Ⅰ型膠原酶37 ℃消化40 min均能成功對正常宮頸上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，但分離的細(xì)胞純度及細(xì)胞量不令人滿意。作者也嘗試單獨(dú)采用0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA在不同的消化時間進(jìn)行消化分離，但所得宮頸上皮細(xì)胞密度低、活性差且不易貼壁，究其原因可能與胰蛋白酶可降解細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)，容易消化過度造成細(xì)胞損傷有關(guān)。中性蛋白酶消化不破壞表皮間的細(xì)胞連接，可完整地將上皮層從結(jié)締組織分離，保留基底層，從而減少具有增殖能力細(xì)胞的損傷[7]。所以該研究采用Ⅱ型中性蛋白酶聯(lián)合胰蛋白酶進(jìn)行消化分離，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶聯(lián)合法與單獨(dú)Ⅰ型膠原酶消化法相比，可完整分離上皮組織，消化所得上皮細(xì)胞純度較高，且隨上皮細(xì)胞的增長，纖維細(xì)胞逐漸減少，無需進(jìn)行特殊純化。中性蛋白酶聯(lián)合法分離成功率、所得細(xì)胞密度、原代細(xì)胞融合時間及細(xì)胞純度均高于單獨(dú)使用Ⅰ型膠原酶。曾有學(xué)者[8-10]報道，采用Ⅱ型中性蛋白酶聯(lián)合0.25 g/mL胰蛋白酶和0.01%Ⅰ型膠原酶的分離方法，但缺乏原代培養(yǎng)方法的具體消化時間點及具體步驟。作者對中性蛋白酶過夜消化的時間進(jìn)行反復(fù)摸索，最終選擇16、20和24 h 3個時間點，分別對其消化效果進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明中性蛋白酶消化20 h所得的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活力最佳，細(xì)胞達(dá)融合的時間最短。

報道[11]稱用3T3照射過的小鼠成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，其提供的生長因子可促進(jìn)上皮細(xì)胞的生長。后來，有研究[12]發(fā)明了無3T3照射細(xì)胞，含牛垂體浸膏且專用于宮頸上皮細(xì)胞培養(yǎng)的MCDB153培養(yǎng)基，直至目前進(jìn)一步改良的無血清KSFM培養(yǎng)基。KSFM培養(yǎng)基因無血清成分，可有效抑制成纖維細(xì)胞的生長，其添加的表皮生長因子(EGF)、牛腦垂體提取物(BPE)等能夠特異地促進(jìn)上皮細(xì)胞貼壁與生長，已廣泛應(yīng)用于各種類型上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)[13-15]。但是血清中所含有的某些營養(yǎng)成分又是人工無血清培養(yǎng)基無法替代的。因此，該研究選擇體積分?jǐn)?shù)5%FBS dK-SFM培養(yǎng)基與單獨(dú)dK-SFM培養(yǎng)基進(jìn)行比較，結(jié)果顯示前者細(xì)胞貼壁和增殖活性優(yōu)于單獨(dú)dK-SFM，且不至于導(dǎo)致纖維細(xì)胞的過度增長，與Liu等[6]的報道相似。且作者在細(xì)胞貼壁后采用含體積分?jǐn)?shù)5%FBS的dK-SFM進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng)，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定角蛋白表達(dá)陽性，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮細(xì)胞來源，并可判斷培養(yǎng)細(xì)胞的純度。采用此方法培養(yǎng)的原代細(xì)胞，第3～4代細(xì)胞形態(tài)最佳，增殖速度最快，而第5～6代的細(xì)胞逐漸老化、增殖緩慢，因此，建議采用第3～4代細(xì)胞進(jìn)行實驗。

由于宮頸在體內(nèi)處于半開放環(huán)境，而患者術(shù)前常伴有陰道細(xì)菌、真菌感染或者陰道出血病史，且原代培養(yǎng)操作步驟繁多，均大大增加了宮頸細(xì)胞原代培養(yǎng)污染的概率。該研究在培養(yǎng)期間出現(xiàn)過污染現(xiàn)象，推測很可能與高壓后的器械未及時烘干，導(dǎo)致器具污染、試劑污染或組織本身污染等有關(guān)。

總之，采用Ⅱ型中性蛋白酶聯(lián)合0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA分離細(xì)胞和體積分?jǐn)?shù)5%FBS dK-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代正常宮頸上皮細(xì)胞生長狀況最佳，可在體外增殖及傳至5～6代。

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(2016-09-23收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

An improved culture system for the primary culture of normal cervical epithelial cells

LIYa，RONGShouhua，ZHIYanfang，F(xiàn)ANTingting，QIUCui，LIXiaofu

DepartmentofCytopathology，theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

primary culture;cervical epithelial cell;dispase;dK-SFM

Aim: To explore an effective and repeatable method for the primary culture of normal cervical epithelial cells. Methods: A total of 60 normal human ectocervical tissue were collected and divided into two groups, primarily cultured using combined type Ⅱdispase and 0.25 g/mL trypsin-EDTA digestion method and type Ⅰ collagenase digestion method separately, and to compare the effectiveness of isolation, furthermore, to observe the detached effectiveness of combined dispase digestion method after digestion for different time. Cervical epithelial cells were cultured in 5% FBS dK-SFM and dK-SFM alone, respectively, to observe the growth of the primary cervical cells. The cultured cells were identified by the morphological analysis and pancytokeratin was identified by immunocytochemistry.Results: The total success rate of the primary culture in this study was 40%. The success rate, density, primary cell fusion time and purity of cells of the dispase digestion group were all higher than those of collagenase digestion group(P<0.05). The dispase digestion for 20 h was more effective than digestion for 16 and 24 h(P<0.05). The cell growth curve showed that the cells cultured in 5% FBS dK-SFM grew better and had a higher viability than cells cultured in dK-SFM alone(P<0.05). The primary cultured cells grew well and could be subcultured for five to six generations,and they also could be cryopreserved and resuscitated. Pancytokeratin positive staining was determined by immunocytochemistry. Conclusion: It is an effective and repeatable method for primary culture of normal cervical epithelial cells by using combined type Ⅱ dispase and 0.25 g/mL trypsin-EDTA digestion and 5% FBS dK-SFM medium.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.032

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃資助項目 201503112

R711.74