辣椒（Capsicum annuum L.）熱休克因子家族（CaHsfs）全基因組分析、表達(dá)譜分析及CaHsfA2的鑒定

Guo MengLu JinpingZhai YufeiChai WeiguoGong Zhenhui*Lu Minghui*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院， 陜西榆林 712100；2. 杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所， 浙江杭州 310024 ）

E-mail：zhgong@nwsuaf.edu.cn；xnjacklu@nwsuaf.edu.cn

辣椒（Capsicum annuum L.）熱休克因子家族（CaHsfs）全基因組分析、表達(dá)譜分析及CaHsfA2的鑒定

Guo Meng1Lu Jinping1Zhai Yufei1Chai Weiguo2Gong Zhenhui1*Lu Minghui1*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院， 陜西榆林 712100；2. 杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所， 浙江杭州 310024 ）

E-mail：zhgong@nwsuaf.edu.cn；xnjacklu@nwsuaf.edu.cn

背景：熱休克因子（Hsf）在植物生長和防御過程中具有重要作用。辣椒（Capsicum annuum L.）是重要的蔬菜作物，其產(chǎn)量和質(zhì)量受高溫、鹽漬及滲透脅迫等環(huán)境脅迫影響而嚴(yán)重降低。盡管辣椒基因組測序已經(jīng)完成，但Hsf家族在非生物脅迫條件下的作用尚不明確。結(jié)果：通過生物信息學(xué)分析及PCR檢測，在辣椒基因組中共鑒定出25個CaHsf。根據(jù)Hsf的保守結(jié)構(gòu)域，CaHsf可分為3類，分別是CaHsfA、CaHsfB和CaHsfC；除第11號染色體外，該家族基因在其他11條染色體上均有分布；除CaHsfA5外，該家族蛋白均能形成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。據(jù)辣椒栽培種CM334的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，大部分CaHsf基因在根、莖、葉、果皮、胎座等組織中不止一處表達(dá)。qRT-PCR表明，除耐熱株系R9葉片中的CaHsfC1外，所有CaHsf均響應(yīng)高溫脅迫（40℃，2 h）；且其表達(dá)模式與熱敏株系B6的CaHsf表達(dá)模式不同。許多CaHsf也受到鹽脅迫、滲透脅迫、外源Ca2+、腐胺、ABA和茉莉酮酸甲酯的調(diào)控。此外，CaHsfA2定位于細(xì)胞核，且具有轉(zhuǎn)錄活性，具有Hsf的典型特征。隨時間變化，CaHsfA2響應(yīng)高溫脅迫的表達(dá)譜表明，CaHsfA2在辣椒熱敏株系B6與耐熱株系R9中的表達(dá)模式與表達(dá)水平均不相同。結(jié)論： 從辣椒基因組中鑒定了25個Hsf，多數(shù)響應(yīng)高溫脅迫、鹽脅迫、滲透脅迫及外源物質(zhì)，為進(jìn)一步研究辣椒CaHsf在各非生物脅迫中的功能及相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑奠定了基礎(chǔ)。

辣椒；CaHsf家族鑒定；非生物脅迫；CaHsfA2；基因表達(dá)

1 背景

植物作為固著生物，形成了多種防御機制以抵御持續(xù)變化的脅迫因子，如極端溫度、鹽漬與干旱[1]等。溫度是影響作物生長發(fā)育的重要因子，高溫會顯著降低作物的產(chǎn)量和質(zhì)量[2-4]。Hsp與蟲咬傷害相關(guān)，且能使植物獲得耐熱性[5-6]；在高溫脅迫（HS）下，植物細(xì)胞能誘導(dǎo)熱激蛋白（Hsp）基因的表達(dá)以此對高溫迅速做出反應(yīng)。許多Hsp發(fā)揮分子伴侶的作用，以防止蛋白錯誤折疊與凝集，維持了細(xì)胞內(nèi)蛋白的穩(wěn)態(tài)，并使植物獲得耐熱性[7-9]。

熱休克因子（Hsf）通過識別Hsp基因啟動子區(qū)域內(nèi)的熱休克順式作用元件（HSE）來調(diào)節(jié)Hsp基因的表達(dá)[1,10]。HSE的特征是含有多個GAA反向重復(fù)序列，且真核生物基因中至少有3個HSE模體，以此保證Hsf的結(jié)合效率[11-12]。在非脅迫條件下，Hsf保持非活性狀態(tài)，并與Hsf90/Hsp70分子伴侶復(fù)合物形成細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物[8,13]。Hsf是細(xì)胞質(zhì)蛋白，在高溫脅迫下會從分子伴侶復(fù)合體脫離，經(jīng)磷酸化、泛素化、三聚反應(yīng)及核輸入后與靶基因的HSE結(jié)合[1,13-14]。Hsf家族結(jié)構(gòu)保守。除了序列和大小上具有較大差異外，Hsf家族的結(jié)構(gòu)和功能在所有真核生物間都是保守的[8,15]。植物中Hsf的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）高度保守，由N端1個反向平行的4鏈β折疊（β1、β2、β3和β4）和3螺旋束（α1、α2和α3）構(gòu)成，以滿足定位與識別HSE的要求[16-18]。寡聚合域（OD，或HR-A/B域）具有轉(zhuǎn)錄活性，與DBD通過由7個疏水氨基酸構(gòu)成的柔性鏈接結(jié)合在一起[19-21]。此外，一些Hsf中存在其他特殊結(jié)構(gòu)，如：核定位信號（NLS），由一簇堿性氨基酸組成，在核輸入過程起重要作用；核輸出信號（NES），富含亮氨酸；短肽模體（AHA模體），起催化作用；阻遏域，特征是C端4肽LFGV[1,22-24]。

不同真核生物的Hsf基因數(shù)量差異巨大。動物和酵母體內(nèi)的Hsf基因數(shù)量較少，果蠅（Drosophila melanogaster）、秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）只含有1個Hsf基因，脊椎動物有4個Hsf基因[25]。而植物恰恰相反，其體內(nèi)含有大量Hsf家族基因。其中，擬南芥（Arabidopsis thaliana）有24個，水稻（Oryza sativa）有25個，玉米（Zea mays）有30個，大豆（Glycine max）有52個，番茄（Solanum lycopersicum）[1]至少有24個；這表明在不同物種的植物中， Hsf可能具多種功能，并以此避免脅迫傷害[1,26]。根據(jù)HR-A/B域的特性，植物Hsf被分為三族，分別為A族、B族和C族[20]。

A族和C族Hsf含有延長的HR-A/B域，在HR-A和HR-B域之間分別有21和7個氨基酸；而B族Hsf的HR-A和HR-B域之間非常緊湊，沒有插入氨基酸[15,20]。此外，A族Hsf有AH激活結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含芳香族（W、F、Y）、疏水性（L、I、V）和酸性（D、E）氨基酸，而B族與C族Hsf沒有[24]。B族Hsf除HsfB5外，在C端均含有RD，可能作為阻遏模體，使HsfB具有阻遏物的功能[27-30]。而擬南芥HsfB1能對耐熱性獲得進(jìn)行正向調(diào)控[29]。這個矛盾有待進(jìn)一步研究闡明。

許多植物的Hsf基因已經(jīng)被分離出來并進(jìn)行了深入研究。擬南芥HafA1與HsfA2形成二聚的超級激活體協(xié)同激活靶基因[31]。盡管HsfB1和HsfB2b對高溫誘導(dǎo)Hsf的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用，但兩者對于植株耐熱性獲得是必不可少的[29]。番茄HsfA9在胚胎形成期和種子成熟期[32]上調(diào)表達(dá)；而HsfA5沒有活性，且抑制HsfA4的活性[1]。HsfA2能提高植物在多種非生物脅迫下的耐性，如HS[1]、鹽脅迫及滲透脅迫[33]、氧化脅迫[34]和缺氧脅迫[35]。番茄HsfA2能激活花藥在高溫脅迫下的保護(hù)機制，進(jìn)而保證高溫下的坐果[26,36]。

辣椒（Capsicum annuum L.）是一種重要的經(jīng)濟作物，對高溫十分敏感，但目前對辣椒耐熱分子機制的研究卻并不充分[37-38]。目前僅有擬南芥、水稻、玉米、小麥和大白菜等少數(shù)幾種模式植物中的Hsf基因家族被完全鑒定出來[8,20,39-41]。近年來，辣椒基因組測序結(jié)果的公布[42-43]為辣椒Hsf家族的鑒定奠定了基礎(chǔ)，也為研究其響應(yīng)各種脅迫的分子機制提供了資料。本研究利用生物信息學(xué)和表達(dá)分析對辣椒Hsf家族成員進(jìn)行了全基因組分析。經(jīng)生物信息學(xué)分析和PCR驗證，共有25個Hsf家族成員被鑒定出來，本研究對其基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、染色體定位、基因重復(fù)和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析。此外，我們也檢測了Hsf在不同組織和不同脅迫條件下的表達(dá)水平。本研究為辣椒Hsf基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)，同時也為其他物種的Hsf基因功能的研究提供了參考。

2 方法

2.1 鑒定和注釋甜辣椒（Capsicum annuum）Hsf家族成員

下載辣椒Hsf蛋白DBD保守結(jié)構(gòu)域蛋白序列（Pfam：PF00047），與辣椒基因組數(shù)據(jù)庫PGP中注釋的蛋白序列進(jìn)行BLAST比對（http://peppergenome.snu.ac.kr/，品種為CM334和Zunla-1），從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PTFD[44]下載擬南芥（Arabidopsis）、葡萄（Vitis vinifera）、毛果楊（Populus trichocarpa）全長Hsf蛋白序列與PGP和NCBI數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行BLAST比對。采用默認(rèn)參數(shù)（Limit Expect Value 1e-5）輸出數(shù)據(jù)，使用Pfam （http://pfam.xfam.org/search）和SMART（http:// smart. embl-heidelberg.de/）對數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證。使用DNAMAN軟件（Lynnon Biosoft, QC, Canada）對CM334和Zunla-1的候選Hsf基因進(jìn)行比對，挑出不屬于這2個品種的序列。使用Primer Premier 5.0軟件（Premier Biosoft International, CA, USA）設(shè)計引物（補充材料6，表S2），使用pI/MV軟件（http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html）預(yù)測蛋白的分子質(zhì)量和等電點。使用Heaster軟件（http:// www. cibiv.at/services/hsf/）對辣椒Hsf蛋白進(jìn)行分類。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用CLUSTALW軟件對辣椒、番茄和擬南芥的Hsf蛋白N端序列（從DBD保守結(jié)構(gòu)域到HR-A/B結(jié)構(gòu)域）進(jìn)行多序列比對，并使用MEGA 5.10軟件[45]將該結(jié)果構(gòu)建成系統(tǒng)進(jìn)化樹[1,41]。CLUSTALW軟件參數(shù)設(shè)置如下：gap open penalty為10；gap extension penalty為0.2；protein weight matrix為Gonnet；residue-specific gap penalties為on；hydrophilic penalties為on；gap separation distance為0；end gap separation penalty為on；use negative matrix為on；delay divergent cutoff（%）為30。系統(tǒng)發(fā)育樹參數(shù)為pairwise deletion，1000 bootstraps和a Poisson model。

2.3 辣椒Hsf蛋白序列分析和保守結(jié)構(gòu)域鑒定

使 用Gene Structure Display Server（GSDS，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）[46]， 將cDNA與其對應(yīng)的基因組DNA序列比對，區(qū)分Hsf基因的內(nèi)含子和外顯子并繪圖。使用MEME（http:// meme-suite.org/tools/meme）鑒定保守結(jié)構(gòu)域，參數(shù)如下：number of repetitions為any；maximum number of motifs為25；optimum motif widths為6 ～ 200 amino acid residues。使用Pfam（http://pfam.xfam. org/search）、SMART（http://smart.embl-heidelberg. de/）和Heatster在線工具對保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行注釋。

2.4 染色體定位與基因重復(fù)

根據(jù)PGP數(shù)據(jù)庫的信息，使用MapDraw[47]將基因比對到染色體上，并確定基因在染色體上的物理位置。使用植物基因重復(fù)數(shù)據(jù)庫（Plant Genome Duplication Database，PGDD，http://chibba.agtec. uga.edu/duplication/index/locus）鑒定辣椒Hsf的基因重復(fù)。非同義（Ka）與同義（Ks）比值（Ka/Ks）由辣椒Hsf基因的重復(fù)情況計算而來，其中Ks值以每年6.1×10-9位點的突變速率換算成以百萬年為單位的進(jìn)化時間，進(jìn)化時間（T）的計算公式為：T = Ks/ （2×6.1×10-9）×10-6百萬年[43,48]。

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測

由于沒有辣椒互作組的相關(guān)研究作為參考，本研究采用擬南芥同源蛋白預(yù)測CaHsf蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)。首先用CaHsf序列在INPARANOID（http://inparanoid.sbc.su.se/cgi-bin/index.cgi）[49]中搜索擬南芥同源序列。使用AraNet（http://www. functionalnet.org/aranet）獲得擬南芥同源蛋白（AtHsf）的邊緣信息文件（edge information）[50]，隨后將其繪制到CaHsf上以獲得CaHsf成員的邊緣信息文件。最后，使用Cytoscape_v3.2.1軟件（National Institute of General Medical Sciences，美國）繪制CaHsf的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

2.6 材料、培養(yǎng)條件及脅迫處理

本研究使用2個辣椒材料，分別為耐熱辣椒R9（引種自亞洲蔬菜研究與發(fā)展中心）和熱敏辣椒B6（由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院辣椒研究小組選育）。辣椒幼苗在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度26℃/20℃，光周期16 h / 8 h，培養(yǎng)至6 ～ 8片真葉后進(jìn)行處理。HS處理是將6 ～ 8真葉期的R9、B6辣椒苗置于40℃的光照培養(yǎng)箱中（GXZ-380C，江南儀器廠，中國）。在HS處理的0 h和2 h取葉片[37-38]。HS處理下CaHsfA2表達(dá)水平分析（圖8a）的取樣時間分別為HS處理的0 h、0.5 h、1 h、4 h、6 h，恢復(fù)處理 （溫度26℃/20℃，光周期16 h / 8 h）的2 h、4 h、24 h、48 h。對于其他處理，R9幼苗分別進(jìn)行鹽脅迫、滲透脅迫、ABA、茉莉酮酸甲酯（MeJA）、CaCl2和腐胺（Put）處理，具體處理為300 mM NaCl 6 h、5 %甘露醇6 h、100 μM ABA 3 h、100 μM MeJA 6 h、15 mM CaCl2 6 h和1.5 mM Put 6 h。MeJA使用10%乙醇溶解，其他試劑使用水溶解，MeJA處理的對照噴施10%乙醇，其余對照組噴水。NaCl和甘露醇處理取根和莖，其余處理取葉片，液氮速凍，于-80℃保存用于RNA提取。每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

2.7 RNA提取和實時熒光定量分析

使用Total RNA kit（BioTeke，中國）按照說明書的方法提取RNA，按說明書（Takara，中國）進(jìn)行cDNA合成，并使用ddH2O稀釋到50 ng/μL。用Primer Premier 5.0設(shè)計實時熒光定量反應(yīng)（qRTPCR）所需的辣椒Hsf基因C端引物對（補充材料7：表S3），并使用NCBI Primer BLAST（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_ LOC=BlastHome）驗證引物的合理性。以辣椒泛素結(jié)合蛋白基因UBI-3為內(nèi)參基因[51]。反應(yīng)體系20 μL：2 μL cDNA模板、上下游引物各0.8 μL（10 μM）、10 μL 2 ×SYBR Green Supermix（Takara，中國）及6.4 μL ddH2O。反應(yīng)于iQ5.0 Bio-Rad iCycler thermocycler（Bio-Rad，美國）中進(jìn)行。反應(yīng)程序：95℃ 1 min；95℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。每個循環(huán)后采集熒光信號，將PCR產(chǎn)物從56℃加熱到95℃，繪制溶解曲線，鑒定引物特性。qPCR設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)性重復(fù)，使用-ΔΔCT法計算Hsf基因的相對表達(dá)量[52]。

2.8 辣椒Hsf基因組織特異性表達(dá)分析

根據(jù)辣椒各組織基因表達(dá)譜RNA-seq數(shù)據(jù)[42]，本研究選擇了CM334 17個組織和發(fā)育階段的數(shù)據(jù)，對CaHsf基因的組織特性表達(dá)和各發(fā)育時期的表達(dá)情況進(jìn)行分析。組織有根、莖、葉，花后6、16、25 d的果皮和胎座（PC-6DPA、PC-16DPA、PC-25DPA，PL-6DPA、PL-16DPA、PL-25DPA），綠熟期的果皮和胎座（PC-MG、PL-MG），破色期的果皮和胎座（PC-B、PL-B），破色5 d、10 d的果皮和胎座（PC-B5、PC-B10，PL-B5、PL-B10）。使用Heml軟件（The Cuckoo Workgroup，中國）制作22個Hsf基因數(shù)據(jù)（除缺失的CaHsfA1e、CaHsfB3b和CaHsfB4）的熱圖。

2.9 CaHsfA2的細(xì)胞定位

根據(jù)之前的研究[37]，以HS處理2 h的R9葉片cDNA為模板，設(shè)計引物（前引物5’-GCTCTAGAT CCATCTTAATTGTATTTAGCGAC-3’，后引物5’-C GGGGTACCAAGGAAACCAAGTT GATCTACA AG-3’）PCR獲得CaHsfA2不含終止密碼子的ORF。劃線的堿基分別表示XbaI和KpnI酶切位點。將PCR獲得的CaHsfA2片段與pBI221融合構(gòu)建表達(dá)載體，以不含CaHsfA2的CaMV35S::GFP（pBI221）載體為對照。使用Bio-Rad He/1000 particle delivery system（Bio-Rad, Hercules，美國）分別將5 μg CaMV35S::CaHsfA2-GFP和5 μg CaMV35S::GFP轉(zhuǎn)入洋蔥（Allium cepa）表皮細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞置于1×MS固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h后，使用A1R激光共聚焦顯微鏡（Nikon，日本）觀察綠色熒光蛋白。

2.10 CaHsfA2轉(zhuǎn)錄激活鑒定

轉(zhuǎn)錄激活鑒定使用酵母AH109菌株，該菌株含LacZ和His報告基因。設(shè)計引物（前引物5'-TCCATCTTAATTGTATTTAGCGAC-3'，后引物5'-AGGGAATGATAGAGTCGTGGG-3'）擴增全長CaHsfA2基因。將PCR產(chǎn)物重組到pMD19-T載體（Takara，中國），片段5’末端與Pmd19-T的SmaI位點連接，3’末端與PstI位點連接；測序正確后，使用限制內(nèi)切酶SmaI和PstI進(jìn)行酶切，將回收片段重組到pGBKT7載體上，構(gòu)建pGBKT7-CaHsfA2重組載體。按照說明書（Clontech，美國）分別將pGBKT7-CaHsfA2和陰性對照pGBKT7轉(zhuǎn)入酵母AH19中。重組菌株經(jīng)PCR和測序鑒定后，在SD/ Trp-和SD/Trp-Ade-His-平板上培養(yǎng)。30℃培養(yǎng)3 d后，根據(jù)酵母在含X-α-gal培養(yǎng)基上的生長情況判斷基因的轉(zhuǎn)錄活性。

2.11 數(shù)據(jù)獲取

本研究的系統(tǒng)進(jìn)化數(shù)據(jù)可從TreeBase（http:// purl.org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S17530）下載，編號為17530。RNA-seq數(shù)據(jù)可從辣椒品種CM334基因組下載（http://www.nature.com/ ng/journal/v46/n3/full/ng.2877.html#supplementaryinformation）[42]。

3 結(jié)果

3.1 辣椒Hsf基因家族的鑒定

以Hsf DBD結(jié)構(gòu)域（Pfam：PF00447，http:// pfam.sanger.ac.uk/）的隱馬爾科夫模型（HMM）作為BLAST序列在辣椒基因組數(shù)據(jù)庫PGP（http:// peppergenome.snu.ac.kr/）中比對搜索；同時PTFD（Plant Transcription Factor Data-base, http://plntfdb. bio.uni-potsdam.de/v3.0/）中的擬南芥、葡萄和毛果楊的Hsf蛋白也作為BLAST序列在PGP中比對搜索。最初從辣椒栽培品種CM334中共得到了26個Hsf候選基因，將其與栽培品種Zunla-1基因組對應(yīng)的基因進(jìn)行比對，將與之不同的序列再次放大并糾正對應(yīng)的辣椒Hsf基因。經(jīng)Pfam、SMART（http:// smart.embl-heidelberg.de/）和Heatster（http://www. cibiv.at/services/hsf/）分析發(fā)現(xiàn)，一個候選基因（基因ID：CA01g30350）缺乏完整的DBD結(jié)構(gòu)域，因此將其從候選基因中排除。最終從辣椒中共鑒定出25個Hsf基因（表1），其分類和命名規(guī)則參照擬南芥和番茄的Hsf家族基因[1]。CaHsf家族的CDS序列小到606 bp （CaHsfB5），大到1 518 bp （CaHsfAlb），蛋白序列分別有201個和505個氨基酸，分子質(zhì)量分別為23.37 kDa和56.06 kDa。CaHsf蛋白家族的等電點差異較大，25個成員的等電點從4.65到9.20不等，其中17個成員屬于A族（CaHsfAs），7個屬于B族（CaHsfBs），只有1個屬于C族（CaHsfCs）。CaHsfA族中，CaHsfA9（4個成員，CaHsfA9a、 CaHsfAb、CaHsfAc和CaHsfAd）、CaHsfA1（3個成員， CaHsfA1b、CaHsfAd和CaHsfAe）、CaHsfA6 （3個成員， CaHsfA4a、CaHsfAb和CaHsfAc）較其他亞族更長。

表1 CaHsf家族成員

3.2 辣椒Hsf蛋白保守結(jié)構(gòu)域的鑒定

采用MEME在線工具（http://meme-suite. org/tools/meme）分析鑒定辣椒CaHsf蛋白的保守模體結(jié)構(gòu)（圖1、表2）。辣椒25個Hsf家族成員中均含有模體1和模體3，CaHsfA5缺乏模體2，CaHsfC1缺乏模體5。一些模體只在特定的Hsf蛋白中存在，如模體4僅存在于CaHsfA族和CaHsfC族中，而CaHsfB族中沒有。通常，CaHsfB族中的模體數(shù)量少于CaHsfA族。

為充分了解CaHsf家族的結(jié)構(gòu)特征，本研究采用Heatster軟件分析了CaHsfs的保守結(jié)構(gòu)域（表3）。從3類CaHsf中鑒定出6個保守結(jié)構(gòu)域，分別為DBD、HR-A/B、NLS、AHA、RD和 NES。DBD與模體1一致，與模體2、模體3部分一致（圖1），是Hsfs中最為保守的序列，在25個CaHsf蛋白中均有發(fā)現(xiàn)（補充材料1：圖S1）。

DBD由3個α螺旋（α1、α2和α3）和4個β折疊（β1、β2、β3和β4）構(gòu)成，CaHsfA5中不含α1，且β1不完整，因此其序列較其他的CaHsf蛋白更短。除DBD外，HR-A/B是另外一個核心保守結(jié)構(gòu)域，同樣在所有CaHsf蛋白中存在，其他的4個保守結(jié)構(gòu)域只存在于特定的CaHsf中。CaHsfA族中，17個蛋白均具有NLS結(jié)構(gòu)域。CaHsfA9的NLS結(jié)構(gòu)域最長（57 ～ 248個氨基酸），覆蓋了DBD和HR-A/B結(jié)構(gòu)域；而CaHsfA9b、CaHsfA9c和CaHsfA9d的NLS結(jié)構(gòu)域最短，僅有2個氨基酸。AHA是CaHsfA族蛋白特有的結(jié)構(gòu)域，在CaHsfA2中有3個，在CaHsfA3中有4個，但在CaHsfA9b中沒有。對于CaHsfB族蛋白而言，CaHsfB1和CaHsfB5不含NLS結(jié)構(gòu)域；而CaHsfB3a與CaHsfA9a相似，含有較長的NLS序列（從第10到第218個氨基酸）并覆蓋了DBD和HR-A/B序列。LFGV是RD的核心結(jié)構(gòu)，為4肽模體，除CaHsfB5外，在所有CaHsfB族蛋白中均存在，但只有CaHsfB4含NES結(jié)構(gòu)域。有意思的是，在CaHsfC1中只有2個結(jié)構(gòu)域BDD和HR-A/B。

圖1 使用MEME軟件鑒定的辣椒Hsf蛋白模體

3.3 辣椒Hsf蛋白的進(jìn)化分析及序列結(jié)構(gòu)分析

表2 使用MEME鑒定的模體序列

為研究Hsf家族的進(jìn)化關(guān)系，取各物種Hsf的保守氨基酸序列（從DBD第1個氨基酸到HR-A/B最后1個氨基酸）繪制進(jìn)化樹[1,41]，其中辣椒的Hsf蛋白25個，擬南芥21個，番茄（S. lycopersicum）25個，玉米（Z. mais）21個，水稻（O. sativa）25個（圖2）。Hsf蛋白構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，HsfA族的亞族最多，共有5個集群，其中有4個集群（A1和A8、A2和A6、A3和A7、A9）與HsfC族相似，1個集群（A4和A5）與HsfA相似。擬南芥2個HsfA7蛋白（AT3G51910.1和AT3G63350.1）沒有與其他物種的HsfA7蛋白聚類到一起，而是與HsfA6蛋白相似。同樣的情況也出現(xiàn)在玉米HsfA7亞族蛋白ZM2G005815、玉米HsfA8亞族蛋白ZM2G118485、水稻HsfB4亞族蛋白Os07g44690.1和辣椒CaHsfAc上，它們分別與HsfB2亞族、HsfA4亞族、HsfA2亞族和HsfA1亞族相似。與擬南芥相比，玉米、水稻和番茄的Hsf蛋白與辣椒的Hsf蛋白更為接近，這個結(jié)果與植物學(xué)分類結(jié)果相一致。

表3 辣椒中CaHsf蛋白的功能結(jié)構(gòu)域

此外我們也繪制了辣椒Hsf蛋白保守結(jié)構(gòu)域（從DBD域到HR-A/B域）的進(jìn)化樹（補充材料2：圖S2A），其模體分布（圖1，表2）和系統(tǒng)發(fā)育組（圖2）的特征與前文提到的結(jié)果相一致。本研究通過編碼序列和對應(yīng)的基因組序列，分析了辣椒25個Hsf蛋白內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)，以期進(jìn)一步了解該家族基因的重復(fù)事件和進(jìn)化模式。CaHsf家族的內(nèi)含子和外顯子在結(jié)構(gòu)上高度保守，含一個內(nèi)含子，內(nèi)含子相位為0（補充材料2：圖S2B）。其中，15個CaHsf蛋白的內(nèi)含子位于DBD域內(nèi)；4個蛋白的內(nèi)含子位于NLS域和AHA域之間；CaHsfA4a和CaHsfA4b的內(nèi)含子位于AHA1域和AHA2域之間。內(nèi)含子長度在77 bp （CaHsfB2a） ～ 3 205 bp（CaHsfA5）之間。

圖2 辣椒、番茄、擬南芥、水稻和玉米的Hsf蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

3.4 染色體定位與辣椒基因組中Hsf基因的重復(fù)

本研究根據(jù)辣椒基因組數(shù)據(jù)庫PGP中CaHsf的物理位置，確定了CaHsf的染色體分布。辣椒有12條染色體，其中在11條染色體上定位了Hsf基因，在11號染色體上沒有Hsf基因（補充材料3：圖S3）。每條染色體上，CaHsf基因的數(shù)量差異顯著。2號染色體上的CaHsf基因數(shù)量最多，共5個；3號染色體上有4個CaHsf基因；9號染色體上有3個CaHsf基因；1號、4號、6號、7號和12號染色體上分別有2個CaHsf基因；5號、8號和10號染色體上只有1個CaHsf基因。

植物基因組重復(fù)數(shù)據(jù)庫（PGDD，http:// chibba.agtec.uga.edu/duplication/）對植物基因重復(fù)數(shù)據(jù)庫PGDD的分析表明，有兩對辣椒Hsf蛋白CaHsfA4a/CaHsfA4c和CaHsfB3a/CaHsfB3b是部分重復(fù)序列（補充材料3：圖S3；補充材料4：表S1），且每對基因的2個重復(fù)序列都在不同的染色體上（分別在2號、4號染色體，5號、10號染色體上）。2對重復(fù)序列的非同義替代（Ka）與同義替代（Ks）之比（Ka/Ks）小于1.0，表明純化選擇導(dǎo)致了序列的進(jìn)化，且重復(fù)事件分別發(fā)生在4590萬年前（CaHsfA4a/CaHsfA4c）和7131萬年前（CaHsfB3a/ CaHsfB3b）[43,48]。

3.5 CaHsf家族的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

本研究根據(jù)擬南芥同源互作組預(yù)測了CaHsf家族的互作網(wǎng)絡(luò)，以期為CaHsf家族的研究提供更多的信息。除CaHsfA5外，所有的CaHsf蛋白均形成復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)（補充材料5：圖S4）。CaHsfA5的擬南芥同源蛋白AtHsfA5和At4g13980在擬南芥中也沒有Hsf互作蛋白。CaHsFA族中，CaHsFA2、CaHsFA3、CaHsFA6（CaHsFA6a、CaHsFA6b、和CaHsFA6c）能和多數(shù)CaHsf蛋白互作，且CaHsfA1亞族3個蛋白（CaHsfA1b、CaHsfA1d和CaHsfA1e）彼此之間能產(chǎn)生互作。與CaHsfA亞族和其他CaHsfB亞族蛋白相比，CaHsfB亞族的CaHsfB1、CaHsfB3a和CaHsfB3b的互作網(wǎng)絡(luò)更為簡單，各有9個、6個和6個互作蛋白，且不會與CaHsfA2、CaHsfA1和CaHsfA6亞族蛋白互作?？偟膩碚f，CaHsfA亞族蛋白的互作蛋白多于CaHsfB亞族和CaHsfC亞族。

3.6 CaHsf基因在不同器官和不同發(fā)育時期的表達(dá)分析

為研究CaHsf基因在辣椒生長發(fā)育中的功能，本研究以辣椒CM334為材料，分別檢測了CaHsf家族在5個不同組織的表達(dá)水平，以及CaHsf家族在果皮和胎座7個發(fā)育時期的表達(dá)水平，并根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)繪制了熱圖（圖3）。不同CaHsf基因在不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)水平具有顯著差異。在CaHsfA亞族中，CaHsfA2、CaHsfA6a和CaHsfA9a的表達(dá)水平相對較高；而CaHsfA4c、CaHsfA6b、CaHsfA9b和CaHsfA9c在所有組織中的表達(dá)水平相對較低，甚至為0；其余的CaHsfA基因在某些組織中的表達(dá)水平較高。如CaHsfA4b在根部、PL-6DPA（花后6 d的胎座）和PL-16DPA（花后16 d的胎座）的表達(dá)量高于其他組織，但在PL-B10（花后10 d的胎座）中幾乎沒有表達(dá)。CaHsfA2、CaHsfA6a和CaHsfA9a在生殖器官的表達(dá)量相對較高，如PL-B（破色期胎座）中的CaHsfA2，PC-MG和PL-MG（綠熟期的果皮和胎座）中的CaHsfA6a，以及PC-B10（破色10 d的果皮）中CaHsfA9a。CaHsfB1在所有組織中的表達(dá)水平均較高，在PL（包括PL-16DPA、PL-25DPA、PL-MG和PL-B）的表達(dá)水平尤其高。相比之下，CaHsfB2b在PC-B（破色期的果皮）和PC-B5的表達(dá)量最低，在其他組織中幾乎沒有表達(dá)。較其他組織和PL其他發(fā)育時期，CaHsfB3a在PL-16DPA的表達(dá)量較高?？v觀營養(yǎng)器官和生殖器官，CaHsfC1表達(dá)量最高處在葉片和PL-B5，表達(dá)量最低處在PL-B。

圖3 辣椒Hsf基因組織特異性表達(dá)分析

3.7 HS處理下CaHsf基因的表達(dá)分析

圖4 qRT-PCR分析HS處理下B6和R9葉片中CaHsf相關(guān)基因的表達(dá)水平

為研究CaHsf的熱響應(yīng)曲線，本試驗以熱敏株系B6和耐熱株系R9為材料，分別檢測了植株在HS條件（40℃，12 h）下葉片中CaHsf的轉(zhuǎn)錄水平[37-38]。如圖4所示，高溫脅迫下R9的葉片中有22個CaHsf基因上調(diào)表達(dá)（＞2倍），占總數(shù)的88%；2個CaHsf基因（CaHsfB3a和CaHsfB3b）下調(diào)表達(dá)（＜0.5倍）；而CaHsfC1的表達(dá)無顯著變化。在上調(diào)表達(dá)的基因中，CaHsfA2、CaHsfA3、CaHsfA6c、CaHsfB1和CaHsfB5的表達(dá)水平顯著高于其他基因，且表達(dá)量升高最多的是CaHsfA3（＞140倍），其次是CaHsfA2（＞20倍）。與其他亞族 相 比，CaHsfA1亞 族（CaHsfA1b、CaHsfA1d和CaHsfA1e）的表達(dá)并不顯著。2對重復(fù)基因（CaHsfA4a、CaHsfA4c；CaHsfB3a、CaHsfB3b）在HS處理下表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。在熱敏株系B6中，只有13個基因上調(diào)表達(dá)，占總數(shù)的52%；表達(dá)水平維持穩(wěn)定的基因有10個，比株系R9多。HS處理下的B6株系中，CaHsfA1d、CaHsfA2和CaHsfA3的表達(dá)受顯著誘導(dǎo)；熱敏株系B6和耐熱株系R9中的CaHsfA2和CaHsfA3基因?qū)S的響應(yīng)都非常強烈（圖4）。

3.8 CaHsf基因響應(yīng)鹽脅迫和滲透脅迫的表達(dá)譜

眾所周知，Hsf與植物的耐熱馴化相關(guān)，但其他不利因素如鹽和滲透脅迫同樣會影響植物的生長發(fā)育，CaHsf基因是否與這些逆境相關(guān)有待探究。因此我們設(shè)計試驗，分別使用300 mM NaCl和5%甘露醇處理R9株系的根和莖6 h，并得到CaHsf基因的表達(dá)譜。

學(xué)院堅持創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育工作“一把手”工程，成立由學(xué)院院長擔(dān)任組長，分管教學(xué)、學(xué)工和科研的副院長擔(dān)任副組長，藍(lán)島創(chuàng)客空間、教務(wù)處、學(xué)工處、科研及校企合作處、人事處、五系、繼續(xù)教育學(xué)院相關(guān)負(fù)責(zé)人為成員的創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育工作領(lǐng)導(dǎo)小組，形成齊抓共管的聯(lián)動協(xié)調(diào)機制，確?！半p創(chuàng)教育試點班”人才培養(yǎng)計劃的落實。

鹽處理下，根和莖中6個基因（CaHsfA1b、CaHsfA3、CaHsfA9a、CaHsfA9c和CaHsfC1） 上調(diào)表達(dá)，而CaHsfA2、CaHsfA6c和CaHsfB4下調(diào)表達(dá)（圖5）。根和莖中5個基因（CaHsfA1d、CaHsfA4b、CaHsfA8、CaHsfB2b和CaHsfB3a）的表達(dá)水平未受到調(diào)控，其余11個基因在根或莖中的表達(dá)水平只是有所變化。此外， aHsfA1e、CaHsfA4c和CaHsfB1在根中受誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，而在莖中不受誘導(dǎo)；CaHsfA4a、CaHsfA5、CaHsfA6b和CaHsfB1只在莖中大量表達(dá)。有意思的是，CaHsfA9中CaHsfA9d在根中的表達(dá)水平顯著升高（＞30倍），而CaHsfA9a在莖中的表達(dá)受到顯著誘導(dǎo)（約40倍）。

滲透脅迫下，9個基因（CaHsfA1b、CaHsfA1d、CaHsfA4a、CaHsfA6a、CaHsfA9a、CaHsfA9d、CaHsfB3a、CaHsfB3b和CaHsfB5）上調(diào)表達(dá)，其 中4個（CaHsfA4c、CaHsfA8、CaHsfA9b和CaHsfB4）在根和莖中均上調(diào)表達(dá)，根中表達(dá)量最高的是CaHsfA9（＞160倍），莖中表達(dá)量最高的是CaHsfB3b（約46倍）。根和莖中沒有基因下調(diào)表達(dá)。值得注意的是，根和莖中的CaHsfA1b、CaHsfA9a和CaHsfA9d都能受鹽脅迫和滲透脅迫的誘導(dǎo)，尤其是CaHsfA9d。

3.9 外源ABA、MeJA、腐胺（Put）和CaCl2處理下CaHsf基因的表達(dá)譜

植物激素和信號分子如ABA、MeJA、Put和Ca2+參與多種脅迫信號途徑[6,38,53]。為研究CaHsf家族基因是否響應(yīng)這些信號物質(zhì)，本研究以R9植株葉片為材料，分析了在這些外源物質(zhì)處理下CaHsf家族基因的表達(dá)譜。如圖5所示，CaCl2處理后13個CaHsf基因顯著地上調(diào)表達(dá)，而12個基因下調(diào)表達(dá)。Put處理后，11個CaHsf基因上調(diào)表達(dá)，沒有基因下調(diào)表達(dá)。25個CaHsf基因中，受ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因有5個，下調(diào)表達(dá)的基因有7個；受MeJA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因有4個，下調(diào)表達(dá)的基因有9個。

圖5 qRT-PCR分析多種非生物脅迫下R9植株中CaHsf基因轉(zhuǎn)錄水平

CaHsfB1可以受4種信號物質(zhì)的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；而CaHsfA9a和CaHsfA9b受CaCl2、Put和ABA的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，受MeJA的誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)。此外，CaHsfA6a受CaCl2和Put的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，受ABA和MeJA的誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)。受CaCl2、Put和MeJA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)最多的分別是CaHsfA9d、CaHsfA9a和CaHsfA1d；但是經(jīng)ABA處理后，CaHsf的轉(zhuǎn)錄水平不如其他3個處理高。經(jīng)ABA處理后，CaHsfB1最高的表達(dá)水平較對照升高不足5倍。

3.10 CaHsfA2定位于細(xì)胞核

由于CaHsfA2在耐熱細(xì)胞[1]中具有重要作用，且其表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖4），因此進(jìn)一步研究辣椒的CaHsfA2。為驗證CaHsfA2是否定位于細(xì)胞核，本研究采用瞬時表達(dá)體系，構(gòu)建35S::CaHsfA2-GFP（pBI221-CaHsfA2-GFP）融合表達(dá)載體，使用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞。使用空載35S::GFP（pBI221-GFP）轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上均有綠色熒光表達(dá)情況。而使用融合蛋白表達(dá)載體35S::CaHsfA2-GFP轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞僅在細(xì)胞核有熒光信號，表明CaHsfA2定位于細(xì)胞核中（圖6）。3.11 CaHsfA2具有轉(zhuǎn)錄活性

圖6 CaHsfA2-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞的瞬時表達(dá)

3.12 CaHsfA2在2個耐熱性不同的辣椒株系中對HS的響應(yīng)具有差異

為進(jìn)一步研究CaHsfA2對HS的響應(yīng)，本研究分析了在HS條件下和室溫恢復(fù)階段該基因分別在熱敏株系B6和耐熱株系R9中的表達(dá)情況（圖8a）。40℃處理0.5 h后，B6和R9的CaHsfA2均上調(diào)表達(dá)（圖8b，樣品b）；而在HS處理最后階段，即40℃處理6 h時，R9葉片中CaHsfA2的表達(dá)水平與對照相比處于高位，約為40倍（圖8b，樣品a）。幼苗經(jīng)熱處理后，將其移至室溫恢復(fù)處理48 h，恢復(fù)初期（2 h至4 h）R9中的CaHsfA2表達(dá)水平維持高位，而在恢復(fù)一段時間后（24 h至48 h）R9和B6的CaHsfA2表達(dá)水平均降低（圖8b，樣品h和樣品i）。值得注意的是，R9經(jīng)HS處理4 h后，CaHsfA2的表達(dá)水平（樣品d）低于HS處理1 h后的表達(dá)水平（樣品c），且B6 CaHsfA2的表達(dá)水平在HS處理的最后階段有輕微下降（樣品c）。

圖7 CaHsfA2蛋白在酵母中的反式作用活性

圖8 HS處理下辣椒CaHsfA2的表達(dá)水平

4 討論

越來越多的證據(jù)表明，Hsf在植物生長和防御過程中具有重要作用[5,12,14,31-32,36,54]。得益于基因組學(xué)的進(jìn)步，多種植物的Hsf家族基因得到了鑒定，包括模式植物擬南芥[20,55]、玉米[8]、水稻[39]，以及其他作物如龍須菜[56]、大白菜[40]和蘋果[57]。然而，由于目前對耐熱的分子機制了解甚微，因此辣椒Hsf的功能尚不明確。

本研究根據(jù)辣椒基因組，從營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值較為重要的辣椒中鑒定出了25個Hsf基因[42,58]（表1）。雖然辣椒的Hsf基因的數(shù)量與擬南芥、番茄相似[1]，但辣椒一些特殊Hsf亞族與以上兩個物種有較大差異。例如與番茄相比，辣椒的HsfA1亞族成員較少，HsfA6亞族成員較多，沒有HsfA7亞族，表明辣椒在進(jìn)化過程中發(fā)生了基因丟失[39]。另一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，辣椒的CaHsfA9亞族發(fā)生了擴張，有4個基因，而番茄該亞族只有1個基因。通常真雙子葉植物中只有1個HsfA9基因，如擬南芥和番茄，而大豆中有2個，巨尾桉（桃金娘科）至少含有17個與HsfA9編碼基因密切相關(guān)的基因[1]。CaHsfA9基因數(shù)量增加的原因有待進(jìn)一步研究。

Hsf蛋白的DBD結(jié)構(gòu)域長度約由100個氨基酸組成，在酵母、哺乳動物和植物中高度保守[18]；而辣椒CaHsfA5的DBD結(jié)構(gòu)域僅72個氨基酸，比其他CaHsf蛋白的DBD短，原因是缺少1個完整的α1螺旋和1個截短的β1折疊。但CaHsfA5 DBD中的核心元件α2-turn-α3和截短β1折疊中的色氨酸是完整的，α2-turn-α3的功能是與HSE產(chǎn)生互作，色氨酸主要構(gòu)成芳香族互作[59]，這使得CaHsfA5蛋白具有基本的功能，但其不完整的DBD需要進(jìn)一步的鑒定。AHA是HsfA亞族[1]中重要的結(jié)構(gòu)域，具有激活功能，而有趣的是CaHsfA9b和CaHsfA9d中均不含該結(jié)構(gòu)域（表3）。缺失AHA結(jié)構(gòu)域的Hsf蛋白能利用色氨酸殘基來改變激活子的功能，或與其他Hsf蛋白形成異源二聚體來行使功能[39,60]。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，與擬南芥、玉米、水稻和番茄相比，辣椒Hsf蛋白與番茄的Hsf蛋白同源性更高（圖2），這與植物學(xué)分類的結(jié)果相一致[42]。辣椒HsfA9亞族中的4個蛋白（CaHsfA9a、CaHsfA9b、CaHsfA9c和CaHsfA9d） 與3個 番 茄 蛋 白（Sl07g040680、Sl02g072060和Sl11g008410） 聚類在了HsfA9亞族。番茄HsfA9亞族中，只有1個蛋白屬于Hsf9A亞族，其他2個蛋白Sl02g072060和 Sl11g008410屬于類Hsf蛋白（Hsf ），分別為Hsf 1和Hsf 2[1]。單子葉植物的基因重復(fù)導(dǎo)致了HsfC2的產(chǎn)生，該蛋白成為了單子葉植物特有的蛋白[1,41]，雙子葉植物不含HsfC2蛋白，這是單子葉植物與雙子葉植物間最顯著的不同。單子葉植物中沒有HsfA9、HsfB3和HsfB5，這些蛋白可能產(chǎn)生在單、雙子葉植物的分化之后[1]（圖2）。結(jié)構(gòu)分析表明，所有的CaHsf基因都只有1個內(nèi)含子（補充材料2，圖S2B），這表明其進(jìn)化是保守的；而各基因插入內(nèi)含子長度不同，這可能影響CaHsf基因功能的分化。

辣椒共有12條染色體，除11號染色體外，其余11條染色體上均有CaHsf基因分布。番茄的1號和5號染色體同樣缺失Hsf基因，表明Hsf基因在茄科植物共同祖先的基因組上廣泛分布?；蛑貜?fù)是幫助植物適應(yīng)各種環(huán)境脅迫的主要進(jìn)化機制[43]。水稻、玉米和蘋果有多對旁系同源Hsf基因，各有9對[39]、9對[8]和12對[57]；而辣椒中較少，僅有2對，分別為CaHsfA4a/CaHsfA4c和CaHsfB3a/ CaHsfB3b。4個基因分布于不同的染色體。旁系同源基因起源于染色體間的部分重復(fù)，CaHsfA4a/ CaHsfA4c和CaHsfB3a/CaHsfB3b的產(chǎn)生分別發(fā)生在4590萬年前和7131萬年前。由于多數(shù)多倍體植物的基因組中含有大量重復(fù)的染色體片段，因此部分重復(fù)發(fā)生的幾率明顯大于串聯(lián)重復(fù)和易位[43,61]。部分重復(fù)在進(jìn)化緩慢的基因家族中頻繁發(fā)生[61]，且在家族進(jìn)化中具有重要作用，據(jù)此推測辣椒Hsf家族基因進(jìn)化的速度與玉米Hsf家族基因進(jìn)化的速度一樣緩慢[8]。

植物的生命活動是由于蛋白間的互作。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)能夠為生命活動機制的解析和未知蛋白生物功能的研究提供重要參考。本研究根據(jù)擬南芥同源蛋白，構(gòu)建了CaHsf蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)（補充材料5，圖S4）。在3個CaHsf族中，CaHsfA的互作蛋白最多，表明CaHsfA作為主要調(diào)節(jié)因子可能具有特殊功能，是植物在極端HS條件下生存必不可少的蛋白[1,26]。在復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)中，擬南芥的CaHsfA1（CaHsfA1b、CaHsfA1d和CaHsfA1e）與CaHsfA2互作，這些蛋白協(xié)同形成超級激活復(fù)合體，顯著調(diào)節(jié)下游的HS相關(guān)基因的表達(dá)[31]。與擬南芥同源的CaHsfA5（AtHsfA5）雖然沒有參與復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)，卻與抗凋亡因子AtHsfA4互作并抑制其活性[62]，表現(xiàn)出促凋亡的作用。在辣椒中CaHsfA5可能具有相似的功能，但結(jié)果有待進(jìn)一步研究。

基因的表達(dá)模式與其功能密切相關(guān)[39]。我們研究了CaHsf基因在5個不同組織中的表達(dá)譜。正常條件下，CaHsfA2、CaHsfA6a、CaHsfA9a和CaHsfB1在不同組織不同發(fā)育階段的表達(dá)水平相對較高（圖3）。其他植物中具有類似的現(xiàn)象，如擬南芥的AtHsfA1型基因[63]，蘋果的MdHsfA1a、MdHsfA1d、MdHsfB1a和MdHsfB1b基因[57]，小麥的HsfA1、HsfA8亞族基因，以及部分HsfA2、HsfA6亞族基因[41]。不同組織和生育期的表達(dá)譜顯示大量辣椒CaHsf家族成員存在組織表達(dá)特異性和時期表達(dá)特異性，如根部的CaHsfA1b，PL-16DPA的CaHsfB3a，PC-B10的CaHsfB5，及葉片和PL-B5的CaHsfC1；這表明CaHsf基因家族廣泛地參與了植物的生長發(fā)育，這對于研究CaHsf基因在辣椒發(fā)育生物學(xué)中的功能具有重要作用[64]。

HS條件下，多數(shù)CaHsf基因上調(diào)表達(dá)。CaHsfAd、CaHsfA2、CaHsfA3、CaHsfA6c和CaHsfB5是B6和R9中在HS條件下表達(dá)水平顯著升高的基因，表明這些CaHsf蛋白是Hsp基因的主要轉(zhuǎn)錄因子[41]（圖4）。番茄是辣椒的近親，其體內(nèi)的HsfA1a是引發(fā)高溫響應(yīng)和獲得高溫耐性的主效調(diào)控因子，且無法被其他Hsf蛋白代替[26]。耐熱株系R9的CaHsfA族中，CaHsfA1亞族的3個基因（CaHsfA1b、CaHsfA1d和CaHsfA1e）與CaHsfA2、CaHsfA3和CaHsfA6c相比表達(dá)并不顯著；與之類似的是，在擬南芥的4個HsfA1基因中也沒有主效調(diào)控因子[1]。該結(jié)果表明，在調(diào)控植物HS反應(yīng)時，Hsf蛋白的作用具有種間差異。HS條件下，株系R9中上調(diào)表達(dá)的CaHsfA基因有17個，株系B6中只有10個，CaHsfA2、CaHsfA3、CaHsfA6c、CaHsfB1和CaHsfB5在R9中的表達(dá)量高于B6，而CaHsfA1d在B6中的表達(dá)量高于R9。這些表達(dá)量同時升高的CaHsfA基因可能共同作用于下游的HS相關(guān)基因，進(jìn)而提高辣椒的耐熱性。

HS條件下，株系R9葉片7個CaHsfB族基因中有5個顯著上調(diào)，尤其是CaHsfB1和CaHsfB5，結(jié)果與小麥中的HsfB1和HsfB2一致[41]。除HsfB5外，多數(shù)HsfB蛋白C端含有LFGV四肽，該結(jié)構(gòu)是轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)的阻遏物[8]。番茄的相關(guān)研究能夠解釋多數(shù)CaHsfB在HS條件下的表達(dá)模式。該研究表明HsfB1能夠與其他蛋白互作發(fā)揮調(diào)控作用，如與HsfA1a或HsfA2互作，調(diào)節(jié)不同階段的HS響應(yīng)；或者與HsfA1a和組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶HAC1形成三聚體[1]，促進(jìn)報告基因的激活[65]。不過，這些在HS條件下上調(diào)表達(dá)的CaHsfB基因具有何種功能仍需要進(jìn)一步的研究。HS條件下，B6和R9葉片的CaHsfB3a和CaHsfB3b均下調(diào)表達(dá)，表明旁系同源基因可能會抑制CaHsf基因的表達(dá)。S條件下，R9的CaHsfC1表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化，與玉米HsfC族[8]的ZmHsf-13的表達(dá)模式類似；而B6的CaHsfC1下調(diào)表達(dá)，其表達(dá)模式與小麥的HsfC1亞族相似[41]。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于HsfC族對HS的響應(yīng)存在種間差異和品種差異，但有待進(jìn)一步研究。

除HS外，CaHsf基因同樣受到鹽脅迫和滲透脅迫的調(diào)控（圖5）。CaHsfA1b、CaHsfA9a和CaHsfA9d能受HS、鹽脅迫和滲透脅迫的誘導(dǎo)，而CaHsfA6c和CaHsfB4的表達(dá)受鹽脅迫的抑制，在HS條件下增強。CaHsfB3a和CaHsfB3b在滲透脅迫下上調(diào)表達(dá)，而在HS下下調(diào)表達(dá)，該現(xiàn)象表明這對旁系同源基因在面對其他脅迫時具有特殊功能，以此增加植物對脅迫的適應(yīng)性[41]。有趣的是，CaHsfA2在鹽脅迫和HS下的表達(dá)模式不同，甚至在滲透脅迫下的根和莖中也具有不同的表達(dá)模式；AtHsfA2超表達(dá)顯示該基因不僅與耐熱性相關(guān)，也與耐鹽性和耐滲透脅迫相關(guān)[33]，表明CaHsf基因在不同脅迫下不同組織中具有不同功能，一些CaHsf基因可能參與多種脅迫響應(yīng)[64]。

Ca2+、Put、ABA和MeJA在各種脅迫下參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并調(diào)控CaHsf基因的表達(dá)。不同信號調(diào)控不同的CaHsf基因。例如，Ca2+和Put能夠使CaHsfA6a、CaHsfA9a和CaHsfA9d上調(diào)表達(dá)，而ABA和MeJA使CaHsfA6a下調(diào)表達(dá)，表明雖然多數(shù)CaHsf蛋白高度保守，但在不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有不同功能。Ca2+作為第二信使，聯(lián)合胞內(nèi)外信號和生化反應(yīng)調(diào)節(jié)植物細(xì)胞在脅迫下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在HS下，擬南芥需要以鈣調(diào)素AtCaM3作為信號激活鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶（CBK）使HsfA1a磷酸化[6]。因此可以推斷，辣椒經(jīng)Ca2+處理后，CaM3通過鈣調(diào)素信號途徑誘導(dǎo)CaHsfA6a、CaHsfA9a和CaHsfA9d上調(diào)表達(dá)。非生物脅迫下，Put通過調(diào)節(jié)細(xì)胞pH值控制活性氧的合成，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，但目前沒有Put調(diào)控Hsf基因的報道[66]。我們之前的研究表明Put與HS過程相關(guān)，本研究中，Put誘導(dǎo)CaHsfA2、CaHsfA3、CaHsfA6a、CaHsfA9a、CaHsfA9d和CaHsfB4上調(diào)表達(dá)，這就能夠解釋之前的現(xiàn)象了[38]。許多研究報道ABA[67-69]和MeJA[70-71]在高溫傷害中具有保護(hù)作用。CaHsfA6a受ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，受Ca2+和Put影響下調(diào)表達(dá)，表明CaHsfA6a在ABA、Put和Ca2+介導(dǎo)的生理過程中具有不同作用。雖然CaHsfA1b、CaHsfA4a和 CaHsfA4b的啟動子區(qū)域含有響應(yīng)MeJA的順式作用元件，CGTCA-或TGACG-模體，但MeJA卻不能影響這些基因的表達(dá)水平，這可能是由其他順式作用元件和復(fù)雜調(diào)控機制共同作用造成的。

HsfA2受HS誘導(dǎo)，能增強植物的耐熱性[1]，多種植物中均有研究[5,23,31]；而目前對辣椒HsfA2的研究卻非常有限[37]。本研究發(fā)現(xiàn)CaHsfA2在Hsf家族中具有典型的特征，如CaHsf蛋白因NLS結(jié)構(gòu)域定位于細(xì)胞核（圖6，表3），具有轉(zhuǎn)錄活性（圖7），且對持續(xù)的HS產(chǎn)生響應(yīng)（圖8）；這些結(jié)果應(yīng)證本研究對CaHsf的全基因組鑒定是正確的。25個辣椒Hsf基因中，HS處理下CaHsfA2的表達(dá)量僅次于R9的CaHsfA3和B6的CaHsfA1d，表明CaHsfA2可能如擬南芥和番茄中的HsfA2那樣，是Hsf家族的優(yōu)勢基因[72]（圖4）。HS條件下，熱敏辣椒B6 CaHsfA2的表達(dá)水平低于耐熱辣椒R9，這可能是兩種辣椒具有不同耐熱能力的原因（圖8）?？墒?，HS處理4 h后R9中CaHsfA2水平低于1 h的水平，且B6的CaHsfA2在HS處理后期顯著下調(diào)表達(dá)?？赡苁钦{(diào)控基因或生物鐘導(dǎo)致了不同的表達(dá)模式。長時間HS處理下，Hsp17-II維持在較高水平，且直接和HsfA2產(chǎn)生互作，形成無活性的復(fù)合物[1]。一旦缺少分子伴侶，HsfA2就會從復(fù)合物中脫離，并行使轉(zhuǎn)錄因子的功能。此外，HS處理后HsfB2b受誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，但受HsfA2的抑制。雖然CaHsfA2響應(yīng)CaHsfA2的調(diào)控機制有待進(jìn)一步研究，但CaHsfA2很可能像擬南芥HsfB2b一樣，是節(jié)律基因，受HS和生物鐘的共同調(diào)控[73]。

5 結(jié)論

本研究從辣椒基因組中共鑒定出25個CaHsf基因。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域和生物信息學(xué)分析，CaHsf基因被分為3族，分別為CaHsfA、CaHsfB和CaHsfC，12條染色體中有11條分布了CaHsf基因，11號染色體上沒有CaHsf基因。根據(jù)CM334的RNA-seq數(shù)據(jù)，CaHsf基因在根、莖、葉、果皮和胎座中均有表達(dá)。實時熒光定量表明，除耐熱辣椒R9葉片的CaHsfC1外，其他CaHsf能夠響應(yīng)HS（40℃ 12 h），而熱敏辣椒B6的響應(yīng)模式有所不同。許多CaHsf基因能夠被鹽脅迫和滲透脅迫的誘導(dǎo)，也能被一些信號物質(zhì)誘導(dǎo)，如Ca2+、Put、ABA和MeJA。此外，CaHsfA2具有Hsf蛋白的典型特征，定位于細(xì)胞核，具有轉(zhuǎn)錄活性，并能夠響應(yīng)長時間的HS。本研究為植物Hsf家族添加了一名新成員，并為今后研究CaHsf在各種非生物脅迫下的功能和辣椒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供了資料。

6 縮略詞

Hsf：熱休克因子；qRT-PCR：實時熒光定量PCR；HS：高溫脅迫；Hsp：熱休克蛋白；HSE：熱休克元件；DBD：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；OD：寡聚結(jié)構(gòu)域；AA：氨基酸；NLS：核定位信號；NES：核輸出信號；RD：阻遏域；HMM：因馬爾科夫模型；CBK：鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶；PGDD：植物基因組重復(fù)數(shù)據(jù)庫；GFP：綠色熒光蛋白；PTFD：植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫；Put：腐胺；ABA：脫落酸；MeJA：茉莉酮酸甲酯。

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文獻(xiàn)來源：BMC Plant Biology （2015），15：151（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院 劉 越 孔秋生 譯）