NETs在自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中的作用研究進(jìn)展①

肖 芳 鄭成云 蔣衛(wèi)東 綜述 陳 麗 審校

(山東大學(xué)第二醫(yī)院干部保健科,濟(jì)南250033)

NETs在自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中的作用研究進(jìn)展①

肖 芳 鄭成云②蔣衛(wèi)東 綜述 陳 麗③審校

(山東大學(xué)第二醫(yī)院干部保健科,濟(jì)南250033)

中性粒細(xì)胞作為人體固有免疫系統(tǒng)的哨兵，在血液的非特異性細(xì)胞免疫系統(tǒng)中起著十分重要的作用，它們由骨髓分化發(fā)育成熟后，進(jìn)入血液或組織，當(dāng)微生物病原體特別是化膿性細(xì)菌入侵、炎癥發(fā)生時(shí)，在多種炎癥和細(xì)胞因子的介導(dǎo)下，它們便會(huì)被迅速招募并趨化至炎癥部位，通過分泌細(xì)胞因子、脫顆粒和吞噬作用等殺滅并清除病原體。在2004年，Zychlinsky等研究發(fā)現(xiàn)12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞活化并釋放出包裹著組蛋白、彈性蛋白酶等多種胞內(nèi)物質(zhì)的網(wǎng)狀DNA纖維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有包裹、限制及殺傷病原菌的作用。這一中性粒細(xì)胞釋放的防御反應(yīng)性網(wǎng)狀DNA纖維結(jié)構(gòu)被命名為NETs[1,2]。隨著NETs在病原微生物所致的感染炎癥性疾病的抗病作用機(jī)制逐漸闡明的同時(shí)，NETs釋放引起胞內(nèi)成分外露、清除缺陷及隨后反應(yīng)過程的調(diào)節(jié)失衡在諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、脈管炎等多種自身免疫性疾病病程中的致病作用也不斷被人們揭示。目前對(duì)NETs導(dǎo)致自身免疫性疾病發(fā)病和進(jìn)展的具體機(jī)制仍不明確，本文就NETs特點(diǎn)及其產(chǎn)生機(jī)制和NETs在自身免疫疾病發(fā)病機(jī)制中的作用方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 NETs的產(chǎn)生及分子機(jī)制

中性粒細(xì)胞形成NETs的過程稱為NETosis，這是一種有別于細(xì)胞壞死和凋亡的特殊細(xì)胞死亡過程[3]，可以被多種有機(jī)和或無(wú)機(jī)因素始動(dòng)，如脂多糖(LPS)、PMA、免疫復(fù)合物、一氧化氮、過氧化氫等[4,5]?；罨蟮闹行粤＜?xì)胞在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上首先表現(xiàn)為核染色質(zhì)解聚，其后常染色質(zhì)和異染色質(zhì)變得難以區(qū)分，同時(shí)，細(xì)胞核分葉的特征也逐漸消失；在這一過程中，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase，NE)從胞漿內(nèi)的嗜天青顆粒釋放出來并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，附著并降解組蛋白；隨后，顆粒蛋白膜及核膜逐漸趨于崩解，髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)便通過疏松的核膜進(jìn)入細(xì)胞核與解聚的染色質(zhì)混合并繼續(xù)降解核染色質(zhì)；最后細(xì)胞膜崩解破裂，使包裹著組蛋白、MPO、NE等多種胞內(nèi)蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀染色質(zhì)纖維釋放至細(xì)胞外基質(zhì)[6,7](圖1為L(zhǎng)PS誘導(dǎo)人中性粒細(xì)胞活化釋放NETs的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，網(wǎng)狀綠色熒光結(jié)構(gòu)為NETs)。

研究表明，NETosis的分子機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面：活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)打亂了NE和蛋白多糖矩陣的聯(lián)系，而后者在細(xì)胞靜息狀態(tài)下可以下調(diào)蛋白酶活性，從而導(dǎo)致了NE及后續(xù)MPO從顆粒蛋白內(nèi)釋放，ROS還可以促使脂質(zhì)過氧化，在離子而非大分子誘導(dǎo)劑存在下使膜通透性增加[8]；NADPH氧化酶及其后續(xù)raf-MEK-ERK通路的活化也與NETosis發(fā)生有關(guān)[9]；另外，Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)組蛋白的瓜氨酸脫亞氨化修飾是NETosis發(fā)生的另一可能機(jī)制，通過阻斷這一修飾過程的關(guān)鍵酶PAD4可以阻止NETs產(chǎn)生。大量證據(jù)表明組蛋白的瓜氨酸化為自身抗原的主要來源，阻斷PAD4可以遏制小鼠關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病等小鼠模型病程的發(fā)展[11,12]。新近有研究直接證實(shí)PAD4阻斷劑Cl-amidine抑制自發(fā)狼瘡小鼠模型發(fā)生NETosis，從而減少了自身抗體產(chǎn)生，降低了抗原抗體免疫復(fù)合物在模型鼠腎臟的沉積，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能及削弱疾病活動(dòng)[13]。因此，NETosis涉及多因素、多環(huán)節(jié)的共同參與，其具體機(jī)制人們目前了解甚少。

圖1 體外LPS誘導(dǎo)健康人中性粒細(xì)胞NETs形成Fig.1 LPS can elicit NETs release from healthy human neutrophils in vitro system

2 NETosis成為自身抗原的潛在來源

隨著NETs及NETosis過程的不斷闡明，人們對(duì)中性粒細(xì)胞參與免疫反應(yīng)的機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。Brinkmann等[14]研究結(jié)果已表明在暴露于細(xì)菌、LPS、PMA等環(huán)境下中性粒細(xì)胞可以發(fā)生NETosis，這一過程導(dǎo)致中性粒細(xì)胞胞內(nèi)成分外露，包括核染色質(zhì)和胞內(nèi)多種蛋白成分。通過電鏡可以觀察到細(xì)菌被包裹在含有DNA和組蛋白的NETs網(wǎng)狀纖維中，這種現(xiàn)象很容易讓人們聯(lián)想到狼瘡免疫復(fù)合物中的自身抗原與細(xì)菌佐劑對(duì)自身免疫反應(yīng)的激活作用。如果機(jī)體對(duì)NETs中自身抗原不能建立穩(wěn)固的免疫耐受，則針對(duì)于NETs內(nèi)含有的核染色質(zhì)和其他蛋白成分的自身抗體就會(huì)相繼出現(xiàn)。

值得注意的是，在NETosis發(fā)生過程N(yùn)ETs中的自身抗原已經(jīng)在多種酶和ROS作用下進(jìn)行了修飾變型。組蛋白去亞氨化發(fā)生于NE、MPO等蛋白酶裂解組蛋白的過程中，大大降低了DNA和組蛋白的相互作用使得原本緊密的核染色質(zhì)變得疏松[10]。另外，酪氨酸和色氨酸殘基被氧化也改變了多種核內(nèi)自身抗原的功能[15]。對(duì)這些蛋白的修飾能夠產(chǎn)生很多潛在的自身抗原表位，如果免疫耐受沒能相應(yīng)形成就可能引發(fā)自身免疫反應(yīng)。

3 NETs在自身免疫疾病中的作用

自身免疫性疾病是指機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。研究表明，NETosis發(fā)生導(dǎo)致的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)暴露已成為機(jī)體自身抗原的主要來源，而與B細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)自身抗體的產(chǎn)生在自身免疫疾病易感性的個(gè)體中發(fā)揮著重要致病或誘導(dǎo)疾病發(fā)生的作用。

3.1 NETs與系統(tǒng)性紅斑狼瘡 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種累及多系統(tǒng)、多器官的自身免疫性疾病，患者體內(nèi)有針對(duì)DNA、核染色質(zhì)、DNA聯(lián)合蛋白及包括NETs成分在內(nèi)的大量致病性自身抗體和免疫復(fù)合物，能夠造成多種組織損傷。狼瘡免疫復(fù)合物中的自身DNA含有多肽抗菌素LL-37，能夠激活漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoiddendriticcell，pDC)表面的Toll樣受體9(Toll like receptor 9,TLR9)，促使IFN-α合成并保護(hù)核酸不被核酸酶降解。在SLE患者，這些DNA-抗菌復(fù)合物釋放出胞外的NETosis過程顯著加強(qiáng)，從而介導(dǎo)機(jī)體自身抗體的大量產(chǎn)生[16,17]。多年來，DNA-抗DNA抗體免疫復(fù)合物被認(rèn)為是導(dǎo)致狼瘡腎炎(Lupus nephritis，LN)腎臟損害的主要免疫復(fù)合物之一，電鏡和免疫熒光可以觀察到LN腎臟內(nèi)皮下和上皮下存在大量染色質(zhì)、抗DNA的IgG抗體、補(bǔ)體組成的免疫復(fù)合物。針對(duì)自身核成分的自身抗體的產(chǎn)生機(jī)制及免疫復(fù)合物中核染色質(zhì)的來源仍不明確，而NETs顯然成為了導(dǎo)致狼瘡腎臟、皮膚損害和其他自身免疫性疾病靶器官損害的免疫復(fù)合物中自身抗原的源頭[18]。近來研究表明，活化的中性粒細(xì)胞可能為循環(huán)和原位免疫復(fù)合物中核染色質(zhì)的重要來源。狼瘡患者血清中的免疫復(fù)合物包含中性粒細(xì)胞抗菌蛋白LL-37、MPO、蛋白酶-3(PR-3)及自身DNA[17]，與NETs中含有的成分高度相似，而對(duì)狼瘡患者和小鼠動(dòng)物模型腎臟活檢的結(jié)果已驗(yàn)證了NETs存在[18,19]。關(guān)于免疫復(fù)合物中NETs是如何沉積于腎小球局部及免疫復(fù)合物是如何形成仍需要進(jìn)一步研究，而這對(duì)闡明狼瘡腎臟損害機(jī)制至關(guān)重要。

3.2 NETs與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性的，表現(xiàn)為外周關(guān)節(jié)非特異性炎癥的自身免疫性疾病?；疾￡P(guān)節(jié)及其周圍組織呈現(xiàn)進(jìn)行性破壞，滑膜炎持久反復(fù)發(fā)作，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞，關(guān)節(jié)功能障礙，甚至殘疾。目前RA的病因仍不清楚，但已經(jīng)有大量的研究證據(jù)表明RA的發(fā)生與抗瓜氨酸肽抗體(Anti-citrullinated protein antibodies，ACPAs)有關(guān)，其中抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(CCP)已成為目前診斷RA的重要指標(biāo)之一。ACPAs存在于超過2/3的RA病人血清中，并且比類風(fēng)濕因子(Rheumatoid factors，RF)更具特異性[20]。Khandpur等[21]發(fā)現(xiàn)在RA患者循環(huán)和關(guān)節(jié)滑液的中性粒細(xì)胞比健康對(duì)照更容易發(fā)生NETosis，并且NETosis與ACPAs及系統(tǒng)炎癥指標(biāo)的存在及水平相關(guān)，這可能與IL-17α和TNF-α對(duì)NETs的激活作用有關(guān)，同時(shí)瓜氨酸化的波形蛋白及α-烯醇化酶均能在RA患者來源的NETs中檢出，其形成的自身抗體又能反過來誘導(dǎo)NETs生成，而NETs大量生成后又可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞IL-8的產(chǎn)生。另有研究表明，瓜氨酸化H4組蛋白抗體能夠在約64% RA患者血清中檢測(cè)到并與抗CCP滴度相關(guān)，同時(shí)瓜氨酸化H4組蛋白在NETs存在并成為RA患者血清自身抗體的靶抗原，建立了NETs作為攜載自身抗原的形式參與RA疾病發(fā)病的可能相關(guān)關(guān)系[22]。因此，NETs可以作為自身抗原的來源，由此形成的自身抗體ACPAs又能反過來誘導(dǎo)NETs形成并繼發(fā)后續(xù)炎癥反應(yīng)。

3.3 NETs與ANCA相關(guān)性小血管炎 ANCA相關(guān)性小血管炎(Small-vessel vasculitis，SVV)也是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其基本病理改變?yōu)閴乃佬孕⊙苎装Y。ANCA的靶抗原存在于白細(xì)胞胞漿中，中性粒細(xì)胞的主要顆粒和單核細(xì)胞溶酶體含有兩種主要靶抗原：MPO和PR-3。由于在NETs也大量存在這兩種蛋白，因此推測(cè)ANCA相關(guān)性血管炎可能與NETosis發(fā)生有關(guān)。Kessenbrock等[23]報(bào)道了SVV患者血清來源的IgG在體外比對(duì)照組血清IgG更容易誘導(dǎo)NETs產(chǎn)生，并且這些抗體以NETs含有的MPO和PR3蛋白為靶抗原，而循環(huán)中MPO-DNA免疫復(fù)合物能夠在患者特別是處于疾病活動(dòng)期的病人血清中檢測(cè)出，后對(duì)患者腎臟進(jìn)行針刺活檢證實(shí)了NETs在病損的腎小球和基質(zhì)間的沉積，上述證據(jù)均表明NETs形成能夠引起血管炎及促進(jìn)針對(duì)NET內(nèi)成分的自身免疫反應(yīng)。另外，SVV患者罹患靜脈血栓事件風(fēng)險(xiǎn)很高，而NETs很可能成為聯(lián)結(jié)血小板和血液促凝成分的載體促進(jìn)血栓形成。近來有研究發(fā)現(xiàn)SVV患者中性粒細(xì)胞能夠釋放NETs和含有組織因子(TF)的微囊泡，NETosis在處于活動(dòng)期的患者更加顯著，而來源于患者和活動(dòng)期病人血清樣本及從這些病例獲得的IgG能夠誘導(dǎo)表達(dá)TF的NETs和微囊泡大大生成[24]。尸檢顯示在SVV肺泡出血的患者中伴有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和嚴(yán)重新月體型腎小球腎炎，NETs不僅大量出現(xiàn)在腎臟組織，也存在于血栓中。在顯微鏡下多血管炎(MPV)患者血栓NETs檢出率要比MPV無(wú)關(guān)的血栓高的多[25]。正因?yàn)镹ETs攜載的MPO、PR-3自身抗原為ANCAs靶抗原，結(jié)合多項(xiàng)研究可以看出NETosis在自身免疫小血管炎的發(fā)病機(jī)制中起了關(guān)鍵作用，而由此可以推測(cè)NETosis和ANCAs的調(diào)節(jié)系統(tǒng)異?？赡艽嬖谥鴲盒匝h(huán)。

3.4 NETs與Felty綜合征 Felty綜合征是指除有典型的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床表現(xiàn)外，還伴有脾臟腫大和白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少的一種嚴(yán)重型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，該病患者血清中能夠檢測(cè)到針對(duì)組蛋白脫亞氨化修飾的自身抗體，并能夠誘導(dǎo)NETosis發(fā)生[26]，提示NETs可能在該疾病病程中發(fā)揮一定作用，但具體機(jī)制尚不清楚。

4 總結(jié)

自身免疫性疾病是一類發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、病程遷延難愈的疾病，對(duì)于自身免疫領(lǐng)域的研究從未間斷，而新近NETs的發(fā)現(xiàn)可以被視為自身免疫異常發(fā)生機(jī)制的重大突破。自NETs被發(fā)現(xiàn)后，其生物學(xué)意義就一直都是研究的熱點(diǎn)。NETs可能是通過釋放自身抗原，與B細(xì)胞相互作用等誘導(dǎo)自身抗體的產(chǎn)生，參與自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。目前關(guān)于NETs的致病作用主要集中在SLE、RA等系統(tǒng)性自身免疫性疾病中，對(duì)于器官特異性自身免疫性疾病如橋本氏甲狀腺炎、1型糖尿病、潰瘍性結(jié)腸炎等發(fā)生和進(jìn)展是否也有NETs參與有待進(jìn)一步探索，為進(jìn)一步揭示自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制、尋找預(yù)防和精準(zhǔn)治療該類疾病奠定基礎(chǔ)。

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[收稿2016-05-27 修回2016-06-12]

(編輯 張曉舟)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.032

①本文受山東省自然科學(xué)基金(ZR2016HP19)和山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2015GSF118033)資助。

肖 芳(1985年-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事自身免疫甲狀腺疾病的基礎(chǔ)及臨床研究,E-mail:xiaofangqshdd@163.com。

及指導(dǎo)教師：陳 麗(1957年-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事內(nèi)分泌疾病的基礎(chǔ)與臨床研究,E-mail:chenli3@medmail.com.cn。

R392.1

A

1000-484X(2017)05-0781-04

②山東大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科，濟(jì)南250033。

③山東大學(xué)齊魯醫(yī)院內(nèi)分泌科,濟(jì)南250012。