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    活化蛋白-1在急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病大鼠海馬的表達變化

    2017-06-05 15:18:46張益梅張奕雯李經(jīng)倫
    中國免疫學(xué)雜志 2017年5期
    關(guān)鍵詞:遲發(fā)性一氧化碳海馬

    張益梅 張奕雯 何 林 李經(jīng)倫

    (西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,瀘州646000)

    活化蛋白-1在急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病大鼠海馬的表達變化

    張益梅 張奕雯 何 林 李經(jīng)倫

    (西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,瀘州646000)

    目的:觀察急性一氧化碳中毒后不同時間點大鼠海馬AP-1的表達變化。方法:腹腔注射一氧化碳的方法制備一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病模型,HE染色觀察大鼠海馬區(qū)病理變化,免疫組化及Western blot法檢測AP-1的表達水平,TUNEL染色計數(shù)海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元。結(jié)果:HE染色,空氣組(AC組)、空白組(BC組)各時間點海馬區(qū)細胞形態(tài)正常;一氧化碳組(CO組)海馬區(qū)細胞腫脹、細胞數(shù)目減少,排列紊亂,細胞間隙擴大,細胞核碎裂、深染、固縮。免疫組化:CO組各時間點AP-1表達量均高于AC組及BC組,3 d達峰值,組內(nèi)第3天與其余各時間點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Western blot:AP-1表達在時間分布趨勢上與免疫組化結(jié)果一致。TUNEL染色:CO組各時間點凋亡指數(shù)均較AC組、BC組多,于毒染后7 d達高峰差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:大鼠海馬區(qū)AP-1表達增高,可能進一步導(dǎo)致細胞凋亡和炎癥免疫反應(yīng),成為DEACMP發(fā)病的重要機制之一。

    急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦?。换罨鞍?1;細胞凋亡

    一氧化碳(Carbon monoxide,CO)是一種無色無味的有毒氣體,研究表明它與血紅蛋白的親和力是氧氣的240倍[1],嚴重阻礙血紅蛋白與氧氣的結(jié)合和氧的解離,人體在短時間吸入一定程度的一氧化碳,將造成全身多系統(tǒng)多器官不同程度缺氧,尤其是對缺血缺氧耐受最差的大腦影響最顯著。在我國,急性一氧化碳中毒的發(fā)病率和死亡率均占職業(yè)和非職業(yè)危害前位[2]。臨床上有大約10%~30%的一氧化碳中毒患者經(jīng)成功搶救急性中毒癥狀緩解后經(jīng)過約3~60 d“假愈期”出現(xiàn)以癡呆、精神癥狀、錐體外系功能障礙等為主的神經(jīng)精神癥狀,稱為急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病(Delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP)[3]。該病病程長、療效差、預(yù)后不理想,嚴重影響患者的生活質(zhì)量,給家庭及社會造成了極大的負擔(dān)[4]。多年來,眾多專家學(xué)者對其進行了大量研究,提出有神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、自由基損傷、細胞凋亡及自身免疫反應(yīng)損傷等機制,但迄今無一理論可明確闡述其發(fā)病機制,因此探索其發(fā)病原因仍是目前醫(yī)學(xué)界研究的熱點和難點[5]。活化蛋白-1(Activated protein-1,AP-1)是一類反式調(diào)節(jié)因子,主要由c-Jun和c-fos組成的同源或異源二聚體,其作用廣泛,各種理化、生物學(xué)刺激及細胞應(yīng)激都可促進其表達活化,進而對細胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程進行調(diào)控[6]。本研究檢測急性一氧化碳中毒后不同時間點大鼠海馬AP-1的表達變化。探討AP-1與DEACMP之間的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠156只,體重180~300 g,由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng):每籠6只于12 h明暗交替的動物房溫室飼養(yǎng)(18~23℃),自由進食攝水,定期清潔鼠籠。

    1.1.2 實驗材料 一氧化碳氣體(體積分數(shù)為99.9%)由四川西南化工研究院提供;一抗AP-1兔抗鼠多克隆抗體,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗,美國CST公司;TUNEL試劑盒,北京生物科技公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 實驗動物分組 將大鼠隨機分為3組:急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病組(CO組)60只、空氣組(AC組)60只、空白對照組(BC組)36只。各組再隨機均等分至毒染后1、3、7、14、21、28 d 6個時間點亞組,CO組、AC組各時間點10只,BC組各時間點6只。

    1.2.2 動物模型的制備 采用改良式腹腔注射一氧化碳法[7]染毒制備急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病動物模型。CO組首次腹腔注射一氧化碳100 ml/kg,間隔4 h追加注射一次,連續(xù)追加3次,追加劑量為首次劑量的1/2 ;AC組同法注射等量空氣;BC組不做任何處理。3組大鼠分別在毒染前及每次注射后2、4 h取鼠尾血1 ml用全自動血氣分析儀監(jiān)測染毒大鼠血碳氧血紅蛋白(Carbon monoxide hemoglobin,HbCO)濃度,以血中HbCO濃度維持在50%以上為中毒指標(biāo)。用Morris水迷宮實驗檢測大鼠的認知能力。通過觀察大鼠的癥狀體征并結(jié)合以上兩項指標(biāo)綜合判斷CO組大鼠是否發(fā)生了遲發(fā)性腦病。

    1.2.3 標(biāo)本制備 3組大鼠在相應(yīng)的6個時間點隨機選取一半進行麻醉、心臟灌洗、取材固定在4%多聚甲醛中,制作石蠟切片,用于HE、免疫組化及TUNEL染色。各組另一半直接斷頸處死取出全部腦組織,在冰盤上快速分離兩側(cè)海馬組織用于Western blot實驗。HE染色:將石蠟切片經(jīng)過脫蠟、脫苯、水洗、甩干、染色、分色、沖洗、復(fù)染、脫水、透明、固封等步驟后,將切片置于400倍光鏡下觀察病理改變,并采集圖像。

    免疫組化染色:采用SP法,石蠟切片脫蠟至水,于3%H2O2甲醛溶液中15 min,磷酸鹽緩沖液洗5 min;浸入0.01 mol/L(pH6.0)枸櫞酸鹽緩沖液中,加熱至98℃ 20 min(進行抗原修復(fù)),室溫冷卻30 min,磷酸鹽緩沖液洗5 min;加正常山羊血清封閉液37℃孵育30 min,滴加一抗(1∶100 稀釋,兔抗鼠AP-1多克隆抗體)4℃過夜;磷酸鹽緩沖液洗5 min×3,加二抗37℃孵育30 min;磷酸鹽緩沖液洗5 min×3, 二氨基聯(lián)苯胺顯色10 min。蘇木精復(fù)染,脫水,透明,封片后顯微鏡下觀察。

    Western blot法觀察AP-1表達方法:海馬細胞總蛋白的提??;蛋白變性;BCA法測定蛋白含量;SDS-PAGE電泳;轉(zhuǎn)膜;免疫反應(yīng);化學(xué)發(fā)光、顯影、定影;凝膠圖象分析,將膠片進行掃描或拍照,經(jīng)β-actin校正后,用凝膠成像系統(tǒng)分析各組AP-1及內(nèi)參表達條帶的灰度值。

    TUNEL染色:具體操作按照說明書進行。甘油明膠封片后光鏡觀察。

    1.2.4 圖像分析 免疫組化染色陽性細胞計數(shù):將細胞胞漿、胞核染成淡黃色、棕黃色或棕褐色定義為陽性表達細胞。采用人工計數(shù)半定量分析法計數(shù)[8],取5個視野的平均數(shù)作為該張切片的陽性細胞表達數(shù)。

    TUNEL染色結(jié)果計數(shù):每張切片隨機選取海馬CA1區(qū)5個互不重疊視野,觀察細胞核有棕黃色顆粒為陽性細胞,記錄每個視野的凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù),計算出凋亡指數(shù)(Apoptotic index,AI),AI=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%,對5個視野內(nèi)計數(shù)的均數(shù)進行統(tǒng)計分析。

    2 結(jié)果

    2.1 HE染色結(jié)果 AC組、BC組大鼠海馬CA1區(qū)細胞排列緊密整齊,細胞形態(tài)正常,胞膜完整,核結(jié)構(gòu)清晰,細胞間質(zhì)均勻致密。且各時間點HE染色結(jié)果無明顯變化。CO組1、3 d細胞腫脹,數(shù)目減少,并可見少許神經(jīng)元變性壞死;7 d細胞數(shù)目明顯減少,神經(jīng)元變性、壞死增多,胞核碎裂、固縮明顯;14 d細胞排列散亂、腫脹明顯,并可見膠質(zhì)細胞增生浸潤;21、28 d細胞皺縮,胞核固縮、碎裂、深染明顯,可見壞死神經(jīng)元被吸收后留下的龕影(圖1)。

    2.2 免疫組化結(jié)果 AP-1陽性細胞呈棕黃色。AC組、BC組可見少量的陽性細胞,組內(nèi)各時間點變化不明顯,兩組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);CO組染毒后1 d升高,3 d達高峰,后逐漸下降,至28 d時仍有較高表達,CO組各時間點AP-1表達量均高于AC組及BC組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),CO組內(nèi)3 d與其余各時間點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2、表1)

    圖1 各組大鼠7 d海馬CA1區(qū)細胞HE染色情況(×400)Fig.1 HE staining of each group in hippocampal CA1 area of rats in 7 day(×400)Note: A.AC group;B.BC group;C.CO group.

    圖2 各組大鼠3 d海馬AP-1蛋白的免疫組化表達(×400)Fig.2 Immunohistochemistry staining of each group of AP-1 in hippocampal CA1 area of rats in 3 day(×400)Note: A.AC group;B.BC group;C.CO group.

    圖3 三組大鼠海馬AP-1蛋白Western blot結(jié)果Fig.3 Western blot results of AP-1 in hippocampal of rats of three groups

    2.3 Western blot結(jié)果 AC組、BC組大鼠海馬AP-1表達量很少,CO組大鼠海馬在1 d時增多,3 d時達高峰,7 d開始下降,至28 d時表達仍高于AC組和BC組。AP-1表達在時間分布趨勢上與免疫組化結(jié)果一致(圖3)。

    2.4 TUNEL染色結(jié)果 AC組、BC組大鼠海馬區(qū)各時間點凋亡細胞少,且變化不明顯,兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);CO組各時間點凋亡指數(shù)均較AC組、BC組多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),于毒染后7 d達高峰,CO組內(nèi)7 d與其余各時間點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖4、表2)。

    2.5 AP-1與凋亡指數(shù)的相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson直線相關(guān)分析,CO組大鼠海馬CA1區(qū)AP-1蛋白的表達與細胞凋亡指數(shù)存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.963,P<0.05)。

    TimeCOACBC1d3.50±0.511)2)2.02±0.481.83±0.523d7.92±0.881)2)3)1.98±0.572.05±0.747d6.40±1.171)2)2.25±0.481.89±0.8114d5.25±1.011)2)2.30±0.592.01±0.7221d4.36±1.321)2)2.10±0.971.99±0.4428d3.74±0.691)2)2.16±0.542.17±0.50

    Note:Vs AC group,1)P<0.05;vs BC group,2)P<0.05;vs other time point in CO proup,3)P<0.05.

    圖4 7 d大鼠海馬細胞凋亡情況(×400)Fig.4 Cell apoptosis of each group of in hippocampal of rats in 7 day(×400)Note: A.AC group;B.BC group;C.CO group.

    TimeCOACBC1d7.49±0.651)2)4.54±0.853.90±0.983d15.63±1.141)2)4.30±0.964.09±0.687d20.00±1.561)2)3)4.65±0.943.86±0.7114d18.22±1.001)2)3)5.13±0.414.45±0.8321d12.41±1.191)2)4.82±1.054.77±1.0628d7.86±1.011)2)4.69±0.454.31±0.50

    Note:Vs AC group,1)P<0.05;vs BC group,2)P<0.05;vs other time point in CO group,3)P<0.05.

    3 討論

    HbCO體內(nèi)半衰期約為8 h,不到24 h能恢復(fù)到正常生理水平,DEACMP發(fā)生在一氧化碳排出體外HbCO恢復(fù)到正常生理水平之后,因此用單純的一氧化碳導(dǎo)致的缺氧很難解釋“假愈期”和DEACMP的遲發(fā)現(xiàn)象[9]。關(guān)里等[10]發(fā)現(xiàn)急性一氧化碳中毒早期凝血功能減退,血液稀釋,待血中一氧化碳排出(末次注射一氧化碳1 d) 后,則出現(xiàn)血液濃縮、凝血功能大幅增強(PTA、PT、APTT 和Fib在7~14 d達高峰)的全腦缺血再灌注改變。這一血液流變學(xué)變化與DEACMP發(fā)病的病程相符。有專家提出了缺血再灌注損傷學(xué)說[11]。細胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的重要病因,Piantadosi等[12]于1997年利用免疫組化和電鏡首次證實一氧化碳中毒后大鼠腦內(nèi)有細胞凋亡發(fā)生,其后對一氧化碳中毒死亡患者尸檢也證實了上述現(xiàn)象的發(fā)生。本實驗CO組各時間點凋亡指數(shù)均較AC組、BC組多,于毒染后7 d達高峰。該實驗結(jié)果與穆永茂等[13]基本一致。說明DEACMP的發(fā)病過程中確實有細胞凋亡的發(fā)生。細胞凋亡又叫程序性的細胞死亡,是在基因調(diào)控下的細胞主動死亡過程,該過程涉及酶的參與、蛋白的合成和一系列信號激活。AP-1是一類重要的真核細胞轉(zhuǎn)錄因子,是諸多細胞信號傳導(dǎo)途徑在細胞核內(nèi)的交匯點,能與許多基因上的AP-1位點結(jié)合,啟動多種與細胞分裂和增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,參與細胞的增殖、分化和凋亡等過程。AP-1因細胞的類型、細胞所處的狀態(tài)以及刺激信號的種類不同可呈現(xiàn)出促進細胞凋亡或細胞增殖的作用。研究證實,AP-1的高表達與缺血性卒中、神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變、癲癇以及新生兒缺血缺氧性腦損傷等疾病的神經(jīng)元凋亡有關(guān)[14-18],但DEACMP的細胞凋亡是否與AP-1有關(guān),目前在這方面的研究較少。我們的實驗觀察到CO組各時間點AP-1表達量均高于AC組及BC組,于染毒后3 d達高峰,各時間點的變化趨勢與細胞凋亡一致,且表達的時間先于細胞凋亡發(fā)生的時間,通過Pearson直線相關(guān)分析表明AP-1的表達與細胞凋亡指數(shù)存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.963,P<0.05),因而推測AP-1可能通過某些信號通路激活了凋亡相關(guān)靶基因的表達促進細胞凋亡,參與DEACMP 的發(fā)病過程。Thom 等[19]認為,免疫炎癥損傷可能參與了DEACMP 的發(fā)病過程。DEACMP 患者發(fā)病初期血清中IL-1β、IL-8、IL-10 水平明顯增高,并且隨著病情的好轉(zhuǎn),血清中上述指標(biāo)明顯低于發(fā)病初期[20]。李自力等[21]發(fā)現(xiàn),急性一氧化碳中毒患者血清中TNF-α和IL-8含量均明顯增高。CRP是炎癥反應(yīng)的敏感指標(biāo)之一,崔靜等[22]報道DEACMP患者血清的CRP一直維持在較高水平。由此可見,在DEACMP 的發(fā)病過程確實有炎癥反應(yīng)的發(fā)生。炎癥介質(zhì)大多受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。AP-1是細胞炎癥反應(yīng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,它可以調(diào)節(jié)細胞炎性因子基因表達,導(dǎo)致炎癥持續(xù)和發(fā)展[23]。有研究表明用AP-1 蛋白的突變形式封閉AP-1 活性后,發(fā)現(xiàn)IL-8的表達明顯受到抑制[24]。因此,AP-1 的異常表達可引發(fā)異常的炎癥反應(yīng)。然而DEACMP的炎癥反應(yīng)是否與AP-1 的異常表達相關(guān),目前尚無相關(guān)報道。本實驗屬于觀察性實驗,尚不能說明AP-1在DEACMP發(fā)病中的具體作用機制,還需要進一步研究。

    綜上,AP-1的高表達與DEACMP 的發(fā)病過程有密切關(guān)系,將AP-1作為一個分子治療靶,有望成為臨床上治療DEACMP的新的突破口。

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    [收稿2016-11-10 修回2016-12-24]

    (編輯 許四平)

    Study of changing levels of AP-1 in hippocampus of delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning rats

    ZHANGYi-Mei,ZHANGYi-Wen,HELin,LIJing-Lun.

    AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China

    Objective:To investigate the levels of AP-1 in hippocampus of rats at different time points after carbon monoxide poisoning.Methods: Carbon monoxide poisoning delayed encephalopathy model by using intraperitoneal injection of carbon monoxide.Uesd HE observed the pathological changes in hippocampus of rats.The levels of AP-1 was observed by immunohistochemistry and Western blot analysis.TUNEL was used to detect apoptotic neurons in hippocampal CA1 area.Results: HE dyeing conditions,the hippocampus cell of air group (AC) and blank group (BC) were normal at each time point.Pathological changes occurred in the hippocampus cell of Carbon monoxide group (CO),reduction in the number of cells,disorder of cells,intercellular space expansion,nuclear fragmentation,anachromasis and pyknotic.Immunohistochemical results,the AP-1 expression level at each time point in group CO were higher than group AC and BC.On 3th day it reached a peak.The comparison at all time points among the groups in the first three days were significantly different in statistics(P<0.05).Western blot results,the expression of AP-1 was consistented with the immunohistochemical results on the time distribution trend.TUNEL results,AI in group CO was higher than those in group AC and BC at all time points,there were significant differences(P<0.05) and 7th reached the peak of apopotsis.Conclusion: Inside the hippocampus of rats,there are increasing in AP-1 . Maybe it is one of the important pathogenesis of DEACMP .

    DEACMP;AP-1;Apoptosis

    10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.024

    張益梅(1985年-),女,在讀碩士,醫(yī)師,主要從事腦血管疾病研究,E-mail:18384333913 @163.com。

    及指導(dǎo)教師:李經(jīng)倫(1970年-),男,在讀博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事腦血管疾病研究,E-mail:ljl031611@163.com。

    R743.3

    A

    1000-484X(2017)05-0750-05

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