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    Th22細(xì)胞及其功能分子IL-22在狼瘡性腎炎中的作用研究

    2017-06-05 15:18:45顧麗萍楊貴麗陳幼發(fā)陶書超
    中國免疫學(xué)雜志 2017年5期
    關(guān)鍵詞:腎炎外周血細(xì)胞因子

    顧麗萍 楊貴麗 陳幼發(fā) 陶書超

    (武漢科技大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科,武漢430065)

    Th22細(xì)胞及其功能分子IL-22在狼瘡性腎炎中的作用研究

    顧麗萍 楊貴麗①陳幼發(fā)②陶書超③

    (武漢科技大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科,武漢430065)

    目的:觀察狼瘡性腎炎(LN)患者外周血中的Th22細(xì)胞及其功能分子白細(xì)胞介素(IL)-22的表達(dá),并探討其意義。方法:選擇系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(無腎臟受累)38例,狼瘡性腎炎患者32例,健康志愿者10例,分別作為SLE組、LN組和健康對照組(HC組)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測其外周血中Th22細(xì)胞,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測患者血清中IL-22的水平。比較三組Th22細(xì)胞和血清中IL-22水平差異,分析LN組Th22細(xì)胞和IL-22與SLE 疾病活動指數(shù)評分(SLEDAI)的相關(guān)性。結(jié)果:SLE組和LN組患者外周血中Th22細(xì)胞較健康對照組明顯升高(P<0.01),血清中IL-22水平也較健康對照組明顯升高(P<0.01);Th22和IL-22在LN組較SLE組要稍微高表達(dá),但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);LN組患者Th22細(xì)胞比例和IL-22水平與對應(yīng)患者的疾病活動性評分SLEDAI呈正相關(guān)。結(jié)論:Th22細(xì)胞和其功能分子IL-22參與SLE和LN的發(fā)病和進(jìn)展。

    Th22細(xì)胞;IL-22;狼瘡性腎炎

    系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種自身免疫炎癥性疾病,多發(fā)于青年女性,其病因目前尚未完全確定,其臨床癥狀表現(xiàn)多樣,可侵襲機(jī)體多個器官組織,腎臟是 SLE 侵襲的主要器官之一,腎臟受累后多表現(xiàn)為腎炎,該疾病稱為狼瘡性腎炎(Lupus nephritis,LN)[1]。LN是SLE的主要并發(fā)癥和致死因素之一,發(fā)病期間,腎小球系膜細(xì)胞大量增生,眾多細(xì)胞因子在發(fā)病過程中參與并發(fā)揮了重要作用[2]。由于LN 發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜,有效評價LN 活動性,并給予正確對應(yīng)的治療方法對于改善患者預(yù)后,提高患者生存率極為重要。目前,診斷LN 及判斷其活動性的檢測金標(biāo)準(zhǔn)是腎穿刺活檢病理檢查,但由于其為有創(chuàng)方式,對患者存在或多或少的損害,或由于患者自身?xiàng)l件限制,不能進(jìn)行廣泛、反復(fù)應(yīng)用。因此,尋找能有效評判LN 活動性的新型指標(biāo)尤為重要。Th22細(xì)胞是一類輔助性T細(xì)胞,當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥或被感染時,能產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-22[3],作用于組織細(xì)胞,誘導(dǎo)產(chǎn)生急性期蛋白,輔助機(jī)體產(chǎn)生防御作用。IL-22屬于IL-10家族細(xì)胞因子,其受體包括IL-10R2和IL-22R1兩條鏈組成[4],IL-22結(jié)合特異性由IL-22R1決定[4]。IL-22作為一個獨(dú)特的細(xì)胞因子,多作用于機(jī)體組織細(xì)胞[4]。因其在自身免疫性疾病與炎性疾病中發(fā)揮著重要作用,近年來愈加受到研究者的重視,針對Th22及其細(xì)胞因子IL-22在皮膚病(如銀屑病、異位性皮炎等)[5]、炎性腸道疾病(克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎等)[6,7]、感染[8]、腫瘤[9]等疾病中的作用已開展相關(guān)性研究,而關(guān)于Th22細(xì)胞和IL-22在SLE 和LN 中的作用研究尚不多見。故本次研究通過檢測SLE患者外周血Th22和Th17細(xì)胞及其相關(guān)的細(xì)胞因子IL-17和IL-22的水平,并分析它們與疾病的關(guān)系,從明確Th22在狼瘡性腎炎中發(fā)揮的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 病例資料 收集2014年12月~2015年12月醫(yī)院腎臟內(nèi)科、風(fēng)濕科、皮膚科共 70例 SLE 住院患者血清,男18例,女52 例,年齡17~51歲?;颊咴\斷參照 2009年美國風(fēng)濕病協(xié)會(ACR)修訂的 關(guān)于SLE 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10],評分標(biāo)準(zhǔn)選用2000年SLE活動指數(shù)(SLE disease activity index,SLEDAI-2000)[11]。70 例患者中有 32 例經(jīng)腎活檢確診為LN且每例腎組織切片中至少有8個腎小球,設(shè)為LN組,其余38例患者設(shè)為SLE組。收集 10 例門診健康體檢者(各項(xiàng)生化指標(biāo)正常,自身抗體陰性,無腎臟疾病、皮膚病、糖尿病、高血壓、風(fēng)濕免疫等疾病)作為健康對照組(HC組),其中男 2例,女 8例,年齡 20~ 45歲。所有患者及健康志愿者3個月內(nèi)無免疫試劑使用史,研究對象均簽署知情同意書。本實(shí)驗(yàn)符合道德倫理委員會的要求,并均采集外周靜脈血以備實(shí)驗(yàn)。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 鼠抗人 IFNγ-FITC、鼠抗人IL-17-Alexa Fluor(美國 BD 公司);鼠抗人 CD4-PerCP(美國 Becton Dickinson);鼠抗人IL-22-PE(美國 minneapolis);人IL-22 ELISA 試劑盒(美國 R&D 公司);淋巴細(xì)胞分離液(中國科學(xué)院生物工程研究所-灝洋生物)。

    1.1.3 臨床資料收集 收集受試對象一般臨床資料,具體包括性別、年齡、發(fā)熱、皮疹、雷諾現(xiàn)象、關(guān)節(jié)疼痛等基本情況,SLEDAI 評分以及實(shí)驗(yàn)室檢測項(xiàng)目的檢測結(jié)果。實(shí)驗(yàn)室檢測項(xiàng)目包括:血常規(guī)、尿常規(guī)、抗雙鏈DNA 抗體(anti-double-stranded DNA,dsDNA)、抗 Sm 抗體、抗核抗體(antinuclear antibody,ANA)、超敏 C反應(yīng)蛋白(CRP)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、血清補(bǔ)體 C3、C4、免疫球蛋白等。

    1.2 方法

    1.2.1 淋巴細(xì)胞亞群檢測 采集SLE患者和健康志愿者2 ml肘靜脈血,用新鮮肝素鈉抗凝,1 500 r/min離心5 min去除血漿,吸取淋巴細(xì)胞分離液4 ml 放入10 ml 離心管中,1 700 r/min離心30 min后,吸取中間白膜層(即單核細(xì)和淋巴細(xì)胞富集層),放入恒溫箱繼續(xù)孵育 4 h。然后加入熒光標(biāo)記的表面抗體 anti-CD4-PerCP 4 μl,避光孵育30 min后去上清液,再向兩試管中分別加入破膜劑 B 50 μl,熒光標(biāo)記的抗體:anti-IFNγ-FITC、anti-IL-22-PE、anti-IL-17-Alexa Fluor 各 1 μl,24 h內(nèi)使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測。Th22細(xì)胞的標(biāo)記為IFN-γ-IL-17-IL-22+CD4+,Th1細(xì)胞標(biāo)記為 IFN+CD4+。

    1.2.2 細(xì)胞因子檢測 采用 ELISA(酶聯(lián)吸附法)檢測各組患者血清IL-22的含量,具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

    2 結(jié)果

    2.1 各組樣本的基本信息 HC組、SLE患者和LN患者的一般信息和臨床特點(diǎn)見表1。3組患者年齡、性別比較差異不明顯(P>0.05),SLE組和LN組CRP、ESR、WBC顯著高于HC組,而C3、C4顯著低于HC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而SLE組和LN組兩組間上述指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    2.2 各組患者Th1和Th22細(xì)胞測定結(jié)果 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測LN組、SLE組和健康對照組患者外周血Th1和Th22細(xì)胞的流式計(jì)數(shù)。SLE患者、LN患者以及健康對照組代表性流式圖及設(shè)門見圖1A。結(jié)果表明SLE組、LN組和健康對照組患者Th1細(xì)胞表達(dá)頻率分別為(SLE:10.07±0.27,LN:10.86±0.27,HC:10.13±0.45),3組之間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而Th22在LN組較SLE組要稍微高表達(dá)(6.92±0.47 vs 5.87±0.36,P=0.056),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩組患者Th22的表達(dá)頻率均較健康對照組(2.69±0.23)要高表達(dá),差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖1B。

    表1 各組患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室基本信息

    Tab.1 Clinical and laboratory characteristics of subjects

    ClinicalandlaboratorycharacteristicsHC(n=10)SLE(n=38)LN(n=32)Sex(M/F)2/87/3111/21Years(y)33.24±13.6735.67±10.2337.23±8.34SLEDAI(score)ND28±6.5133±10.24Anti-dsDNAnegative(n)ND3432Anti-Smnegative(n)ND1013ANAnegative(n)ND3028CRP(mg/L)7.2±3.4045.67±25.861)48.24±30.781)ESR(mm/h)2±1.8056±381)63±321)C3(U/ml)0.9±0.340.32±0.351)0.25±0.311)C4(U/ml)0.31±0.210.08±0.071)0.09±0.041)Whitebloodcell(×109L-1)4.24±2.317.28±3.651)8.56±4.311)

    Note:Compared with HC group,1)P<0.05.

    圖1 Th1和Th22細(xì)胞在SLE、LN和健康對照組外周血中的表達(dá)Fig.1 Frequencies of peripheral blood Th1 and Th22 cells in patients with SLE,LN and healthy controls

    圖2 各組患者血清IL-22的表達(dá)Fig.2 Plasma level of IL-22 in patients with LN,SLE and healthy controls

    2.3 各組患者血清IL-22水平 ELISA測定3組患者血清IL-22的表達(dá),見圖2。結(jié)果表明,LN組患者血清IL-22較SLE組升高,差異沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(59.92±2.69 vs 52.51±2.45,P=0.05);LN組和SLE組患者血清IL-22水平均較HC組(40.43±2.98)明顯升高,差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.4 Th22細(xì)胞與IL-22相關(guān)性分析 將LN患者Th22細(xì)胞表達(dá)頻率與血清IL-22的水平進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LN患者Th22細(xì)胞比例與血清IL-22水平呈正相關(guān)(r=0.80,P<0.001),見圖3。

    圖3 Th22細(xì)胞與血清IL-22水平相關(guān)性分析Fig.3 Correlation between Th22 cells and plasma IL-22 level in patients with LN

    圖4 Th22細(xì)胞比例和血清IL-22水平與患者SLEDAI評分相關(guān)性分析Fig.4 Correlation between Th22 or plasma IL-22 level and SELDAI in patients with LN

    2.5 Th22細(xì)胞和IL-22與SLEDAI評分相關(guān)性分析 我們進(jìn)一步對LN患者Th22細(xì)胞比例和IL-22血清水平與患者對應(yīng)的SLEDAI評分進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果表明Th22細(xì)胞比例與IL-22血清水平和SLEDAI評分均呈正相關(guān)(r=0.34、0.45,P<0.05),結(jié)果見圖4。

    3 討論

    SLE是一種累及多系統(tǒng)、多器官的自身免疫性疾病,身體的各個部位均可受損害,腎臟作為自身免疫性疾病的靶向器官,由于血管豐富,在血管壁上引起炎性反應(yīng),使腎臟成為SLE最易受累的臟器,形成LN[12]。目前,臨床上LN的治療主要采用給予激素和免疫抑制劑的方式,但只能使病情得到一定的緩解,而且有較大的毒副作用。因此,明確LN的發(fā)病機(jī)制,借此尋求有效治療措施有著重要的社會意義。

    LN是由多種免疫復(fù)合物沉積和激活而引發(fā)的一種腎炎。之前很多研究發(fā)現(xiàn),LN患者機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)主要是由機(jī)體炎癥因子和免疫因子共同激活引起的[13,14]。另外之前的研究發(fā)現(xiàn),由于疾病導(dǎo)致機(jī)體免疫炎癥紊亂,Th 細(xì)胞及其分泌的相應(yīng)功能性因子激活進(jìn)一步引起反應(yīng)性 B 細(xì)胞活化,致病性自身抗體和炎癥因子大量產(chǎn)生,最終導(dǎo)致患者組織和器官的損傷[15]。Th22細(xì)胞是學(xué)者們最近新發(fā)現(xiàn)的一種獨(dú)立Th 細(xì)胞亞群,能夠分泌功能性細(xì)胞因子IL-22[16]。Th22細(xì)胞在自身免疫病和炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用,主要通過Th22細(xì)胞激活后分泌大量的IL-22實(shí)現(xiàn)[17,18]。IL-22作用靶器官主要為患者皮膚和腎臟等,例如在銀屑病中,IL-22介導(dǎo)了患者的皮膚病病灶組織中的免疫細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞等上皮細(xì)胞間的相互作用[19]。根據(jù)以上理論基礎(chǔ),本課題比較了SLE、LN患者與健康對照之間Th22細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子IL-22表達(dá)水平的差異;分析了LN 患者Th22與相關(guān)細(xì)胞因子、疾病活動性和患者臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。

    我們的研究發(fā)現(xiàn)SLE患者和LN患者外周血中Th22細(xì)胞的表達(dá)頻率均明顯高于健康對照組。另外我們發(fā)現(xiàn)LN患者外周血中Th22細(xì)胞的比例較SLE患者要有所增高,目前的樣本分析差異沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而這也提示我們Th22細(xì)胞的表達(dá)頻率與SLE患者疾病的進(jìn)展和活動度有一定的關(guān)系。進(jìn)一步我們分析LN患者Th22細(xì)胞比例與對應(yīng)患者的疾病活動性評分SLEDAI之間呈正相關(guān)。同時我們檢測其功能分子IL-22,發(fā)現(xiàn)SLE、LN患者血清中IL-22的水平較健康對照組明顯升高,相應(yīng)的IL-22的血清水平在LN患者中較SLE患者要高。我們分析LN患者IL-22的水平與SLEDAI的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)IL-22的血清水平與SELDAI呈正相關(guān)。這些結(jié)果與Qin等[20]的研究一致。且這些研究告訴我們Th22細(xì)胞及其功能分子IL-22參與了SLE和LN疾病的發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制。

    綜上所述,本次研究初步分析了Th22細(xì)胞與IL-22在LN患者中的表達(dá),并且進(jìn)一步分析了Th22和IL-22與LN患者臨床疾病活動度SEDAI的關(guān)系,我們的研究為LN的發(fā)病機(jī)制提供了一些免疫方向的思索。接下來我們會進(jìn)一步研究是否能夠通過調(diào)節(jié)Th22細(xì)胞和IL-22改變 LN患者發(fā)病時以及疾病加重時異常的免疫狀態(tài),為 SLE或者LN 的防治提供新的治療靶點(diǎn)。

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    [收稿2016-10-26]

    (編輯 倪 鵬)

    Study on role of Th22 cells and its functional cytokine IL-22 in lupus nephritis

    GULi-Ping,YANGGui-Li,CHENYou-Fa,TAOShu-Chao.

    DepartmentofInternalMedicine,HospitalofWuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430065,China

    Objective:To observe the expressions of Th22 cells and IL-22 in peripheral blood of patients with Lupus nephritis (LN) and explore its significance.Methods: Patients of systemic lupus erythematosus (SLE) with no renal involvement (n=38),lupus nephritis (n=32) and healthy controls (n=10) were studied.Flow cytometry was utilized to quantify the percentage of Th22 cells in peripheral blood.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the levels of serum IL-22.The Th22 cells and The serum level of IL-22 among three groups were compared,and the correlation between Th22,IL-22 and SLE disease activity index score (SLEDAI) was analyzed.Results: Th22 cells in SLE group and LN group were significantly higher than those in healthy control group (P<0.01).Serum IL-22 level was also significantly higher than that of healthy control group (P<0.01);Th22 and IL-22 LN group were slightly higher than that in SLE group,but the difference was not significant (P>0.05).The proportion of Th22 cells and the level of IL-22 in LN group were positively correlated with the disease activity score SLEDAI.Conclusion: Th22 cells and IL-22 may play an important role in the pathogenesis of SLE and LN.

    Th22 cells;IL-22;Lupus nephritis

    10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.025

    顧麗萍(1966年-),女,主治醫(yī)師,主要從事內(nèi)科疾病的診治工作,E-mail:guliping487@163.com。

    R593.24+2

    A

    1000-484X(2017)05-0755-04

    ①通訊作者,E-mail:ygl473@163.com。

    ②武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院腎病科,武漢430070。

    ③棗陽市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,棗陽441200。

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