氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定培美曲塞二鈉起始原料中遺傳毒性雜質(zhì)甲磺酸乙酯

劉澤榮，李雪輝，曾 巧，陳 皓，2，張道林

（1.重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司，重慶 400061； 2.重慶大學(xué)，重慶 400030）

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定培美曲塞二鈉起始原料中遺傳毒性雜質(zhì)甲磺酸乙酯

劉澤榮1，李雪輝1，曾 巧1，陳 皓1，2，張道林1

（1.重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司，重慶 400061； 2.重慶大學(xué)，重慶 400030）

目的 建立測(cè)定培美曲塞二鈉起始原料中的遺傳毒性雜質(zhì)甲磺酸乙酯含量的氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（GC－MS）法。方法 采用GCMS法，以 N，N－二甲基甲酰胺為溶劑。用Agilent DB－624毛細(xì)管色譜柱（30mm×0.32 mm，1.8μm），以高純氦氣為流動(dòng)相，流速為3.0 mL／min（線速度為65 cm／s），柱溫為120℃維持2 min，以15℃ ／min的速率升溫至165℃；進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分離比為10∶1，進(jìn)樣口溫度為150℃；離子源采用Electron Impact（EI）電子轟擊源，掃描方式為選擇離子掃描模式（SIM）；檢測(cè)器電壓（相對(duì)值）為0 kV；接口溫度為200℃，離子源溫度為230℃；溶劑切除時(shí)間為2.5min；進(jìn)樣量為2μL。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。結(jié)果 甲磺酸乙酯測(cè)定的專屬性強(qiáng)，檢測(cè)限為0.11μg／g（S／N＝3），定量限為0.38μg／g（S／N＝10）；其質(zhì)量濃度在7.99～159.84 ng／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；平均加樣回收率為97.94%，RSD為3.85%（n＝9）；精密度的 RSD為8.52%（n＝6），重復(fù)性的 RSD為1.09%（n＝6）。結(jié)論 該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，適用于培美曲塞二鈉起始原料中遺傳毒性雜質(zhì)甲磺酸乙酯的測(cè)定。

氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法；培美曲塞二鈉起始原料；遺傳毒性雜質(zhì)；甲磺酸乙酯

遺傳毒性的雜質(zhì)（也曾譯為基因毒性雜質(zhì)），是指雜質(zhì)具有與遺傳物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的能力，且反應(yīng)后會(huì)誘導(dǎo)基因突變或?qū)е氯旧w重排／斷裂，故具有潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)。藥品研究和生產(chǎn)商協(xié)會(huì)（PhRMA）、歐洲藥物管理局（EMA）、美國食品藥物管理局(FDA)、人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）相繼發(fā)布了遺傳毒性雜質(zhì)研究指南[1－2]。馬磊等[3]對(duì)遺傳毒性致癌物和非遺傳毒性致癌物警示結(jié)構(gòu)進(jìn)行了歸納，甲磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate，EMS）被歸屬為遺傳毒性雜質(zhì)，有學(xué)者采用大鼠彗星試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了EMS的遺傳毒性[4－6]。培美曲塞二鈉（Pemetrexed disodium）為多靶位的葉酸拮抗劑，可用于治療惡性間皮瘤、非小細(xì)胞性肺癌、頭頸部癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等多種腫瘤。其由美國禮來公司開發(fā)，2004年4月率先獲得美國FDA批準(zhǔn)在美國上市。培美曲塞二鈉的起始原料，化學(xué)名為4－[3－（2，6－二氨基－1，4－二氫－4－氧代嘧啶－5－基）－4－硝基丁基]苯甲酸乙酯，根據(jù)其生產(chǎn)工藝，可能產(chǎn)生并殘留于起始原料中的遺傳毒性雜質(zhì)為EMS，該雜質(zhì)由制備中用到的物料甲磺酰氯與殘留的乙醇發(fā)生副反應(yīng)而產(chǎn)生。根據(jù)EMA指南，原料藥中遺傳毒性雜質(zhì)的限度為每天不超過1.5μg，而培美曲塞二鈉相應(yīng)制劑每日最大劑量約為1.0 g，由此可推算出培美曲塞二鈉原料藥中遺傳毒性雜質(zhì)的限度為1.5μg／g，因起始原料是培美曲塞二鈉原料藥的關(guān)鍵起始物料，故遺傳毒性雜質(zhì)的限度參照原料藥的要求執(zhí)行，即限度為1.5μg／g。本研究中GC－MS法測(cè)定培美曲塞二鈉起始原料中的遺傳毒性雜質(zhì)甲磺酸乙酯的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu GCMS－QP2010氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀[配置AOC－20i液體進(jìn)樣器，Electron Impact(EI)離子源及Shimadzu GCMSsolution數(shù)據(jù)工作站，日本島津制作所]；XS205 DU型電子天平（瑞士 Mettler Toledo公司）；Starter2100精密pH計(jì)（美國奧豪斯公司）。

1.2 試藥

起始原料（重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司，批號(hào) 為 PMD－140401，PMD－140701，PMD－140702，PMD－140801，PMD－140802）；EMS對(duì)照品（J＆K SCIENTIFICLTD，純度為99.4%）。兩者的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。N，N－二甲基甲酰胺為HPLC／ACS級(jí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 GC－M S條件

色譜柱為AgilentDB－624毛細(xì)管柱（30mm×0.32mm，1.8μm）；以高純氦氣為流動(dòng)相，流速為3.0m L／min（線速度65 cm／s），柱溫 120℃維持 2 min，以15℃ ／min的速率升溫至165℃；分流進(jìn)樣，分離比為10∶1，進(jìn)樣口溫度為150℃；離子源采用EI電子轟擊源，掃描方式為選擇離子掃描模式（SIM）；檢測(cè)器電壓（相對(duì)值）為0 kV；接口溫度為200℃，離子源溫度為230℃；溶劑切除時(shí)間為2.5min；進(jìn)樣量為2μL。定量離子為 m／z79，輔助定性離子為 m／z109。

圖1 起始原料及雜質(zhì)EMS化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2.2 溶液制備

空白溶液：N，N－二甲基甲酰胺溶液。

供試品溶液：取樣品約0.5 g，精密稱定，置10m L容量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺適量，超聲處理使溶解，用N，N－二甲基甲酰稀釋至刻度，搖勻，即得。

對(duì)照品溶液：取 EMS雜質(zhì)對(duì)照品適量，精密稱定，用N，N－二甲基甲酰溶解并定量稀釋成每1 mL中含雜質(zhì)EMS約15，30，50，75，100，150 ng／mL的對(duì)照品溶液。

2.3 測(cè)定方法

分別精密量取2.2項(xiàng)下供試品溶液與對(duì)照品溶液各2μL，分別注入氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀，記錄色譜圖。以對(duì)照品溶液中雜質(zhì)EMS的峰面積與濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計(jì)算，即得其含量。

2.4 定量離子選擇

取雜質(zhì)EMS對(duì)照品適量，用N，N－二甲基甲酰胺溶解，照2.1項(xiàng)下條件試驗(yàn)，取對(duì)照品溶液進(jìn)行單掃描（圖2和圖3），結(jié)果雜質(zhì)EMS總離子流峰處主要的離子碎片離子為 m／z79、m／z97、m／z109（裂解解析見圖4），其中 m／z79，m／z109離子的豐度較大，可作為定量離子。

圖2 EMS總離子流圖

圖3 RT3.69峰提取質(zhì)譜圖

圖4 EMS的裂解分析圖

圖5 定量離子確認(rèn)圖

雜質(zhì)EMS的裂解途徑分析進(jìn)一步證明，m／z 79、 m／z109為EMS特征碎片離子，且與譜庫NIST中檢出甲磺酸乙酯碎片離子一致。

2.5 定量離子的確定

取EMS對(duì)照品溶液適量，加N，N－二甲基甲酰胺稀釋制成每1 m L中約含15 ng的溶液，按2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，同時(shí)選擇 m／z 79、m／z 109離子采集信號(hào)，詳見圖 5。結(jié)果表明，m／z 79峰強(qiáng)度優(yōu)于 m／z 109，故選擇 m／z79為定量離子，同時(shí)將 m／z109作為輔助定性離子。

2.6 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下空白溶液、供試品溶液與對(duì)照品溶液（75 ng／mL）各2μL，注入GC－MS儀，記錄質(zhì)譜圖，詳見圖6。可見，雜質(zhì)EMS峰的保留時(shí)間約為3.7min，空白溶劑中無干擾峰出現(xiàn)，專屬性良好。

檢測(cè)限及定量限確定：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液2μL，注入GC－MS儀，記錄質(zhì)譜圖。以信噪比（S／N）等于3確定檢測(cè)限，S／N＝10確定定量限。雜質(zhì)EMS的檢測(cè)限約為0.11μg／g（相當(dāng)于供試品的量），定量限約為0.38μg／g（相當(dāng)于供試品的量），均遠(yuǎn)低于1.5μg／g的限度，方法靈敏度可滿足測(cè)定要求。

精密度試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下75 ng／mL的對(duì)照溶液2μL，注入GC－MS儀，連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為8.52%（≤15%），表明儀器精密度良好。

線性關(guān)系考察：取EMS雜質(zhì)對(duì)照品適量，精密稱定，用N，N－二甲基甲酰胺溶解并定量稀釋成每1m L中約含5μg的溶液作為貯備液，精密量取貯備液適量，用N，N－二甲基甲酰胺逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別約為7.99，15.98，39.96，79.92，119.88，159.84 ng／m L的對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（C，ng／mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A＝12.035 0C＋70.557 1，R＝0.998 7。結(jié)果表明，EMS質(zhì)量濃度在7.99～159.84μg／m L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，滿足定量要求。

重復(fù)性試驗(yàn)：取培美曲塞二鈉起始原料，照2.2項(xiàng)下方法配制供試品溶液與對(duì)照品溶液，重復(fù)配制6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果EMS含量的 RSD為1.09%（n＝6），詳見表1，表明方法重復(fù)性良好。

圖6 專屬性試驗(yàn)質(zhì)譜圖

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h時(shí)各精密量取2μL，注入GC－MS儀，記錄峰面積。結(jié)果供試品溶液主峰面積的 RSD為3.86% (n＝5)，供試品溶液在此條件下的8 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知EMS含量的培美曲塞鈉起始原料樣品（批號(hào)為PMD－140802）約0.5 g（EMS含量約為0.3μg／g，準(zhǔn)確含量以重復(fù)性均值為準(zhǔn)），精密稱定，置10mL容量瓶中，共9份，分別向其中加入一定量的雜質(zhì)EMS對(duì)照品溶液，加N，N－二甲基甲酰胺適量，超聲處理使溶解，再用N，N－二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，得3份供試品溶液中含雜質(zhì)EMS的質(zhì)量濃度，3份約為37.5 ng／m L（約為限度的50%），3份約為60 ng／m L（約為限度的80%），3份約為75 ng／m L（約為限度的100%），作為供試品溶液。照2.2項(xiàng)下方法配制對(duì)照品溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取供試品溶液，注入GC－MS儀，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各供試品中雜質(zhì)EMS的量，同時(shí)扣除培美曲塞鈉起始原料中的EMS的本底值（相當(dāng)于樣品含量），計(jì)算加樣回收率。結(jié)果雜質(zhì) EMS加樣回收率為 93.7%～104.5%，平均97.94%，RSD為3.85%（n＝9），滿足定量要求。詳見表2。

2.7 樣品含量測(cè)定

按2.1項(xiàng)下條件對(duì)5批樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3?？梢?，5批樣品中雜質(zhì)EMS含量均小于0.5μg／g，滿足質(zhì)量控制要求，且質(zhì)量穩(wěn)定。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

表3 5批樣品中EMS測(cè)定結(jié)果

3 討論

甲磺酸脂類的測(cè)定方法，主要有衍生化的氣相色譜法[7]、GC－MS法[8－9]、氣相色譜法[10－11]與液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（LC－MS）法[12]。與GC法、衍生化的氣相色譜法相比，本法的靈敏度更高，定量線性范圍更低，低至納克級(jí)；與衍生化方法相比，本法操作更簡便，對(duì)于限度極低的樣品中EMS的測(cè)定優(yōu)勢(shì)更明顯。LC－MS法液氮消耗較大，成本較高，本法則更經(jīng)濟(jì)。與其他類似的GC－MS法測(cè)定甲磺酸酯的方法相比，本法無需萃取，供試品溶解后直接進(jìn)樣，更簡便。

GC－MS法與GC法不同，需要待測(cè)物質(zhì)出峰避開溶劑切除時(shí)間，且溶劑切除時(shí)間一般不宜過短，在建立GC－MS法時(shí)應(yīng)注意。對(duì)于保留較弱的待測(cè)物，一般應(yīng)選擇內(nèi)徑小于0.32 mm的毛細(xì)管柱，因?yàn)閮?nèi)徑較大的色譜柱一般需要較大的線速度，不利于待測(cè)物的保留。直接進(jìn)樣的方式容易污染質(zhì)譜系統(tǒng)，筆者也曾嘗試采用頂空進(jìn)樣的方式測(cè)定EMS，但EMS較難揮發(fā)，檢測(cè)靈敏度不能滿足雜質(zhì)控制限度要求。另外，在單MS檢測(cè)條件下增加輔助定性離子可進(jìn)一步提高方法專屬性。

綜上所述，本研究中建立的GC－MS法準(zhǔn)確、簡便、快速、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，能有效測(cè)定培美曲塞二鈉的起始原料中的EMS，對(duì)于產(chǎn)品的質(zhì)量控制有重大意義。

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Determ ination of Genotoxicity Im purity Ethyl M ethanesulfonate in Starting M aterial of Pem etrexed Disodium by GC－M S

Liu Zerong1，Li Xuehui1，Zeng Qiao1，Chen Hao1，2，Zhang Daolin1
（1.Chongqing Pharmaceutical Research Institute Co.，Ltd.，Chongqing，China 400061； 2.Chongqing University，Chongqing，China 400030）

Ob jective To establish a GC－MS method for the determination of the genotoxic impurity ethyl methanesulfonate in starting material of Pemetrexed Disodium by GC－MS.M ethods GC－MS was conducted，and the samples were dissolved by N，N－Dimethylformamide.The column was Agilent DB－624（30 mm×0.32 mm，1.8μm）capillary column，the inlet temperature was 150℃，column flow was 3.0 mL／min（linear velocity was 65 cm／s），carrier gas was high purity helium，column temperature was set at 120℃，hold for 2 min，then increased to 165℃ at 15℃ ／min，split injection，split ratio was 10∶1，the detector is a mass spectrometer detector with a electron impact ion source，ion source temperature was 230℃，scanning（detection）method was selective ion monitoring，detector voltage was 0 kV（respect to the tuning results），the interface temperature was 200℃，the delay time of solvent was 2.5 min，the injection volume was 2μL，the concentration was calculated by standard curve.Resu lts The specificity of the method was good，the LOD and LOQ were 0.11μg／g（S／N＝3）and 0.38μg／g（S／N＝10）in starting material.The calibration curve was linear in the range of 7.99－159.84 ng／m L，the recoveries were 97.94%（n＝9），RSD was 3.85%（n＝6）.RSD of precision was 8.52%（n＝6），and RSD of repeatability was 1.09%（n＝6）.Conclusion The method has good specificity and high accuracy，which can be used to measure the genotoxic impurity ethyl methanesulfonate in starting material of Pemetrexed Disodium.

GC－MS；Pemetrexed Disodium starting material；genotoxic impurity；ethyl methanesulfonate

R914.1

A

1006－4931(2017)08－0021－05

2016－12－15；

2017－01－06)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.08.006

劉澤榮（1983－），男，碩士研究生，工程師，主要從事藥物分析及質(zhì)量研究，以及納米藥物質(zhì)控方法和結(jié)構(gòu)研究工作，（電話）023－62505966－846（電子信箱）ronzelau＠dingtalk.com。

張道林，男，碩士研究生，高級(jí)工程師，主要從事藥物分析及質(zhì)量研究工作，（電話）0 2 3－6 2 5 0 5 9 6 6－8 6 8（電子信箱）zhangdaolin＠cpri.com.cn。