清金固本膠囊質(zhì)量控制方法研究

李 玎，李 娜，張敏婕，陳 萍

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046； 2.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

·檢驗(yàn)檢測·

清金固本膠囊質(zhì)量控制方法研究

李 玎1，李 娜1，張敏婕1，陳 萍2

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046； 2.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

目的 控制清金固本膠囊的質(zhì)量。方法 采用薄層色譜法（TLC）對黃芩、桔梗、茯苓、防風(fēng)進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定黃芩苷的含量。結(jié)果 黃芩苷質(zhì)量濃度在4.1～32.8μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r＝0.999 9），平均回收率為95.85%，RSD為0.71%（n＝6）。結(jié)論 所建立的方法可為清金固本膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

清金固本膠囊；薄層色譜鑒別；高效液相色譜法；黃芩苷；含量測定；質(zhì)量控制

肺癌是支氣管黏膜或腺體的常見惡性腫瘤[1]，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的85% ～90%[2]。清金固本膠囊是陜西省中醫(yī)藥研究院研制的中藥復(fù)方制劑，由黃芩、桔梗、茯苓、防風(fēng)等10味藥組方，原為臨床經(jīng)驗(yàn)方，使用多年，具有益氣、清肺、化痰的功效，可用于治療氣虛、痰濕阻肺型非小細(xì)胞肺癌。本方以黃芩為君藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎功效[3]，其主要活性成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素，其中黃芩苷含量最高[4]。黃芩苷能體外誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞株 A 549凋亡[5]。韋小白等[6]的研究表明，黃芩苷能不同程度地降低肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的能力。桔梗能抗肺纖維化[7]，茯苓、防風(fēng)、黨參能提高免疫力[8－10]，均對肺癌的治療有增效作用。故本研究中以黃芩苷為本品的定量指標(biāo)，同時采用薄層色譜法（TLC）對方中黃芩、桔梗、茯苓、防風(fēng)等進(jìn)行定性鑒別?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－1260型高效液相色譜儀，包括G1311B型四元泵，G1329B型自動進(jìn)樣器，G1316A型柱溫箱，G4212B型二極管列檢測器，TCM柱溫控制器，LAB－open色譜數(shù)據(jù)工作站（美國安捷倫公司）；SK2200H型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；溶劑過濾器，SYNSV0000型純水機(jī)（美國默克密理博公司）；HH－S4型恒溫水浴鍋（上?？苽x器公司）；101型電熱鼓風(fēng)恒溫烘箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；BP211D型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

黃芩苷對照品（批號為913－9960），對照藥材黃芩（批號為 120955－200607）、桔梗（批號 121028－200608）、茯苓（批號為121117－200605）、防風(fēng)（批號為120947－200405）、黨參（批號為 121057－200805），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純；自制硅膠G、GF254板（薄層層析硅膠購自青島海洋化工有限公司）；水為超純水；樣品（規(guī)格為0.50 g／粒，批號為20150926，20151230，20160425）由陜西省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 黃芩

取樣品內(nèi)容物8 g，研細(xì)，加甲醇50mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 m L使溶解，加鹽酸調(diào)pH，用乙酸乙酯提取2次，每次20 m L，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?m L使溶解，即得供試品溶液；稱取黃芩對照藥材1 g，同法制成黃芩對照藥材溶液；取黃芩苷對照品適量，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液；按處方比例稱取除黃芩外的其他藥材適量，制成缺黃芩的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成缺黃芩的陰性對照品溶液。

按 2015年版《中國藥典（一部）》方法，照薄層色譜法（通則 0502）試驗(yàn)，取上述各溶液 10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水（5∶3∶1∶1）為展開劑，預(yù)飽和30min，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液。

供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。詳見圖1。

1，7.黃芩苷對照品溶液 2.黃芩對照藥材溶液3.陰性對照品溶液 4－6.供試品溶液圖1 黃芩薄層色譜圖

2.1.2 桔梗

取樣品內(nèi)容物8 g，研細(xì)，加7%硫酸乙醇－水（1∶3）混合溶液20mL，加熱回流3 h，放冷，用三氯甲烷提取2次，每次20m L，合并三氯甲烷液，用水洗滌2次，每次30mL，棄去洗液，三氯甲烷液用無水硫酸鈉脫水，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? m L使溶解，得供試品溶液；取桔梗對照藥材1 g，同法制成桔梗對照藥材溶液；按處方比例稱取除桔梗外的其他藥材，制成陰性對照品，按供試品溶液制備方法制成缺桔梗的陰性對照品溶液。

按2015年版《中國藥典（一部）》方法，照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，取上述各溶液10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G254薄層板上，以三氯甲烷－乙醚（2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液。

供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，故該方法納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。詳見圖2。

1，6.桔梗對照藥材溶液 2－4.供試品溶液5.陰性對照品溶液圖2 桔梗薄層色譜圖

2.1.3 茯苓

取樣品內(nèi)容物12 g，研細(xì)，加乙醚60m L，超聲處理30min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)訜o水乙醇1m L使溶解，即得供試品溶液；取茯苓對照藥材1 g，同法制成茯苓對照藥材溶液，按處方比例稱取除茯苓外的其他藥材適量，制成缺茯苓的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成缺茯苓的陰性對照品溶液。

按2015年版《中國藥典（一部）》方法，照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，取上述各溶液20μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙醚－石油醚（1∶1，30～60℃）為展開劑，預(yù)飽和30min，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

供試品溶液色譜中，在與茯苓對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，故該方法納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。詳見圖3。

2.1.4 防風(fēng)

取樣品內(nèi)容物5 g，加水100mL，用水飽和正丁醇15 m L提取2次，合并正丁醇液，用0.1 mol／L氫氧化鈉溶液洗滌2次，每次20 m L，棄去堿液，蒸干正丁醇液，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，即得供試品溶液；取防風(fēng)對照藥材1 g，同法制成防風(fēng)對照藥材溶液；按處方比例稱取除防風(fēng)外的其他藥材適量，制成缺防風(fēng)的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成缺防風(fēng)的陰性對照品溶液。

1，6.茯苓對照藥材溶液 2－4.供試品溶液5.陰性對照品溶液圖3 茯苓薄層色譜圖

按2015年版《中國藥典（一部）》，照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，取上述各溶液10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（12∶4∶3∶0.2）為展開劑，預(yù)飽和30min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

供試品溶液色譜中，在與防風(fēng)對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，故該方法納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。詳見圖4。

1，6.防風(fēng)對照藥材溶液 2－4.供試品溶液5.陰性對照品溶液圖4 防風(fēng)薄層色譜圖

2.1.5 黨參

取樣品內(nèi)容物6 g，加甲醇30m L，回流提取1.5 h，濾過，濾液揮干，殘?jiān)颖?m L使溶解，即得供試品溶液；取黨參對照藥材1 g，同法制成黨參對照藥材溶液；按處方比例稱取除黨參外的其他藥材適量，制成缺黨參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成缺黨參的陰性對照品溶液。

按2015年版《中國藥典（一部）》，照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，取上述各溶液10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－冰醋酸－水（15∶10∶1∶0.5）為展開劑，預(yù)飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以磷鉬酸乙醇溶液，于105℃加熱顯色。

供試品溶液色譜中，在與黨參對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，故該方法納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。詳見圖5。

1.黨參對照藥材溶液 2－4.供試品溶液5.陰性對照品溶液圖5 黨參薄層色譜圖

2.2 黃芩苷含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：KromasilC18不銹鋼色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇－水－冰醋酸（46∶54∶1）；流速：1.0 mL／min；柱溫：（30.0±0.5）℃。經(jīng)紫外光譜于190～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果黃芩苷在276 nm波長處有最大吸收，故確定檢測波長為276 nm。在此色譜條件下，測得供試品溶液中黃芩苷色譜峰可以基本達(dá)到基線分離，黃芩苷色譜峰理論板數(shù)（N）大于2 000，拖尾因子（T）為1.01，與相鄰峰的分離度大于1.5。

2.2.2 溶液制備

精密稱取黃芩苷對照品，置 50 mL容量瓶中，加70%甲醇溶解，定容至刻度，即得對照品溶液；取本品內(nèi)容物 1.0 g，精密稱定，置 100 mL具塞三角瓶中，加70%甲醇適量，加熱回流，提取2次，每次1 h，取出，濾過，合并濾液，加70%甲醇定容于100m L容量瓶中，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得供試品溶液。

圖6 黃芩苷高效液相色譜圖

2.2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：按處方比例，照本品制備工藝，制成不含黃芩的陰性對照品樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。精密吸取5μL，注入液相色譜儀。結(jié)果其色譜圖在黃芩苷峰位置上無色譜峰出現(xiàn)，陰性對照無干擾。詳見圖6。

線性關(guān)系考察：精密稱取黃芩苷對照品，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.082 g／L的溶液，作為對照品溶液。精密吸取對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0m L，加70%甲醇定溶于10 m L容量瓶中，均進(jìn)樣10μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝1.981 878X＋1.198 434，r＝0.996 7（n＝6）。結(jié)果表明，黃芩苷質(zhì)量濃度在 4.1～41.0μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：分別吸取上述對照品溶液與供試品溶液各10μL，分別重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果對照品溶液色譜峰面積的 RSD為0.48%（n＝6），供試品溶液色譜峰面積的 RSD為0.66%（n＝6），表明儀器精密度良好。

表1 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg／粒，n＝2）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份供試品溶液，分別于0，1，3，6，12，24 h時按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果黃芩苷峰面積的 RSD為1.59%（n＝6），供試品溶液在6 h以前穩(wěn)定性良好，10 h和24 h峰面積的變化無規(guī)律性，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品6份，按擬訂方法進(jìn)樣測定，并計算含量。結(jié)果平均含量為每粒0.87mg，RSD為3.63%（n＝6），表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品粉末約200mg，共6份，精密稱定，分別置100m L容量瓶中，分別精密加入黃芩苷對照品溶液（0.82 g／L）0.5，1.0m L，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，并計算回收率。結(jié)果平均回收率為95.84%，RSD為0.7%（n＝6）。詳見表1。

2.2.4 樣品含量測定及限度確定

取3批樣品各2份，依法制備供試品溶液，并進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2。根據(jù)3批樣品測定結(jié)果，暫定本品每粒含黃芩以黃芩苷（C21H18O11）計不得少于0.90mg。

3 討論

本研究中對方中枳殼、陳皮、白術(shù)、夏枯草進(jìn)行了薄層色譜鑒別，但陰性樣品存在干擾，暫不能納入標(biāo)準(zhǔn)，故有待進(jìn)一步研究。

有關(guān)黃芩苷的測定，依據(jù)黃芩苷理化性質(zhì)及查閱文獻(xiàn)[11－15]，本研究中分別采用熱回流、超聲方法。結(jié)果表明，回流比超聲測得黃芩苷含量更高，確定以70%甲醇回流提取60min，提取率最高，且其他組分干擾小。

[1]張亞琨，郭其森.非小細(xì)胞肺癌的化療進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2011，15（1）：40－42.

[2]Chang JTH，Lee YM，Huang RS.The impactof the Cancer Genome Atlas on lung cancer[J].Translational Research，2015，166（6）：568－585.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：301.

[4]王宏志，喻春皓，高 鈞，等.HPLC分析比較炮制和提取方法對黃芩活性成分的影響[J].中國中藥雜志，2007，32（16）：1637.

[5]鄭海峰，王英妹，武鐵軍，等.黃芩苷對人肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用及相關(guān)機(jī)制[J].中成藥，2012，34（11）：2214－2216.

[6]韋小白，董競成.黃芩苷對人肺腺癌LTEP－A2細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制研究[J].世界中醫(yī)藥，2014，9（2）：213－217.

[7]于維穎，祝紅杰.桔梗治療支氣管哮喘的藥理機(jī)制研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2012，40（3）：38－40.

[8]劉媛媛，陳友香，侯安繼.羥甲基茯苓多糖對小鼠 T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響[J].中藥藥理與臨床，2006，22（3／4）：71－72.

[9]王 玲.防風(fēng)對免度功能的影響[J].實(shí)用醫(yī)技，1999，6（2）：139.

[10]張華榮，姜國輝.黨參的藥理與臨床研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息，1996(5)：17－21.

[11]張冬梅，桑 媛，劉 冰.HPLC法同時測定雙黃連注射液中綠原酸及黃芩苷含量[J].藥物分析雜志，2005，25（10）：1279－1280.

[12]郭 忠.雙黃連制劑含量分析方法綜述[J].中國藥事，2004，18（3）：194－196.

[13]王 猛，高景會.HPLC法測定清熱解毒片中黃芩苷的含量[J].黑龍江醫(yī)藥，2015，28（2）：219－221.

[14]陳葉青，陳凡凡，金佩芬，等.HPLC法測定通竅耳聾丸中橙皮苷和黃芩苷的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2015，31（4）：324－326.

[15]張淑瑜，于燕莉，畢云生，等.退燒顆粒中黃芩苷的成分鑒別和含量測定[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2015，31（1）：65－67.

Quality Control of Qingjinguben Capsule

Li Ding1，Li Na1，Zhang Minjie1，Chen Ping2
（1.Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi，China 712046； 2.Shaanxi Province Chinese Medicine Research Institute，Xi′an，Shaanxi，China 710003）

Ob jective To control the quality of Qingjinguben Capsule.M ethods TLC method was used to identify Scutellariae Radix，Platycodonis Radix，Poria，Saposhnikoviae Radix，Codonopsis.The content of baicalin was determined by HPLC.Results The chromatographic spots were clear with good separation，the chromatogram for identification by TLC was distinct and highly specific.The linear range was 4.1－32.8μg／m l（r＝0.999 9），the average recovery rate was 95.85%，RSD was 0.71%（n＝6）.Conclusion The method can provide reference for the establishment of quality standard of Qingjinguben Capsule.

Qingjinguben Capsule；TLC；HPLC；baicalin；content determination；quality contorl

R284.1

A

1006－4931(2017)08－0012－05

2016－12－08；

2017－01－22)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.08.004

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項(xiàng)目[2 0 1 2 JM4 0 5 3]。

李玎（1992－），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹苿┕に嚰百|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，（電子信箱）lidingle19＠163.com。

陳萍（1 9 6 4－），女，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥化學(xué)與中藥新藥研究，（電子信箱）c p 3 0 4 9 0 3 3＠1 6 3.c om。