HPLC—ELSD法測定不同儲存時(shí)間黨參藥材中果糖、葡萄糖和蔗糖的含量

劉和平+++周光雄++許彥+++尚強(qiáng)+++高進(jìn)++陸文岐

[摘要] 目的 建立黨參藥材中果糖、葡萄糖和蔗糖高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（HPLC-ELSD）含量測定的方法，并測定不同儲存時(shí)間的黨參果糖、葡萄糖和蔗糖的含量。方法 采用80%甲醇超聲提取，通過HPLC-ELSD法測定不同儲存時(shí)間的黨參中果糖、葡萄糖和蔗糖的含量。色譜條件：Shodex Asahipak NH2P-50 4E（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-水（77∶23）為流動相，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，ELSD檢測器。結(jié)果 通過實(shí)驗(yàn)，不同儲存時(shí)間的黨參中果糖、葡萄糖和蔗糖均能很好分離，線性范圍和相關(guān)系數(shù)分別為2.409～24.09 μg（r = 0.9999）、1.456～14.56 μg（r = 0.9995）、1.15～11.50 μg（r = 0.9999），平均回收率分別為103.73%（RSD = 0.26%）、97.85%（RSD = 1.98%）、99.08%（RSD = 1.09%）。結(jié)論 表明該方法簡便，穩(wěn)定性、重復(fù)性、分離度好，可用于黨參中果糖、葡萄糖和蔗糖含量分析，儲存0、3、6、12個月的不同時(shí)間黨參中果糖、葡萄糖和蔗糖含量差異明顯。

[關(guān)鍵詞] 黨參；果糖；葡萄糖；蔗糖；HPLC-ELSD；含量測定

[中圖分類號] R931.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（c）-0138-04

[Abstract] Objective To establish a HPLC-ELSD determination method of fructose， glucose and sucrose in Codonopsis pilosula， and to determine the content of fructose， glucose and sucrose of Codonopsis pilosula in different storage times. Methods The sample solutions made by ultrasonic extraction of 80% methanol solution were used to determine the contents of fructose， glucose and sucrose of Codonopsis pilosula in different storage times by HPLC-ELSD. The analysis was performed on a Shodex Asahipak NH2P-50 4E column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） with a gradient elution of acetonitrile-water （77∶23） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 25℃. It was determined by ELSD detector. Results The methodological studies showed that fructose， glucose and sucrose of Codonopsis pilosula in different storage times were in good linearity from 2.409 to 24.09 μg （r = 0.9999）， 1.456 to 14.56 μg（r = 0.9995）， 1.15 to 11.50 μg （r = 0.9999） respectively. The average recoveries of the three components were 103.73% （RSD = 0.26%）， 97.85% （RSD = 1.98%） and 99.08% （RSD = 1.09%）， respectively. Conclusion The results show that the method is convenient， stable， reproducible and well separated. It can be used to determine fructose， glucose and sucrose in Codonopsis pilosula. The content of fructose， glucose and sucrose in Codonopsis pilosula of different storage times（0， 3， 6， 12 months） are different obviously.

[Key words] Codonopsis Radix； Fructose； Glucose； Sucrose； HPLC-ELSD； Assay

黨參來源于桔?？浦参稂h參Codonopsis Pilosula （Franch.）Nannf.、素花黨參Codonopsis pilosula Nannf. var. modesta（Nannf.）L. T. Shen 或川黨參Codonopsis tangshen Oliv. 的干燥根[1]。黨參根據(jù)產(chǎn)地分為西黨參、東黨參和潞黨參等[2]。黨參所含主要化學(xué)成分有苷類、糖類、甾醇、膽堿、生物堿、木質(zhì)素、三萜等[3-9]。文獻(xiàn)報(bào)道[10-16]，黨參糖類成分為黨參具有滋補(bǔ)功效的有效成分之一，具有調(diào)節(jié)血液系統(tǒng)、抗癌、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗細(xì)胞毒性等免疫增強(qiáng)的功效。由于黨參藥材中果糖、葡萄糖、蔗糖含量很高，在儲存過程中容易發(fā)生糖的轉(zhuǎn)化與降解以及容易發(fā)生霉變等過程中造成糖的損失。有文獻(xiàn)報(bào)道了黨參不同儲存時(shí)間的質(zhì)量考察研究，但該研究只考察了氣味、顏色、霉變等指標(biāo)，沒有考察指標(biāo)性成分和糖類成分的含量變化[17]?！吨袊幍洹?015年版黨參項(xiàng)下未建立含量測定項(xiàng)，也未見有文獻(xiàn)報(bào)道同時(shí)測定黨參藥材中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量。本文首次建立了HPLC-ELSD法測定果糖、葡萄糖、蔗糖含量的一針同時(shí)測定3個指標(biāo)成分的方法，可用于黨參藥材的質(zhì)量評價(jià)，研究的不同儲存時(shí)間黨參中果糖、葡萄糖、蔗糖含量差異明顯，為黨參藥材的儲存期提數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

Agilent 1260快速高效液相色譜儀（美國安捷倫），KQ-500VDE超聲清洗器，CPA225D電子天平（德國賽多利斯）。甲醇、乙腈為Merck色譜純，水為自制超純水，其他試劑均為分析純。果糖、葡萄糖、蔗糖化學(xué)對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100231-201305、110833-200904、111507-201303）。3批黨參藥材收集于道地產(chǎn)區(qū)甘肅省隴西縣種植基地，經(jīng)國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心主任曹暉研究員鑒定為桔梗科植物黨參Codonopsis Pilosula（Franch.） Nannf.，俗稱白條黨參，憑證標(biāo)本存于本中心生藥標(biāo)本室。根據(jù)黨參藥材儲存特性，將3批黨參藥材儲存于20℃左右的陰涼庫中，分別在第0、3、6、12個月取樣測定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E （250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（77∶23）；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min； ELSD檢測器：溫度45℃，載氣為空氣，壓力0.5 kPa，分離度不低于1.5，理論塔板數(shù)以果糖計(jì)不低于6000（圖1）， 測定法：照高效液相色譜法（《中國藥典》2015年版通則0512）測定，精密吸取對照品溶液2.5、10 μL，供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀，測定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計(jì)算，即得。

2.2 對照品溶液制備

取果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖化學(xué)對照品適量，精密稱定，加水適量溶解置20 mL容量瓶中，再加水至刻度，分別制成每1 mL含2.3 mg的果糖溶液、每1 mL含0.7 mg的D-無水葡萄糖溶液、每1 mL含0.5 mg的蔗糖溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取黨參藥材切厚片后粉碎成粗粉，取粉末2 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶內(nèi)， 精密加50 mL 80%乙醇，稱重，超聲（45 kHz，600 W）提取30 min，放至室溫，用80%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密移取續(xù)濾液5 mL至25 mL容量瓶內(nèi)，加80%乙醇至刻度，搖勻，過微孔濾膜（0.45 μm），即得。

2.4 供試液制備方法考察

2.4.1 提取方式考察 取同一黨參藥材粉末2 g，精密稱定，平行2份，精密加50 mL 80%乙醇，一份超聲提取30 min，另一份回流提1 h，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果超聲提取與回流提取無顯著性差異，超聲提取操作簡便，故選超聲提取。

2.4.2 提取溶劑考察 取同一黨參藥材粉末2 g，精密稱定，平行3份，分別精密加50 mL 60%乙醇、80%乙醇和95%乙醇，按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備樣品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果三種提取溶劑無顯著性差異，80%乙醇提取率略高，故選80%乙醇。

2.4.3 提取時(shí)間考察 取同一黨參藥材粉末2 g，精密稱定，平行3份，按“2.3”項(xiàng)下方法分別超聲15、30、60 min制備樣品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果表明超聲處理30 min，基本可以提取完全，故選用超聲30 min。

2.4.4 提取溶劑用量考察 取同一黨參藥材粉末2 g，精密稱定，平行3份，按“2.3”項(xiàng)下方法分別加25、50、75 mL的溶劑，制備樣品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果表明，用50 mL提取溶劑基本可以提取完全，故選用50 mL溶劑。

2.4.5 提取次數(shù)考察 取同一黨參藥材粉末2 g，按“2.3”項(xiàng)下方法超聲1次后，藥渣再加溶劑超聲第2次，分別制備溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，第二次提取液測得的峰面積為兩次結(jié)果之和的1.28%，表明超聲1次，基本可以提取完全，故選用超聲1次。

2.5 色譜條件的優(yōu)化及方法學(xué)考察

2.5.1 柱溫 相同條件下分別比較了不同柱溫15、20、25、30、35℃，結(jié)果表明，25℃時(shí)主要色譜峰分離度及響應(yīng)值最佳。

2.5.2 流速 相同條件下分別比較了0.8、1.0、1.2 mL/min的流速，結(jié)果表明，流速為1.0 mL/min時(shí)主要色譜峰分離度較佳。

2.5.3 流動相耐受性 相同條件下改變流動相比例 ±5%，試驗(yàn)結(jié)果表明流動相耐受性良好。

2.5.4儀器精密度 取同一份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖峰面積RSD分別為1.48%、2.83%、3.33%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液和對照品溶液，分別在0、1、3、6、12、24、48 h不同時(shí)間按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，測得樣品48 h內(nèi)的果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖峰面積RSD分別為2.39%、2.60%、3.69%，對照品RSD分別為1.58%、1.96%、2.63%，表明供試品溶液和對照品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一黨參藥材粉末2 g，平行6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，測得果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖含量的RSD分別為1.63%、0.87%、1.06%，結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

2.5.7線性關(guān)系考察 分別精密吸取濃度為2.4090 mg/mL的果糖、濃度為1.4560 mg/mL的葡萄糖以及濃度為1.1500 mg/mL的蔗糖對照品溶液各1、2、4、6、8、10 μL，注入液相色譜儀中測定。以進(jìn)樣量（μg）的對數(shù)對峰面積的對數(shù)進(jìn)行線性回歸，分別得到線性方程，果糖：Y = 1.5054 X + 2.1198，r = 0.9999；葡萄糖：Y = 1.4865 X + 2.1383，r = 0.9995；蔗糖：Y = 1.6410 X + 2.0971，r = 0.9999。結(jié)果表明，果糖在2.409 ～ 24.09 μg范圍內(nèi)，葡萄糖在1.456 ～ 14.56 μg范圍內(nèi)，蔗糖在1.15 ～ 11.50 μg范圍內(nèi)，均呈良好的線性關(guān)系，定量限度分別為1.2045、0.72、0.575 μg。

2.5.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取同一黨參藥材粉末1 g，平行6份，以100%水平分別加樣果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下條件測定，果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖的加樣平均回收率均在97%～103%之間，RSD均<2%，結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度良好（表1）。

2.6 樣品測定

將3批黨參藥材儲存于20℃左右的陰涼庫中，分別在第0、3、6、12個月取樣，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，同時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，不同儲存時(shí)間的樣品測定結(jié)果見表 2。不同儲存時(shí)間的樣本中果糖、葡萄糖和蔗糖含量差異明顯，葡萄糖隨著儲存時(shí)間的延長，逐步下降，并達(dá)到一個平衡值；蔗糖隨著儲存時(shí)間的延長，逐步下降，儲存12個月后在“2.1”項(xiàng)色譜條件下基本檢測不出；果糖隨著儲存時(shí)間的延長，先下降后上升，儲存12個月后含量最高。

3 討論

黨參藥材中的多糖隨著存放時(shí)間的延長，可以部分轉(zhuǎn)化為單糖，同時(shí)，隨著黨參藥材的儲存時(shí)間的延長，單糖的含量也會因破壞隨之下降，黨參藥材中單糖的含量實(shí)際上是這兩種轉(zhuǎn)化的動態(tài)平衡結(jié)果。從單糖含量-時(shí)間變化趨勢可知：果糖儲存3個月含量逐步下降，6個月之后含量再逐步增加，12個月達(dá)到最高，含量呈先下降后升高的趨勢，表明果糖隨著儲存時(shí)間的增加，多糖轉(zhuǎn)化成果糖的量多于破壞的量，果糖含量逐步增加；葡萄糖儲存3～6個月后葡萄糖平均下降了70%，6個月之后到葡萄糖含量基本不再下降，達(dá)到一個轉(zhuǎn)化與破壞的動態(tài)平衡；蔗糖的含量隨著儲存時(shí)間的增加而逐步下降，6個月后蔗糖平均下降了60%，12個月后基本檢不出蔗糖，表明蔗糖儲存6個月后逐步轉(zhuǎn)化為果糖和葡萄糖。黨參藥材中多糖轉(zhuǎn)化為蔗糖、果糖和葡萄糖存在著復(fù)雜的過程，我們將進(jìn)一步探討其轉(zhuǎn)化的機(jī)制。

文獻(xiàn)報(bào)道[18-20]，黨參糖類的檢測方法主要有薄層色譜-掃描法（TLC）、紫外分光光度法（UV）、滴定法來測定黨參多糖總含量和單糖總含量，方法準(zhǔn)確性差。也有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜峰紫外末端吸收（200 nm）和高效液相示差檢測器（HPLC-RID）測定單糖的含量[21]，雖然單糖及雙糖有末端吸收，也可采用HPLC-UV法測定，但響應(yīng)值低，準(zhǔn)確度差；示差折光檢測法受溫度等外界條件影響較大，方法穩(wěn)定性差、基線噪聲大。本文建立的ELSD檢測法，作為一種通用型質(zhì)量檢測器，對溫度變化不敏感，基線穩(wěn)定，方法重復(fù)性好。

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（收稿日期：2017-01-15 本文編輯：王 麗）