婦舒保凝膠的質(zhì)量標準研究

錢偉++蔣志濤++潘金火++楊銳++張月嬋

[摘要] 目的 建立婦舒保凝膠的質(zhì)量標準。方法 TLC法用于鑒別黃柏、苦參、大黃；采用HPLC法測定處方中大黃的主要成分大黃酸、大黃素甲醚和黃柏的主要成分鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果 黃柏、苦參、大黃的薄層斑點清晰，陰性無干擾；大黃酸、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿分別在5～30、4.19～25.14、14.58～174.99 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，含量分別為0.0277、0.0249、8.709 mg/g，方法加樣回收率分別為98.37%、98.1%、97.9%。結(jié)論 本試驗結(jié)果可靠，方法可行，可作為婦舒保凝膠的質(zhì)量控制方法。

[關(guān)鍵詞] 婦舒保凝膠；TLC；鹽酸小檗堿；大黃酸；大黃素甲醚；HPLC

[中圖分類號]R944 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（c）-0142-05

[Abstract] Objective To establish the quality standard of Fushubao Gel. Methods Phellodendri Chinensis Cortex， Sophorae Flavescentis Radix， Rhei Radix et Rhizome were identified by TLC. The contents of Hydrochloric acid Berberine， Rhein and physcion were determined by HPLC. Results The TLC spots were clear and the blank test showed no interference. The linear ranges of Hydrochloric acid Berberine， Rhein and physcion were 5-30， 4.19-25.14， 14.58-174.99 μg/mL respectively. The content were 0.0277， 0.0249， 8.709 mg/g. The recoveries were 98.37%， 98.1%， 97.9% respectively. Conclusion The method is reliable and accurate，and can be applied as the quanlity control method for Fushubao Gel.

[Key words] Fushubao Gel； TLC； Hydrochloric acid Berberine； Rhein； Physcion； HPLC

婦舒保凝膠處方來源于江蘇省中醫(yī)院臨床驗方，處方組成為：黃柏、苦參、大黃、虎杖、五倍子、冰片等10味中藥。經(jīng)過長期的臨床實踐，證明本方具有清熱燥濕、涼血活血、祛腐生肌、收斂止血之效，臨床用于治療衣原體、支原體感染以及宮頸炎、宮頸糜爛、陰道炎等[1-2]。婦舒保凝膠是采用水溶性基質(zhì)，將中藥飲片經(jīng)過提取精制的藥粉，加適宜附加劑而制成的中藥凝膠劑[3-5]。凝膠劑是一種適用于中藥外用的理想劑型，有較好的生物相容性，無油膩感，有利于藥物的釋放。我們對該制劑進行開發(fā)研究，本試驗建立了該制劑的質(zhì)量標準。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters2695 高效液相色譜儀，Waters 2998 紫外檢測器，Empower 色譜工作站；AUX220 分析天平（SHIMADZU）；800型電動離心沉淀機（江蘇省江陰市保利科研器械有限公司制造）；薄層色譜成像系統(tǒng)（大昌華嘉商業(yè)（中國）有限公司）；Drict-Q5超純水機（法國Millipore公司）。

1.2 材料

鹽酸小檗堿（批號：110713-200911），苦參堿（批號：111575-200502），大黃素（批號：110756-200110），大黃酸（批號：110757-200206），大黃素甲醚（批號：110758-201013），蘆薈大黃素（批號：110795-200605），大黃酚（批號：110796-200309），以上對照品均購買自中國食品藥品檢定研究院。處方中所有中藥飲片均來自于張家港市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，符合2015年版《中國藥典》一部項下規(guī)定。甲醇、乙腈均為色譜純，購自德國默克；水為超純水；其余所用化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1黃柏的鑒別

2.1.1.1對照品溶液 用甲醇配制鹽酸小檗堿對照品，制成約0.5 mg/mL的標準品溶液。

2.1.1.2供試品溶液 分別精密稱取婦舒保凝膠（3個不同批號）各0.5 g，用10%NaCl溶液1 mL進行沉析后加甲醇10 mL，超聲10 min（頻率為40 kHz，功率為250 W），取出，濾過，溶劑蒸干，殘渣加1 mL甲醇配制成供試品溶液。

2.1.1.3陰性對照液 按照處方配比取除黃柏以外的其他藥材共0.2 g，用與供試品制備相同方法，制備陰性對照液。

2.1.1.4 薄層鑒別 吸取上述各種溶液5 μL，在同一塊硅膠G板點板，展開劑為苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5），并置氨蒸氣飽和缸內(nèi)展開，置365 nm紫外燈下檢視[6]。結(jié)果黃柏供試品與其對照藥材、對照品在相對應(yīng)位置處顯同樣熒光斑點，而陰性對照液在相應(yīng)位置無此斑點。

2.1.2 苦參的鑒別

2.1.2.1對照品溶液 取苦參堿對照品，加甲醇制成約1.0 mg/mL的標準品溶液。

2.1.2.2供試品溶液 分別精密稱取婦舒保凝膠（3個不同批號）各1 g，加入10%NaCl溶液1 mL，沉析，再加入氯仿30 mL和濃氨試液0.6 mL，超聲20 min（頻率為40 kHz，功率為250 W），過濾得續(xù)濾液，取20 mL揮干，殘渣加氯仿1 mL制成供試品溶液。

2.1.2.3陰性對照液 按照處方配比取除苦參以外的其他藥材共0.2 g，用供試品相同方法制備陰性對照液。

2.1.2.4薄層鑒別 吸取上述各種溶液5 μL，在同一塊硅膠G板點板展開，展開劑為苯-醋酸乙酯-丙酮 -濃氨（2∶4∶3∶0.1），取出晾干，噴碘化鉍鉀顯色，檢視[7]。結(jié)果供試品、對照品在同一位置顯紅褐色斑點，陰性對照在相應(yīng)位置沒有此斑點。

2.1.3大黃的鑒別

2.1.3.1對照品溶液 分別取對照品（大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素和大黃素甲醚）適量，加甲醇配制成約0.5 mg/mL的標準品溶液。

2.1.3.2供試品溶液 分別精密稱取婦舒保凝膠（3個不同批號）各1 g，加入10%NaCl溶液1 mL，沉析，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，超聲10 min（頻率40 kHz，功率250 W），取出，過濾得續(xù)濾液，將其中溶劑蒸干，殘渣加水10 mL、鹽酸1 mL，加熱30 min后置冰水中迅速冷卻，加乙醚萃取（2次，10 mL/次），合并乙醚液，繼續(xù)蒸干，殘渣加1 mL氯仿制成供試品溶液。

2.1.3.3陰性對照液 按照處方配比取除大黃以外的其他藥材共0.2 g，用供試品相同方法制備陰性對照液。

2.1.3.4薄層鑒別 吸取上述各種溶液5 μL，在同一硅膠H薄層板上點樣，薄層板以羧甲基纖維鈉為黏合劑，展開劑為石油醚-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1），展開，取出晾干，檢視[8-9]。結(jié)果大黃供試品、對照藥材在同樣位置顯5個同樣的橙黃色斑點；并與對照品在同樣位置上顯同樣的橙黃色斑點。

2.2含量測定

2.2.1鹽酸小檗堿的含量測定

2.2.1.1色譜條件 SunFire C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相為乙腈（25%）-0.05%磷酸二氫鉀（75%），檢測波長為345 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃[10]。

2.2.1.2 供試品溶液制備 取婦舒保凝膠樣品1.0 g，精密稱定，置具塞平底燒瓶中，加入10%的NaCl 10 mL，用力振搖，使沉析，過濾得續(xù)濾液，加入10 mL 1%鹽酸甲醇溶液，超聲10 min（頻率為40 kHz，功率為250 W），定容于50 mL量瓶中，濾過，取續(xù)濾液1 mL，揮去溶劑后加甲醇定容至10 mL量瓶中，即得供試樣品溶液[11-12]。

2.2.1.3對照品的制備 取鹽酸小檗堿對照品，精密稱定，加甲醇制得291.65 μg/mL的對照品溶液。

2.2.1.4線性關(guān)系的考察 精密吸取上述鹽酸小檗堿對照品溶液適量，加甲醇配制成鹽酸小檗堿濃度為14.58、29.16、58.33、87.49、116.66、174.99 μg/mL的對照品溶液，分別吸取上述溶液5 μL注入HPLC色譜儀中按“2.2.1.1”項下色譜條件測定，以峰面積（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸，得標準曲線方程：A=16 144C-40 321，r=0.9994，結(jié)果表明鹽酸小檗堿在14.58～174.99 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.1.5精密度考察 精密吸取291.65 μg/mL對照品溶液5 μL，按色譜條件在24 h內(nèi)連續(xù)進樣6次和6 d內(nèi)同一時間進樣6次，測定峰面積，并計算RSD。結(jié)果RSD（日間）=1.28%，RSD（日內(nèi)）=1.21%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.1.6穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液5 μL，按“2.2.1.1”色譜條件分別在0、2、4、6、8、12 h測定，并計算相對標準偏差（RSD）。結(jié)果鹽酸小檗堿的峰面積RSD值為1.41%（n=6），試驗結(jié)果說明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.1.7重復(fù)性考察 精密稱取6份婦舒保凝膠（同一批號）1.0 g，按“2.2.1.2”方法制備，在“2.2.1.1”項下色譜條件下分別精密吸取10 μL進行測定并計算。結(jié)果鹽酸小檗堿的平均含量為8.731 mg/g，RSD為1.23%（n=6）。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.1.8專屬性試驗 按處方比例，不加黃柏的藥材，按照工藝路線制得缺黃柏制劑，再按照供試品的制備方法進行陰性供試樣品的制備，并進樣測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性供試樣品溶液色譜圖在鹽酸小檗堿處無吸收，說明陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖1。

2.2.1.9加樣回收率試驗 精密稱定同一批號婦舒保凝膠0.5 g，分別加入鹽酸小檗堿對照品，按“2.2.1.2”方法制備，在“2.2.1.1”項下色譜條件下測定并計算。結(jié)果平均回收率為97.9%（n=6），RSD=0.98%。

2.2.1.10樣品含量測定 分別精密稱取三批中試樣品（批號：20130921、20130923、20130925）1.0 g，平行三份，按照“2.2.1.2”方法制備，在“2.2.1.1”項下色譜條件下測定，并計算每克凝膠中含有指標成分鹽酸小檗堿的量，結(jié)果見表1。

由表1可得，每克婦舒保凝膠中所含的鹽酸小檗堿的平均值為8.709 mg。根據(jù)樣品含量測定結(jié)果，考慮到藥材的來源有一定的不穩(wěn)定性，為了保證產(chǎn)品的穩(wěn)定性，以含量測定結(jié)果的80%作為下限，即婦舒保凝膠中每l g凝膠所含鹽酸小檗堿的含量不得低于6.967 mg。

2.2.2大黃酸和大黃素甲醚的含量測定

2.2.2.1色譜條件 色譜柱 SunFire C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相為甲醇-0.1%磷酸（85∶15），檢測波長為254 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃。

2.2.2.2供試品溶液制備 精密稱定婦舒保凝膠樣品約1.0 g，置具塞平底燒瓶中，加入10%的NaCl 10 mL，用力振搖，使沉析，過濾得濾液，加8%鹽酸溶液10 mL，再加CHCl3 10 mL，超聲20 min（頻率為40 kHz，功率為250 W），用CHCl3萃?。?次，10 mL/次），合并CHCl3液，減壓回收溶劑至干，用甲醇定容至10 mL，得供試樣品溶液，備用。

2.2.2.3對照品的制備 精密稱取對照品適量，加甲醇溶解分別制成含50 μg/mL大黃酸和41.9 μg/mL大黃素甲醚的混合對照品溶液。

2.2.2.4線性關(guān)系的考察 精密配制大黃酸和大黃素甲醚的質(zhì)量濃度分別為5.0、10、15、20、25、30、4.19、8.38、12.57、16.76、20.95、25.14 μg/mL的混合對照品溶液，按上述色譜條件測定，得標準曲線方程。大黃酸：A=24 140C-11 695，r=0.9992；大黃素甲醚：A=3873.8C+54 547，r=0.9992。

2.2.2.5精密度考察 精密吸取6 μL混合對照品溶液，按色譜條件在24 h內(nèi)連續(xù)進樣6次和6 d內(nèi)同一時間進樣6次，測定大黃酸和大黃素甲醚的峰面積值并計算相對標準偏差（RSD），結(jié)果大黃酸RSD分別為0.70%、0.74%（n=6），大黃素甲醚RSD分別為0.61%、0.54%（n=6）。試驗結(jié)果表明該儀器精密度良好。

2.2.2.6穩(wěn)定性考察 精密吸取6 μL供試品溶液，按色譜條件在0、2、4、6、8、12 h進樣，測定峰面積并計算相對標準偏差（RSD）。結(jié)果大黃酸和大黃素甲醚峰面積RSD值分別為0.86%和0.64%（n=6），表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2.7重復(fù)性考察 取6份同一批婦舒保凝膠樣品2.5 g，精密稱定，按“2.2.2.2”方法制備，精密吸取10 μL，在“2.2.2.1”色譜條件下測定，結(jié)果大黃酸的平均含量為0.0273 mg/g，RSD為0.51%（n=6）；大黃素甲醚的平均含量為0.0246 mg/g，RSD為2.22%（n=6）。表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.2.8專屬性試驗 按“2.2.2.2”項制得缺大黃制劑，并進樣測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性供試樣品溶液色譜圖在大黃酸和大黃素甲醚處無吸收，說明陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖2。

2.2.2.9加樣回收率試驗 精密稱定婦舒保凝膠1.25 g（批號20130921），分別加入大黃素甲醚和大黃酸對照品適量，按上述“2.2.2.2”方法制成供試品溶液，測定并計算加樣回收率，結(jié)果大黃酸平均回收率為98.37%（n=6），RSD=0.98%；大黃素甲醚平均回收率為98.1%（n=6），RSD=0.99%。

2.2.2.10樣品含量測定 精密稱取三批中試樣品（批號：20130921、20130923、20130925）2.5 g，平行三份，按照上述制備供試品溶液的方法制備，測定峰面積，并計算每克凝膠中含有大黃酸和大黃素甲醚的量，結(jié)果見表2。

由表2可得，婦舒保凝膠中每1 g凝膠所含大黃酸和大黃素甲醚的含量分別不得低于0.0222 mg和0.0199 mg（以含量測定結(jié)果的80%作為下限）。

3 討論

本方為黃柏、大黃等10味中藥組成的復(fù)方制劑，其中黃柏和大黃為方中的君藥，黃柏的主要活性成分以具有顯著的抗菌消炎作用鹽酸小檗堿為主；蒽醌類是大黃的主要活性成分，藥理研究表明游離蒽醌類具有明顯的抗菌消炎作用。故在含量測定部分，選擇了黃柏中的鹽酸小檗堿以及大黃中的大黃酸和大黃素甲醚等游離蒽醌類為指標成分[13-16]。

本實驗建立了婦舒保凝膠中黃柏、苦參、大黃3味藥材的TLC方法，專屬性強，重現(xiàn)性好，并且建立了君藥中鹽酸小檗堿、大黃酸和大黃素甲醚的含量測定HPLC法，規(guī)定了婦舒保凝膠中每1 g凝膠所含鹽酸小檗堿、大黃酸、大黃素甲醚的含量分別不得低于6.967、0.0222、0.0199 mg。本試驗初步建立了婦舒保凝膠質(zhì)量標準草案。

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（收稿日期：2017-01-20 本文編輯：王 麗）