骨髓間充質干細胞在重度燒傷大鼠心肌損傷中的保護作用

牟歡+++劉洋++李俊杰+++劉劍++周新立++強廷會++杜興國++馬平

[摘要] 目的 探討骨髓間充質干細胞（BMSCs）對嚴重燙傷大鼠心肌的保護作用及作用機制。 方法 ①取10只健康雄性SD大鼠，采用全骨髓貼壁法體外分離大鼠BMSCs，流式細胞儀檢測細胞表面分子標志物。②24只健康雄性SD大鼠，隨機分為：對照組、模型組、治療組。模型組及治療組大鼠背部暴露于95℃熱水浴18 s造成30% TBSA Ⅲ度燙傷，對照組暴露于37℃水浴18 s。水浴后即刻模型組及治療組大鼠分別腹腔注射生理鹽水10 mL（50 mL/kg），水浴后3 h模型組經(jīng)尾靜脈注射100 μL生理鹽水，治療組經(jīng)尾靜脈注射100 μL（2.5×107/mL）BMSCs。處理后48 h收集3組大鼠心臟組織標本及腹主動脈血，ELISA法檢測血清肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）含量，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法檢測心臟組織中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10及凋亡相關分子caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA表達水平。 結果 流式細胞術檢測提示，所培養(yǎng)的BMSCs表達CD44、CD90、CDl05的陽性率分別為96.8%、99.72%、95.93%，而CD34、CD45陽性率分別為1.42%、2.17%；模型組大鼠血清CK、LDH含量顯著高于對照組（P < 0.05）。治療組CK、LDH含量顯著低于模型組（P < 0.05）。模型組大鼠心臟組織中caspase-3、Bax的mRNA表達量顯著高于對照組（P < 0.05）。治療組大鼠心臟組織中caspase-3、Bax的mRNA表達量顯著低于模型組（P < 0.05）。模型組大鼠心臟組織中Bcl-2的mRNA表達量為顯著低于對照組（P < 0.05）；治療組大鼠心臟組織中Bcl-2的mRNA表達量顯著高于對照組（P < 0.05）。模型組大鼠心臟組織中TNF-α、IL-1β的mRNA表達量顯著高于對照組（P < 0.05）。治療組大鼠心臟組織中IL-1β、TNF-α的mRNA表達量顯著低于模型組（P < 0.05）。模型組大鼠心臟組織中IL-10的mRNA表達量顯著低于對照組（P <0.05）；治療組大鼠心臟組織中IL-10的mRNA表達量顯著高于模型組（P < 0.05）。結論BMSCs可顯著降低燒傷后大鼠CK、LDH水平，減輕心肌組織損傷，減少心肌細胞凋亡，降低炎性因子IL-1β和TNF-α表達、促進抑炎因子IL-10的表達，對嚴重燒傷大鼠心肌具有保護作用。

[關鍵詞] 燒傷；心肌損傷；細胞凋亡；骨髓間充質干細胞

[中圖分類號] R644 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（c）-0012-05

[Abstract] Objective To explore the effects and related mechanism of bone marrow stromal stem cells （BMSCs） on protecting rats myocardial injury induced by severe burns. Methods ①Ten healthy male SD （Sprague–Dawley）rats were used to separate BMSCs through whole bone marrow adherent. The biological markers were assayed with flowcytometry. ②Twenty-four healthy male SD rats were randomly divided into control group， model group and treatment group. Except for control group， abdominal skin of rats were exposed to 95℃ water for 18 seconds which led to the third degree， 30% TBSA burns while the rats in control group were exposed to 37℃ water for 18 seconds. Rats in burn model group and treatment group were given 10 mL（50 mL/kg） saline intraperitoneally immediately after burns. Three hours later，Saline （100 μL）or BMSCs（100 μL，2.5×107/mL） were given through caudal vein. Forty-eight later， rats were sacrificed and the myocardium and blood from aorta abdominalis were collected. The expression levelsof creatine kinase （CK）， lactic dehydrogenase （LDH） were detected by ELISA. The mRNA level of caspase-3， Bcl-2， Bax， TNF-α， IL-1β and IL-10 were detected by RT-PCR. Results The positive rates of CD44，CD90，CD105 were 96.8%， 99.72% and 95.93% separately in BMSCs. However， the positive rates of CD34 and CD45 were 1.42% and 2.17% separately. The expression level of CK and LDH in rats in model group were significantly higher than that in control group（P < 0.05）. The expression level of CK and LDH in treatment group were higher than those in control group （P < 0.05）. The mRNA level of caspase-3 and Bax in the myocardium in treatment group were significantly decreased compared with control group （P < 0.05）. The mRNA level of Bcl-2 in myocardium of treatment group was higher than that in control group （P < 0.05）. The mRNA levels of TNF-α and IL-1β in model group were higher than that in control group （P < 0.05）. However， in treatment group， these two were lower than in the model group （P < 0.05）. The mRNA level of IL-10 was significantly lower than that in control group （P < 0.05）. While in treatment group， the mRNA level of IL-10 was significantly higher than that in model group （P < 0.05）. Conclusion BMSCs could protect against myocardial injury induced by severe burns. The expression of CK and LDH decreased， indicating that the injury of myocardial decreased. During which， the inflammatory factors， IL-1β and TNF-α decreased and anti-inflammatory factor IL-10 increased.

[Key words] Burns； Myocardial injury； Cell apoptosis； Bone marrow stromal stem cells

嚴重燒傷患者早期即存在缺血缺氧性心肌損害，導致心功能減退[1-2]，炎性反應、細胞凋亡等因素與嚴重燒傷早期心肌細胞損害密切相關。研究顯示：在抑制炎性反應、保護多臟器功能方面間充質干細胞具有明顯的治療效果[3-5]。但嚴重燒傷后，骨髓間充質干細胞（BMSCs）對心肌損傷是否具有保護作用，目前尚不明確。本研究通過體內旨在探究嚴重燒傷后，給予BMSCs治療，觀察對大鼠心肌損傷的影響，并探討B(tài)MSCs可能的作用機制，進而為干細胞治療嚴重燒傷臟器損害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、實驗動物及儀器來源

SD大鼠34只，質量（200±5）g，鼠齡6～8周、健康SPF級雄性，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK（軍）2012-0022。IQ5TM實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀購自美國Bio-Rad公司；胎牛血清（批號：42F5150K），胰蛋白酶（美國GIBCO公司，批號：1394362），肌酸激酶（CK，批號：F16113）、乳酸脫氫酶（LDH，批號：F15212）ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司，CD34（批號：SC3742）、CD44（批號：SC7297）、CD45（批號：SC1178）、CD90（批號：SC53456）、CD105（批號：18838）購自美國Santa Cruz 公司。反轉錄試劑盒（批號：BK1001）、SYBR Green熒光定量試劑盒（批號：A8605）購自日本TaKaRa公司。

1.2 大鼠BMSCs分離培養(yǎng)及鑒定

10只健康SPF級雄性SD大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg）麻醉后頸椎脫臼法處死，迅速剃除毛發(fā)，碘伏全身浸泡消毒5 min。超凈工作臺取股骨及脛骨，PBS清洗3次。剪掉骨骺端，用L-DMEM沖出骨髓，分離培養(yǎng)純化BMSCs，選用第三代進行實驗，采用流式細胞儀檢測CD44、CD90、CDl05、CD34、CD45等細胞表面分子標志物。

1.3 模型制備及分組處理

實驗方案經(jīng)第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（編號：XJYYLL-2015393）。24只健康清潔級雄性SD大鼠，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±2）℃，濕度50%，12 h照明、12 h黑暗適應性飼養(yǎng)1周。實驗分組采用隨機數(shù)字表法，隨機分為對照組（假傷）、模型組（單純燙傷）、治療組（燙傷后BMSCs處理），每組8只。參照文獻[6-7]構建動物模型，95℃熱水浴18 s，制成30% TBSA Ⅲ度燙傷（經(jīng)病理切片證實），實驗過程：采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg）麻醉大鼠后背部燙傷區(qū)域脫毛，并給予仰臥位固定，95℃熱水浴18 s，制成30% TBSA Ⅲ度燙傷，傷后即刻模型組和治療組大鼠分別腹腔注射生理鹽水10 mL（50 mL/kg），傷后3 h模型組經(jīng)尾靜脈注射100 μL生理鹽水，治療組經(jīng)尾靜脈注射100 μL BMSCs（2.5×107/ml）；對于對照組大鼠則采用37℃水浴18 s模擬燙傷過程。

1.4 標本采集

實驗過程中各組大鼠單籠飼養(yǎng)，自由飲食，各組大鼠48 h后麻醉，腹主動脈取血室溫靜置30 min后，1000 r/min（半徑15 cm）離心15 min，收集血清-80℃凍存。隨后開胸收集心肌組織-80℃凍存。

1.5 觀察指標

1.5.1 血清CK、LDH含量 取各組凍存血清標本，采用ELISA法按試劑盒說明書測定血清中LDH、CK的含量。

1.5.2 心臟組織炎性細胞因子mRNA表達 檢測心臟組織中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）、B淋巴細胞瘤-2蛋白（Bcl-2）、BCL-2同源的水溶性相關蛋白（Bax）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-10（IL-10）的mRNA表達。取各組50 mg凍存組織標本，使用Trizol法提取總RNA，測定RNA濃度，反轉錄合成互補DNA。按照SYBR Green熒光定量試劑盒說明書進行PCR，引物由TaKaRa公司設計、合成，序列見表1。以GAPDH為內參照，將對照組的表達量設為1，計算各組目的基因的相對表達量。分析采用2-？駐？駐Ct法進行相對基因表達分析，以PCR儀隨機軟件計算循環(huán)（Ct）閾值。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠BMSCs的培養(yǎng)與鑒定。

所培養(yǎng)的BMSCs表達CD44、CD90、CDl05的陽性率分別為96.8%（29040）、99.72%（29916）、95.93%（28779），而CD34、CD45 陽性率分別為1.42%（426）、2.17%（651）。

2.2 血清中CK、LDH含量測定

組間血清LDH、CK含量總體比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。模型組大鼠2種心肌酶含量均顯著高于對照組（P < 0.05），治療組大鼠2種心肌酶含量均顯著低于模型組（P < 0.05）。見表2。

2.3 心臟組織凋亡相關分子caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA表達

模型組大鼠心臟組織中caspase-3、Bax的mRNA表達量均顯著高于對照組（P < 0.05）；抑炎因子Bcl-2的mRNA表達量顯著低于模型組。治療組大鼠心臟組織中抑炎因子Bcl-2的mRNA表達量顯著高于模型組（P < 0.05），caspase-3、Bax的mRNA表達量顯著低于模型組（P < 0.05）。見表3。

2.4 心臟組織炎癥相關因子TNF-α、IL-1β、IL-10的mRNA表達

模型組大鼠心臟組織中TNF-α、IL-1β的mRNA表達量均顯著高于對照組（P < 0.05）；抑炎因子IL-10的mRNA表達量顯著低于模型組。治療組大鼠心臟組織中抑炎因子IL-10的mRNA表達量顯著高于模型組（P < 0.05），IL-1β、TNF-α的mRNA表達量顯著低于模型組（P < 0.05）。見表4。

3 討論

嚴重燒傷后，心肌細胞損傷是患者心功能不全的重要原因，心肌細胞損傷后能否及時恢復，直接影響到患者休克期的平穩(wěn)度過[8]。成年人心肌細無法再生，損傷后依賴纖維化修復，可嚴重影響到正常心臟功能[9]。在嚴重燒傷患者早期救治中，如何及時有效的抑制炎性反應、逆轉心肌細胞損傷、改善心肌功能，異常關鍵。間充質干細胞不僅具有強大的免疫調節(jié)作用[10-11]，且能夠抑制炎性反應及減少細胞凋亡、在多臟器功能保護等方面發(fā)揮著重要作用[12]。同時，近期研究表明，干細胞分泌的細胞外基質，對損傷細胞的更新修復至關重要[13-14]。

骨髓間充質干細胞來源廣泛，具有較強的分化潛能和可以自體移植等優(yōu)點，為各種心肌細胞損傷疾病的治療保護，提供了一條有效途徑，被認為是可引入臨床運用的最優(yōu)干細胞[15]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)尾靜脈輸注BMSCs，可明顯降低嚴重燙傷大鼠血清中CK、LDH的表達水平，進而改善心肌細胞功能。嚴重燒傷后缺血缺氧引起的心肌細胞損害主要表現(xiàn)為心肌細胞壞死和凋亡兩種形式，其中細胞凋亡發(fā)生較早。抑制心肌細胞凋亡有助于改善缺血缺氧性心肌損害，恢復心肌細胞功能[16]。本實驗中檢測到模型組中，大鼠心臟組織中細胞凋亡相關蛋白caspase-3 mRNA表達均顯著增加，促凋亡蛋白Bax的表達顯著增高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯受到抑制。治療組大鼠 caspase-3、Bax的mRNA表達較模型組明顯降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著增高。提示在嚴重燙傷后，BMSCs可能通過減少細胞凋亡發(fā)揮心肌保護作用。

有研究報道嚴重燒傷后，檢測到心肌缺血缺氧的同時，發(fā)現(xiàn)有大量炎癥細胞的浸潤[17]，同時有研究指出，心肌細胞本身具有合成、釋放炎性細胞因子的能力[18]。在本實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)模型組大鼠心臟組織中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β的mRNA表達量明顯高于對照組，治療組的檢測結果顯示，大鼠心臟組織中TNF-α、IL-1β的mRNA表達量和模型組比較均顯著降低，抑炎因子IL-10的mRNA表達量則顯著增高。提示在BMSCs處理后，促炎因子TNF-α、IL-1β的表達被抑制，抑炎因子IL-10 的表達上調，炎性反應得到明顯抑制。此外，研究顯示，間充質干細胞能夠通過分泌TNF-α激活基因/蛋白6抑制巨噬細胞核因子κB的激活，抑制炎性反應的進程[19-20]。本實驗中筆者觀察到，嚴重燒傷早期通過BMSCs處理，可促進嚴重燒傷大鼠心肌組織內抑炎細胞因子的表達，減少TNF-α等促進炎性細胞因子的釋放，抑制細胞凋亡減輕組織損傷，維護心肌功能，從而保護心肌細胞的持續(xù)損傷。但嚴重燒傷后機體本身處于一種多因素、交互調控的復雜局面，BMSCs在嚴重燒傷后保護臟器功能的具體分子機制，仍需進一步探討。

[參考文獻]

[1] 黃躍生.再論燒傷后"休克心"及其臨床意義[J].中華燒傷雜志，2009，25（3）：161-163.

[2] 尹澤鋼，黃躍生，李百姓.大鼠嚴重燒傷后早期心功能和臟器血流量的變化及關系[J].中華燒傷雜志，2010，26（1）：10-13.

[3] Méndezferrer S，Michurina TV，F(xiàn)erraroF，et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche [J]. Nature，2010，466（7308）：829-834.

[4] Weil BR，Markel TA，Herrmann JL，et al. Mesenchymal stem cells enhance the viability and proliferation of human fetal intestinal epithelial cells following hypoxic injury via paracrine mechanisms [J]. Surgery，2009，146（2）：190-197.

[5] Jiang C，Zheng D，F(xiàn)ang YL，et al. Short- and long-term therapeutic efficacies of intravenous transplantation of bone marrow stem cells on cardiac function in rats with acute myocardial infarction：a meta-analysis of randomized controlled trials [J]. Chinese Medical Sciences Journal，2016，31（3）：142-148.

[6] 謝松濤，樊磊，楊龍龍，等.脂肪間充質干細胞對嚴重燒傷大鼠早期心肌損傷的保護作用[J].中華損傷與修復雜志，2015，10（4）：284-289.

[7] Bai X，F(xiàn)an L，He T，et al. SIRT1 protects rat lung tissue against severe burn-induced remote ALI by attenuating the apoptosis of PMVECs via p38 MAPK signaling [J]. Scientific Reports，2015，5：10277.

[8] Seymour CW，Rosengart MR. Septic shock：advances in diagnosis and treatment [J]. JAMA，2015，314（7）：708-717.

[9] Liu N，Qi X，Han ZB，et a1.Bone marrow is a reservoir for cardiac resident stem cells [J]. Sci rep，2016，6：28739.

[10] Matysiak M，Orlowski W，F(xiàn)ortak M. Immunoregulatory function of bone marrow mesenchymal stem cells in EAE depends on their differentiation state and secretion of PGE2. [J]. Journal of Neuroimmunology，2011，233（1-2）：106-111.

[11] Akiyama K，Chen C，Wang D，et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. [J]. Cell Stem Cell，2012，10（5）：544-555.

[12] 謝松濤，樊磊，楊龍龍，等. 脂肪間充質干細胞對嚴重燒傷大鼠早期心肌損傷的保護作用[J].中華損傷與修復雜志：電子版，2015，10（4）：4-8.

[13] Nguyen PK，Rhee JW，Wu JC. Adult stem cell therapy and heart failure，2000 to 2016：a systematic review. [J]. Jama Cardiology，2016，1（7）：831.

[14] Cai M，Shen R，Song L，et al. Bone marrow mesenchymal stem cells （BM-MSCs）improve heart function in swine myocardial infarction model through paracrine effects [J]. Scientific Reports，2016，6：28250.

[15] 龔惠，陳志丹，鄒云增.干細胞與心肌再生[J].上海大學學報：自然科學版，2016，22（3）：280-284.

[16] Zhao ZQ，Morris CD，Budde JM，et al. Inhibition of myocardial apoptosis reduces infarct size and improves regional contractile dysfunction during reperfusion [J]. Cardiovascular Research，2003，59（1）：132-142.

[17] Singer M. The role of mitochondrial dysfunction in sepsis-induced multi-organ failure [J]. Virulence，2014，5（1）：66-72.

[18] 張家平，黃躍生，楊宗城.燒傷早期心肌組織幾種炎癥相關基因表達變化實驗研究[J].中國危重病急救醫(yī)學，2003，15（10）：589-592.

[19] Roddy GW，Oh JY，Lee RH，et al. Action at a distance：systemically administered adult stem/progenitor cells（MSCs）reduce inflammatory damage to the cornea without engraftment and primarily by secretion of TNF-α stimulated gene/protein 6 [J]. Stem Cells，2011，29（1）：1572-1579.

[20] Choi H，Lee RH，Bazhanov N，et al. Anti-inflammatory protein TSG-6 secreted by activated MSCs attenuates zymosan-induced mouse peritonitis by decreasing TLR2/NF-κB signaling in resident macrophages [J]. Blood，2011， 118（2）：330-338.

（收稿日期：2017-01-13 本文編輯：李岳澤）