甘蔗ABA生物合成關鍵酶SoNCED基因克隆及表達分析

譚秦亮 潘成列 楊麗濤 李楊瑞 歐克緯 朱鵬錦

摘要：【目的】克隆甘蔗體內(nèi)9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）基因，分析其基本生物學信息及在逆境脅迫下的表達分析，為進一步探討SoNCED基因在甘蔗脫落酸（ABA）生物合成途徑中的作用提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳愿收崞贩N桂糖21號為材料，待蔗苗長至5～6片葉時分別進行干旱、低溫、高鹽和氧化脅迫處理，利用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和cDNA未端快速擴增（RACE-PCR）克隆SoNCED基因，應用生物信息學方法對獲得的氨基酸序列進行分析，構(gòu)建原核表達載體并進行目的蛋白的誘導表達，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析SoNCED基因在受到不同逆境脅迫時的表達情況?！窘Y(jié)果】克隆獲得的SoNCED基因（GenBank登錄號JQ314108），cDNA全長為2521 bp，包含1個1827 bp的開放閱讀框（ORF），編碼608個氨基酸。多重序列比對及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果表明，SoNCED基因編碼的氨基酸序列與其他植物有一定的相似性，尤其與禾本科C4植物高粱和玉米的同源性最高，均達96%。成功構(gòu)建SoNCED基因的原核表達載體pET-SoNCED，且通過IPTG誘導時可得到約66.0 kD的蛋白，確定該蛋白為SoNCED基因的表達蛋白。qRT-PCR結(jié)果分析表明，SoNCED基因在干旱、低溫、高鹽和氧化脅迫下均能誘導表達，其中氧化脅迫下其表達量在6 h時達峰值，其他脅迫方式下其表達量在12 h時達峰值?！窘Y(jié)論】成功克隆獲得甘蔗SoNCED基因，并從不同逆境下的表達情況推測該基因在甘蔗體內(nèi)參與了干旱、低溫、高鹽和氧化等非生物脅迫的調(diào)控過程。

關鍵詞： 甘蔗；基因克??；SoNCED；表達分析；原核表達

中圖分類號： S566.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）01-0001-08

Abstract：【Objective】The research cloned 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene（SoNCED） from sugarcane， analyzed its biological information and expression under stress， in order to provide theoretical basis for further exploring the role of SoNCED gene in sugarcane ABA biosynthesis. 【Method】Taking sugarcane variety Guitang 21 as materials， when sugarcane seedlings grew 5-6 leaves， drought， low temperature，high salt and oxidation stresses were applied to them. SoNCED gene was cloned using reverse transcriptional PCR （RT-PCR） and rapid amplification of cDNA end （RACE-PCR）. Bioinformatics was used to analyze amino acid sequence. Prokaryotic expression vector was established and induced expression of target protein was conducted. Real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）method was adopted to study the expressions of SoNCED gene under different stresses. 【Result】The cDNA of cloned SoNCED（GenBank accession number JQ314108） in sugarcane was 2521 bp in length with an open reading frame（ORF） of 1827 bp， encoding 608 amino acids. Multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that amino acid sequence of SoNCED gene coding was similar to that of other plants. It showed the highest homology with Sorghum bicolor and Zea may， which reached 96%. Prokaryotic expression vector of gene pET-SoNCED was established. And 66.0 kD protein was obtained under IPTG induction， which was determined as expression protein of SoNCED gene. Results of qRT-PCR analysis showed that SoNCED gene was able to express under drought， low temperature， high salt， and oxidation stresses. Under oxidative stress， the expression level reached the peak in 6 h； and the expressions reached the peak in 12 h under other stresses.【Conclusion】Gene SoNCED was cloned from sugarcane. Different stresses are employed to predict the role of SoNCED gene in regulation of abiotic stresses such as drought， high salt， low temperature and oxidation.

Key words： sugarcane； gene cloning； SoNCED； expression analysis； prokaryotic expression

0 引言

【研究意義】甘蔗是我國第一大糖料作物，也是目前極具發(fā)展?jié)摿Φ纳锬茉醋魑铮ɡ顥钊鸷蜅铥悵?009）。甘蔗種植區(qū)主要分布在熱帶亞熱帶地區(qū)，近年來隨著全球氣候的多變，甘蔗生長正面臨著各種逆境脅迫。脫落酸（Abscisic acid，ABA）作為植物體內(nèi)的重要生長激素，不僅可促進植物正常生長發(fā)育，還在響應植物對逆境脅迫的調(diào)控過程中發(fā)揮著至關重要的作用，如干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫均能引起植物體內(nèi)內(nèi)源ABA含量的升高（Seo and Koshiba，2002）。一般植物體內(nèi)的ABA生物合成有直接和間接兩條途徑，直接途徑由甲瓦龍酸直接合成，間接途徑由9-順式紫黃質(zhì)或9-順式新黃質(zhì)裂解氧化還原而成（Taylor et al.，2000；Seo and Koshiba，2002）。大量研究發(fā)現(xiàn)，間接途徑是高等植物體內(nèi)合成ABA的主要途徑（Schwartz et al.，2003；Nambara and Marion-Poll，2005），該途徑中9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）是催化9-順式紫黃質(zhì)或9-順式新黃質(zhì)反應的裂解酶，也是ABA生物合成途徑中的最關鍵限速酶（Hwang et al.，2010）。因此，克隆甘蔗NCED基因（SoNCED）并分析其在逆境脅迫下的表達情況，對研究甘蔗ABA生物合成、生理調(diào)控分子機理及甘蔗抗逆育種均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】植物體內(nèi)NCED基因是一個多基因家族，廣泛存在于各種植物中。目前該基因的cDNA在鱷梨（Chernys and Zeevaart，2000）、擬南芥（Iuchi et al.，2001；Tan et al.，2003）、花生（Wan and Li，2005）、大麥（Chono et al.，2006）、馬鈴薯（Destefano-Beltran et al.，2006）、柱花草（楊錦芬等，2007）、小麥（李康等，2010）和甘蔗（李長寧，2012）等植物上均被成功克隆。轉(zhuǎn)基因植物中NCED基因的過量表達能引起ABA積累和抗旱性增強，過量表達番茄NCED3（Thompson et al.，2000）、豆類NCED1（Qin and Zeevaart，2002）、擬南芥NCED3（Tan et al.，2003）均能導致轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源ABA含量增加，并提高植株抗旱能力。Thompson等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，番茄葉片中LeNCED1基因不僅受水分脅迫誘導表達，其表達量還呈晝夜節(jié)律性變化。Tan等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥NCED基因家族中有5個基因在ABA生物合成中具有功能活性，其中AtNCED3被認為是響應干旱脅迫且在ABA生物合成中起主要作用的基因。同時，對玉米、柑橘等作物的研究結(jié)果也表明，NCED基因的表達可被不同逆境脅迫所誘導，且其表達量與ABA含量呈協(xié)同效應，誘導表達該基因可明顯提高玉米和柑橘體內(nèi)的ABA含量及其抗逆境脅迫的調(diào)控能力（Rodrigo et al.，2006；Wan and Li，2006）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，對SoNCED基因的原核表達分析及該基因在甘蔗逆境脅迫中的機理研究尚無報道。【擬解決的關鍵問題】采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）與cDNA末端快速擴增（RACE-PCR）克隆SoNCED基因并進行生物信息學分析，構(gòu)建原核表達載體pET-SoNCED，然后進行蛋白的誘導與表達分析；采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）對SoNCED進行逆境脅迫時的表達分析，以期為進一步探討SoNCED基因在甘蔗ABA生物合成途徑中的作用提供理論依據(jù)，同時為甘蔗分子育種提供有效的候選基因。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

以甘蔗品種桂糖21號為試驗材料，采用沙培育苗，待蔗苗長至3～4葉期后取生長健壯、大小一致的植株移栽到桶中進行土培。當蔗苗長至5～6葉期，選取長勢一致的幼苗進行試驗處理。試驗共設4個處理，分別為干旱脅迫（Water stress，WS）：用15% PEG-6000 （m/v）溶液進行根部澆淋；低溫脅迫（Cold stress，CS）：將甘蔗苗置于4 ℃冷庫進行低溫處理（白晝16/8 h，濕度65%）；NaCl脅迫（NaCl stress，NS）：用100 mmol/L NaCl溶液進行根部澆淋；H2O2脅迫（H2O2 stress，HS）：用10 mmol/L H2O2溶液進行葉面噴施。分別在處理后0、6、12、24、48和72 h采集甘蔗苗+1位葉片，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 RNA提取及cDNA第一鏈合成

剪取1 g左右的甘蔗新鮮葉片，用Trizol試劑提取甘蔗總RNA，吸取2 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠檢查其濃度和完整性。cDNA第一鏈的合成參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Formentas公司）說明進行操作，產(chǎn)物主要用于SoNCED基因的3'-RACE、5'-RACE、全長和開放閱讀框克?。灰栽噭┖蠸YBR Premix Ex Taq II（TaKaRa公司）合成qRT-PCR的cDNA第一鏈。

1. 3 SoNCED基因全長克隆

設計3'-RACE和5'-RACE所需的特異引物（表1），引物由上海生工生物工程有限公司合成，克隆SoNCED基因全長。3'-RACE-PCR結(jié)合接頭引物18AP（表1），5'-RACE PCR結(jié)合試劑盒中提供的接頭引物 UPM，分別進行該基因3'和5'末端擴增。

PCR反應體系50 μL：模板cDNA 2 μL、ddH2O 21 μL、2×Gold Star Best Master Mix 25 μL、10 μmol/L上游引物和下游引物各1 μL。擴增程序：95 ℃預變性10 min； 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。連接pMD18-T載體，挑選陽性克隆進行測序。

1. 4 SoNCED基因生物信息學分析

用BioXM2.6分析SoNCED基因的氨基酸序列；使用ProtParam在線軟件分析蛋白質(zhì)的分子量和等電點等基本理化性質(zhì)；通過PSORT工具進行蛋白質(zhì)亞細胞定位分析；用MEGA 5.0鄰接法（Neighbor-joining，NJ）進行氨基酸序列的多重對比及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析。

1. 5 SoNCED基因原核表達載體構(gòu)建

根據(jù)SoNCED基因的開放閱讀框設計原核表達載體引物pETNCED-F和pETNCED-R下劃線部分分別為N端Acc65 I和C端EcoR I內(nèi)切酶位點（表1），然后進行PCR擴增。反應體系同步驟1.3，反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性50 s；63 ℃退火50 s，72 ℃ 120 s，進行36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。連接pMD18-T載體，熱激轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，選擇陽性克隆測序。用Acc65 I和EcoR I雙酶切測序正確的菌液質(zhì)粒與pET-30a（+）載體質(zhì)粒，進行連接與轉(zhuǎn)化、酶切、測序等驗證后獲得重組質(zhì)粒pET-SoNCED。

1. 6 SoNCED基因原核表達分析

以1.0 mmol/L IPTG誘導重組質(zhì)粒的BL21菌液，分別在誘導表達2、4、6和8 h后取樣。取樣后離心，收集沉淀加3×SDS-PAGE緩沖液150 μL進行裂解變性，沸水浴10 min，冷卻后進行SDS-PAGE電泳分析。

1. 7 SoNCED基因在不同逆境脅迫下的定量表達分析

設計qRT-PCR特異性引物RT-NCF和RT-NCR（表1）；以甘蔗基因GAPDH（EF189713）為內(nèi)參，引物為GAPDH-F和GAPDH-R（表1）。PCR反應體系20 μL：cDNA 2 μL，2×Premix Ex Taq II 10 μL，4 μmol/L正、反向引物各1 μL，雙蒸水6 μL。擴增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，進行45個循環(huán)；溶解曲線95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s，40 ℃ 30 s。所得數(shù)據(jù)用2-△△CT（Livak and Schmittgen，2001）進行相對定量分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SoNCED基因全長cDNA克隆

采用Trizol法提取甘蔗葉片總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，以cDNA為模板，3'-RACE-PCR擴增得到1090 bp的片段（圖1-A），5'-RACE-PCR擴增得到1637 bp的片段（圖1-B），拼接得到SoNCED基因全長cDNA序列，長度為2521 bp（圖2），GenBank登錄號為JQ314108。序列分析結(jié)果（圖2）顯示：3'端存在典型的Poly（A）加尾信號，5'端包含起始密碼子（ATG）且符合Kozak法則；包含1個1827 bp的完整開放閱讀框（ORF）；編碼的蛋白質(zhì)包含608個氨基酸。

2. 2 SoNCED蛋白質(zhì)特性及序列分析結(jié)果

利用Expasy工具分析可知，SoNCED蛋白理論分子量65.9 kD，等電點（pI）6.04，平均親水系數(shù)（GRAVY）-0.172。通過PSORT工具推測，SoNCED蛋白定位于葉綠體。利用ClustalW2將SoNCED氨基酸序列與玉米、水稻、橘子及番茄的氨基酸序列進行比對分析（圖3），預測其N端含有1個典型的由30個氨基酸所組成的葉綠體轉(zhuǎn)運肽結(jié)構(gòu)（劃綠線部分），2個雙硫鍵結(jié)構(gòu)（C410和C431），4個鐵離子結(jié)合催化位點（H-298、H-347、H-412和H-590）。

將SoNCED蛋白與已公開發(fā)表的其他物種NCED蛋白進行系統(tǒng)進化關系分析，聚類結(jié)果（圖4）表明，SoNCED與同為禾本科C4植物的高粱SbNCED（EER93751.1）和玉米ZmVP14（AAB62181.2）蛋白聚于同一進化小分支，與高粱和玉米的同源性均高達96%，同時與其他禾本科植物（水稻、大麥）的親緣關系也較近，與水稻同源性為87%，與大麥同源性為82%。

2. 3 SoNCED基因原核表達載體的構(gòu)建

使用引物pETNCED-F和pETNCED-R進行ORF擴增，得到約1827 bp的條帶（圖5-A）。連接至pMD18-T載體，測序確定該產(chǎn)物為SoNCED基因的完整ORF。使用Acc65 I和EcoR I進行雙酶切，結(jié)果（圖5-B）顯示，重組質(zhì)粒pET-SoNCED雙酶切后可切出約1827 bp的片段，測序結(jié)果序列與已知基因序列比對完全一致，說明成功構(gòu)建出SoNCED基因原核表達載體，可進一步進行蛋白誘導表達分析。

2. 4 SoNCED基因的原核誘導表達結(jié)果

選用1.0 mmol/L IPTG誘導目的蛋白，采用SDS- PAGE電泳檢測目的蛋白的表達情況。結(jié)果如圖6所示，經(jīng)IPTG誘導后目的基因能夠表達出相應的蛋白，且在4 h時表達量達最大值。pET-SoNCED誘導出的蛋白大小約66.0 kDa，說明構(gòu)建pET-SoNCED原核表達載體成功，且經(jīng)IPTG誘導可表達出目的蛋白。

2. 5 不同脅迫處理下SoNCED基因的表達分析結(jié)果

用qRT-PCR對SoNCED基因在甘蔗葉片中的實時表達量進行分析，結(jié)果（圖7）表明，SoNCED基因在甘蔗中的表達模式不盡相同。隨脅迫時間的延長，不同處理SoNCED基因均誘導表達，但表達量存在一定差異。在干旱脅迫（WS）、高鹽脅迫（NS）和低溫脅迫（CS）處理下，SoNCED基因的表達量均呈先升后降的變化趨勢，表達量在12 h時達峰值，隨后逐漸下降，72 h與未處理時基本持平；在氧化脅迫（HS）處理下，SoNCED基因的表達量呈升—降—升的變化趨勢，表達量在6 h時達第1次峰值，72 h時達第2次峰值。

3 討論

ABA是植物生長過程中重要的調(diào)控物質(zhì)，在器官的萎蔫或衰老、種子成熟與休眠、果實成熟等生理過程中發(fā)揮重要作用，且對植物抵抗逆境也有重要的調(diào)節(jié)作用（Finkelstein et al.，2008；Qiu and Yu，2009）。前人研究發(fā)現(xiàn)，在植物的抗逆境脅迫中，NCED是ABA合成的限速酶（Zhu et al.，2007；Zhang et al.，2009），NCED基因可通過調(diào)控ABA的生物合成進而調(diào)控其含量，如李康等（2010）對普通小麥和近緣種進行的NCED基因半定量表達結(jié)果顯示，在脫水和鹽脅迫處理下NCED基因的表達量均隨處理時間的增加而明顯增加；在模式植物煙草中過表達酸橘NCED3基因，可明顯增加干旱脅迫下煙草體內(nèi)的ABA含量，而噴施外源ABA可提高酸橘NCED3的表達水平（Neves et al.，2013；Xian et al.，2014）?？梢姡琋CED基因的誘導表達與ABA信號的產(chǎn)生、ABA生物合成及其代謝等存在協(xié)同調(diào)節(jié)作用。

NCED基因受到不同逆境脅迫時有一定的誘導表達，但在不同的逆境脅迫下，表達量及達到峰值的時間存在較大差異。劉江娜等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，棉花GhNCED基因的表達量在干旱處理6 h后達最大值；李瓊瓊等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，大豆GmNCED1基因在受到干旱脅迫12 h時表達量最高，在高鹽脅迫24 h時表達量最高；牛志強等（2015）對煙草進行NCED基因表達差異的研究結(jié)果顯示，干旱脅迫可誘導NCED3-1和 NCED3-2基因過量表達，在處理12 h時表達量達峰值，隨后緩慢下降，且與煙草內(nèi)源ABA的積累規(guī)律一致。本研究結(jié)果表明，SoNCED基因在甘蔗受到干旱、低溫、高鹽和氧化4種脅迫時均能誘導表達，其中對氧化脅迫最敏感。在氧化脅迫6 h表達量出現(xiàn)峰值，推測其與該脅迫方式直接處理葉片有關，也與氨基酸亞細胞定位結(jié)果相對應，預測該蛋白N端有一個由30個氨基酸組成的典型葉綠體靶轉(zhuǎn)運肽，推測SoNCED蛋白主要存在于地上綠色部位，因此當葉片受到氧化脅迫時SoNCED基因積累量最先達到最高值。在干旱、低溫及高鹽脅迫12 h時表達量達峰值，可能與ABA大量合成進而調(diào)控逆境脅迫有關，具體作用機理還需通過進一步的試驗來驗證確定。在模式植物煙草中過量表達柱花草植物的NCED基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)NCED基因后的煙草其內(nèi)源ABA含量及抗干旱脅迫、氧化脅迫和強光脅迫的能力均有所提高，同時提高了煙草的耐旱和耐鹽能力（Zhang et al.，2008）。說明NCED基因不僅可提高植物體內(nèi)的ABA含量，還能有效調(diào)節(jié)植物對于非生物逆境脅迫的適應能力，也初步證實SoNCED基因參與了甘蔗對逆境脅迫的應答，為深入研究該基因的表達調(diào)控及在ABA生物合成途徑中的分子機理打下基礎。

4 結(jié)論

本研究成功克隆獲得SoNCED基因，通過原核表達載體可誘導出目的蛋的，并從不同逆境下的表達情況推測該基因在甘蔗體內(nèi)參與了干旱、低溫、高鹽和氧化等非生物脅迫的調(diào)控過程。

參考文獻：

李長寧. 2012. 水分脅迫下外源脫落酸提高甘蔗抗旱性的機理研究[D]. 南寧：廣西大學.

Li C N. 2012. Mechanism of tolerance to drought in sugarcane plant improved by foliar application of abscisic acid under water stress[D]. Nanning：Guangxi University.

李康，聶小軍，方桂英，王樂，岳華，佘奎軍，宋衛(wèi)寧. 2010. 普通小麥及其近緣種NCED基因的克隆及表達分析[J]. 西北農(nóng)業(yè)學報，19（6）：55-59.

Li K，Nie X J，F(xiàn)ang G Y，Wang L，Yue H，She K J， Song W N. 2010. Cloning and expression of a NCED gene in wheat and its relative species[J]. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，19（6）：55-59.

李瓊瓊，張潔，鄧宇，于威君，高紅桃，靳京，王南，王法微，李海燕. 2014. 大豆GmNCED1基因的克隆及表達模式分析[J]. 中國油料作物學報，36（4）：455-460.

Li Q Q，Zhang J，Deng Y，Yu W J，Gao H T，Jin J，Wang N，Wang F W，Li H Y. 2014. Cloning and expression analysis of GmNCED1 from Glycine max[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences，36（4）：455-460.

李楊瑞，楊麗濤. 2009. 20世紀90年代以來我國甘蔗產(chǎn)業(yè)和科技的新發(fā)展[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報，22（5）：1469-1476.

Li Y R，Yang L T. 2009. New developments of sugarcane industry and technology in China since 1990s[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，22（5）： 1469-1476.

劉江娜，鄧曉艷，李志博，劉菲菲，章杰，郗忠玲，魏亦農(nóng). 2010. 棉花9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因在干旱條件下的表達分析[J]. 石河子大學學報，28（5）：546-551.

Liu J N，Deng X Y，Li Z B，Liu F F，Zhang J，Xi Z L，Wei Y N. 2010. The expression analysis of cotton 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene under drought stress[J]. Journal of Shihezi University（Natural Science），28（5）：546-551.

牛志強，劉國順，師婷婷，張松濤，賈宏昉，張洪映，崔紅，楊永霞. 2015. 煙草NCED3基因的克隆及其干旱脅迫表達分析[J]. 中國煙草學報，21（3）：100-106.

Niu Z Q，Liu G S，Shi T T，Zhang S T，Jia H F，Zhang H Y，Cui H，Yang Y X. 2015. Cloning of NCED3 gene in Nicotiana tabacum and analysis of its drought stress-induced expression[J]. Acta Tabacaria Sinica，21（3）：100-106.

楊錦芬，郭振飛，楊靜. 2007. 柱花草9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因（SgNCED1）的克隆及表達分析[J]. 草業(yè)學報，16（3）：1383-1390.

Yang J F，Guo Z F，Yang J. 2007. Cloning and characteristics of 9 cis epoxycarotenoid dioxygenase gene（SgNCED1） from Stylosanthes guianensis[J]. Acta Prataculturae Sinica，16（3）：1383-1390.

Chernys J T，Zeevaart J A D. 2000. Characterization of the 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase gene family and the regulation of abcisic acid biosynthesis in avocado[J]. Plant Physiology，124：343-353.

Chono M，Honda I，Shinoda S，Kushiro T，Kamiya Y，Nambara E，Kawakami N，Kaneko S，Watanabe Y. 2006. Field stu-

dies on the regulation of abscisic acid content and germinability during grain development of barley：Molecular and chemical analysis of pre-harvest sprouting[J]. Journal of Experimental Botany，57（10）：2421-2434.

Destefano-Beltran L，Knauber D，Huckle L，Suttle J C. 2006. Effects of postharvest storage and dormancy status on ABA content，metabolism，and expression of genes involved in ABA biosynthesis and metabolism in potato tuber tissues[J]. Plant Molecular Biology，61：687-697.

Finkelstein R，Reeves W，Ariizumi T，Steber C. 2008. Molecular aspects of seed dormancy[J]. Annual Review of Plant Bio-

logy，59：387-415.

Hwang S G，Chen H C ，Huang W Y ，Chu Y C，Shii C T，Cheng W H. 2010. Ectopice expression of rice OsNCED3 in Arabidopsis increases ABA leveland alters leafmor phology[J]. Plant Science，178：12-22.

Iuchi S，Kobayashi M，Taji T，Naramoto M，Seki M，Kato T，Tabata S，Kakubari Y，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K. 2001. Regulation of drought tolerance by gene manipulation of 9-cis-epoxycarotenoid，a key in abscisic acid biosynthesis in Arabidopsis[J]. The Plant Journal，27（4）：325-333.

Livak K J，Schmittgen T D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CT method[J]. Methods，25（4）：402-408.

Nambara E，Marion-Poll A. 2005. Abscisic acid biosynthesis and catabolism[J]. Annual Review of Plant Biology，56：165-185.

Neves D M，F(xiàn)ilho M A，Bellete B S，Silva M F，Souza D T，Santos Soares Filho W，Costa M G，Gesteira A S. 2013. Comparative study of putative 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase and abscisic acid accumulation in the responses of Sunki mandarin and Rangpur lime to water deficit[J]. Molecular Biology Reports，40（9）：5339-5349.

Qin X，Zeevaart J A D. 2002. Overexpression a of 9-cis-epoxyearotenoid dioxygenase gene in Nicotiana plumbaginifolia，inereases abscisic acid and phaseic acid levels and enhances brought tolerance[J]. Plant Physiology，128（2）：544-551.

Qiu Y P，Yu D Q. 2009. Over-expression of the stress-induced OSWRKY45 enhances disease resistance and drought tole-

rance in Arabidopsis[J]. Environmental and Experimental Botany，65（1）：35-47.

Rodrigo M J，Alquezar B，Zacarias L. 2006. Cloning arid characterization of two 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase genes，differentially regulated during fruit maturation and under stress conditions， from orange[J]. Journal of Experiment Botany，57：633-643.

Schwartz S H，Qin X，Zeevaart J A. 2003. Elucidation of the indirect pathway of abscisic acid biosynthesis by mutants genes and enzymes[J]. Plant Physiology，131（4）：1591-1601.

Seo M，Koshiba T. 2002. Complex regulation of ABA biosynthesis in plants[J]. Trends in Plant Science，7（1）： 41-48.

Tan B C，Joseph L M，Deng W T，Liu L，Li Q B，Cline K，McCarty D R. 2003. Molecular characterization of the Arabidopsis 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase gene family[J]. The Plant Journal，35（1）：44-56.

Taylor I B，Burbidge A，Thompson A J. 2000. Control of abscisic acid synthesis[J]. Journal of Experimental Botany，51（350）： 1563-1574.

Thompson A J，Jackson A C，Symonds R，Mulholland B J，Dadswell A R，Blake P S，Burbidge A，Taylor I B. 2000. Ectopic expression of a tomato 9-cis-epoxycarotenoid dioxy-

genase gene causes over-production of abscisic acid[J]. The Plant Journal，23（3）：363-374.

Wan X R，Li L. 2006. Regulation of ABA level and water-stress tolerance of Arabidopsis by ectopic expression of a peanut 9-cis-epoxycaroterioid dioxygenase gene[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，347（4）：1030-1038.

Wan X，Li L. 2005. Molecular cloning and characterization of dehydration inducible cDNA encoding a putative 9-cis-epoxycarotenoi dioxygenase in Arachis hypogaea L.[J]. DNA Sequence，16（3）：217-223.

Xian L H，Sun P P，Hu S S，Wu J，Liu J H. 2014. Molecular cloning and characterization of CrNCED1，a gene encoding 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase in Citrus reshni，with functions in tolerance to multiple abiotic stresses[J]. Planta，239： 61-77.

Zhang M，Leng P，Zhang G L，Li X X. 2009. Cloning and functional analysis of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase（NCED）genes encoding a keyenzyme during abscisic acid biosynthesis from peach and grape fruits[J]. Journal of Plant Physio-

logy，166（12）： 1241-1252.

Zhang Y M，Yang J F，Lu S Y， Cai J L，Guo Z F. 2008. Overexpressing SgNCED1 in tobacco increases ABA level，antioxidant enzyme activities，and stress tolerance[J]. Journal of Plant Growth Regulation，27（2）：151-158.

Zhu C，Kauder F，Romer S，Sandmann G. 2007. Cloning of two individual cDNA encoding 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase from Gentiana lutea，their tissue-specific expression and physiological effect in transgenic tobacco[J]. Plant Phy-

siology，164（2）： 195-204.

（責任編輯 王 暉）