褐紋報(bào)春苣苔組織培養(yǎng)與快速繁殖

閆海霞　鄧杰玲　黃昌艷　關(guān)世凱　何荊洲　張自斌　卜朝陽

摘要： 褐紋報(bào)春苣苔（Primulina glandaceistriata）是一種極具觀賞價(jià)值的喀斯特地區(qū)野生花卉，目前尚未有褐紋報(bào)春苣苔組培快繁的研究報(bào)道。該研究以褐紋報(bào)春苣苔的葉片為外植體，通過兩種途徑建立其組培快繁體系。結(jié)果表明：適宜的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6BA 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1，適宜的不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+ZT 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1+活性炭 0.05 g·L1，增殖系數(shù)為11.09；適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+TDZ 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1，適宜的愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+ZT 1.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1，分化系數(shù)為12.46；適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.1 mg·L1+活性炭0.05 g·L1或1/2MS+IBA 0.5 mg·L1+活性炭0.05 g·L1，生根率為100%。該研究結(jié)果成功建立了褐紋報(bào)春苣苔的組培快繁體系，為今后褐紋報(bào)春苣苔的種苗繁殖和遺傳轉(zhuǎn)化提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞： 苦苣苔， 褐紋報(bào)春苣苔， 組織培養(yǎng)， 不定芽， 愈傷組織

中圖分類號： Q943.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

文章編號： 10003142（2017）10127009

褐紋報(bào)春苣苔（Primulina glandaceistriata）是苦苣苔科（Gesneriaceae）報(bào)春苣苔屬（Primulina）的多年生草本植物，本種在廣西靈川縣首次發(fā)現(xiàn)。該種的主要特征是葉片具有棕色的條紋，花朵形態(tài)美麗，四季常綠，是極具觀賞價(jià)值的喀斯特地區(qū)野生花卉。目前尚未有褐紋報(bào)春苣苔的相關(guān)研究報(bào)道，對其物種保護(hù)十分不利。褐紋報(bào)春苣苔的繁殖可以采用種子播種或葉片扦插的方法，但種子細(xì)小不易收集，采種繁瑣，扦插繁殖系數(shù)小，出芽時(shí)間長，不利于人工繁殖的規(guī)模化。離體快繁具有繁殖系數(shù)大、繁殖時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，是人工繁育種苗的極佳手段，也是種質(zhì)資源保存重要手段，如張占江等（2014）利用離體培養(yǎng)的方法對弄崗報(bào)春苣苔進(jìn)行了保存。

離體快繁的途徑有不定芽途徑和愈傷組織誘導(dǎo)途徑。這兩種途徑在苦苣苔科報(bào)春苣苔屬的其他植物上已有報(bào)道，其中以不定芽途徑的相關(guān)報(bào)道較多，侯娜等（2015）以荔波報(bào)春苣苔的葉片為外植體，通過不定芽途徑獲得了再生植株，付傳明等（2015）以條葉報(bào)春苣苔的葉片為外植體，通過不定芽途徑建立了其離體快繁體系，潘梅等（2014）通過不定芽途徑成功建立了煙葉報(bào)春苣苔的再生繁殖體系，張占江等（2013）以條葉報(bào)春苣苔的葉片、種子為外植體，建立了條葉報(bào)春苣苔的組織培養(yǎng)和再生體系。盡管苦苣苔的組培研究逐年增多，但關(guān)于褐紋報(bào)春苣苔的組培研究并未見有報(bào)道。本研究以褐紋報(bào)春苣苔的葉片為材料，通過不定芽途徑和愈傷組織誘導(dǎo)途徑建立其高效穩(wěn)定的組培快繁體系，為褐紋報(bào)春苣苔的物種保育和遺傳轉(zhuǎn)化提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

經(jīng)人工馴化的褐紋報(bào)春苣苔成熟植株，由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

以MS為基本培養(yǎng)基，以培養(yǎng)目的添加不同種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，白砂糖為30 g·L1，瓊脂為6.0 g·L1，pH 5.8～6.2（生根培養(yǎng)用1/2MS為基本培養(yǎng)基，其大量元素和白砂糖為MS培養(yǎng)基中的1/2，其余成分的含量和MS培養(yǎng)基保持一致），配制分裝后，于121 ℃滅菌25 min。冷卻后接種，在溫度（28 ± 1） ℃、光照強(qiáng)度2 000 lx、光照時(shí)間14～16 h·d1的條件下培養(yǎng)。

1.3 外植體的滅菌

春季取健康植株的幼嫩葉片，洗衣粉浸洗10 min，再在流水下沖洗0.5 h，然后轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)進(jìn)行滅菌的操作。先用棉球蘸取75%酒精溶液拭擦葉片的正反兩面，無菌水沖洗5次；再將葉片在75%酒精溶液中浸泡10～12 s，無菌水沖洗5次；最后將葉片在0.1%升汞溶液中浸泡10 min，無菌水沖洗5次。滅菌過程中，輕輕震蕩使葉片充分接觸溶液。滅菌結(jié)束后，將葉片切成1 cm × 1 cm大小，按照葉面朝上、葉背朝下的方式平鋪接入不同的培養(yǎng)基中（圖1：A）。

1.4 不定芽誘導(dǎo)及增殖

1.4.1 不定芽誘導(dǎo)將葉片接入培養(yǎng)基中。每種培養(yǎng)基接種葉片30片，3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d及60 d后，統(tǒng)計(jì)從葉片直接誘導(dǎo)出不定芽的數(shù)量，計(jì)算不定芽誘導(dǎo)率：不定芽誘導(dǎo)率=產(chǎn)生不定芽葉片數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.4.2 不定芽增殖將獲得的不定芽接入增殖培養(yǎng)基中。每種培養(yǎng)基接種不定芽30株，3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d后計(jì)算增殖系數(shù)：增殖系數(shù)=新芽數(shù)/接種芽數(shù)。

1.5 愈傷組織誘導(dǎo)及分化

1.5.1 愈傷組織誘導(dǎo)將葉片接入培養(yǎng)基中。每種培養(yǎng)基接種葉片30片，3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d及60 d后，統(tǒng)計(jì)從葉片直接誘導(dǎo)出的愈傷組織數(shù)、不定芽數(shù)以及愈傷分化出的不定芽數(shù)，計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的葉片數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.5.2 愈傷組織分化培養(yǎng)將獲得的愈傷組織接入愈傷組織分化培養(yǎng)基中。每種培養(yǎng)基接種愈傷組織30塊，3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)新芽分化系數(shù)。

分化系數(shù)=分化新芽數(shù)/接種數(shù)。

1.6 生根培養(yǎng)與煉苗移栽

將具有4片以上葉片的小苗接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基接種小苗30株，3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生根的植株數(shù)量，并對根長、根條數(shù)進(jìn)行記錄，計(jì)算生根率。

待植株生根后，將具有6片以上葉片、根數(shù)7條以上、根長3 cm以上的組培瓶苗放置溫室中煉苗5～7 d后在溫室中進(jìn)行移栽，移栽基質(zhì)為泥炭混合珍珠巖（體積比為2∶1），20 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析以及Duncans 多重比較。小寫字母表示差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1 不定芽以及愈傷組織的誘導(dǎo)

2.1.1 不定芽的誘導(dǎo)從表1可以看出，在30 d的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，添加6BA的培養(yǎng)基可從葉片直接誘導(dǎo)出不定芽，但無愈傷組織形成。在相同的NAA濃度下，不定芽率及不定芽數(shù)隨著6BA濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)6BA濃度為2.0 mg·L1時(shí)，不定芽率以及不定芽數(shù)為最高；在相同的6BA濃度下，不定芽率以及不定芽數(shù)隨著NAA濃度的增加而增加，當(dāng)NAA濃度為1.0 mg·L1時(shí)， 不定

芽率以及不定芽數(shù)最高。在60 d的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，在各培養(yǎng)基上無愈傷組織產(chǎn)生，各培養(yǎng)基之間的不定芽誘導(dǎo)率無顯著差異，均為100.00%，不定芽數(shù)以培養(yǎng)基MS+6BA 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1的最多。綜上可知，6BA結(jié)合NAA可直接從葉片誘導(dǎo)出不定芽（圖1：B），不能直接誘導(dǎo)出愈傷組織，因此，適宜的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6BA 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1。

2.1.2 愈傷組織的誘導(dǎo)從表2可以看出，在30 d的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，添加了TDZ的培養(yǎng)基可從葉片直接誘導(dǎo)出愈傷組織，但無不定芽產(chǎn)生。在相同的NAA濃度下，愈傷誘導(dǎo)率隨著TDZ濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)TDZ濃度為2.0 mg·L1時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率最高；在相同的TDZ濃度下，愈傷誘導(dǎo)率隨著NAA濃度的增加而增加，當(dāng)NAA濃度為1.0 mg·L1時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率最高。在60 d的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，各培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)率無顯著差異，均為100%。此外，未獲得從葉片直接誘導(dǎo)出的不定芽數(shù)，但獲得了從愈傷組織分化出的不定芽，且各培養(yǎng)基之間的由愈傷組織分化出來的不定芽數(shù)具有顯著差異，以培養(yǎng)基為MS+TDZ 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1的不定芽最多，顯著高于其他培養(yǎng)基。綜上可知，TDZ結(jié)合NAA可從葉片誘導(dǎo)出愈傷組織（圖1： C）， 不能直接誘導(dǎo)出不定芽，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，可從愈傷組織分化出不定芽，因此，適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+TDZ2.0 mg·L1+NAA0.10 mg·L1。

2.2 不定芽增殖培養(yǎng)

由表3可以看出，在培養(yǎng)基上附加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽的增殖培養(yǎng)具有不同的影響。增殖系數(shù)隨著KT和NAA濃度的增加而增加，同時(shí)，增殖系數(shù)也隨著ZT和NAA濃度的增加而遞增，當(dāng)ZT為2.0 mg·L1、NAA為0.10 mg·L1，增殖系數(shù)最大，為11.09；當(dāng)NAA的濃度相同時(shí)，ZT處理組增殖系數(shù)顯著高于KT處理組增殖系數(shù)。因此，ZT更有利于褐紋報(bào)春苣苔的不定芽增殖，適宜褐紋報(bào)春苣苔不定芽增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+ZT 2.0 mg·L1+NAA 0.10 mg·L1+活性炭0.05 g·L1，增殖系數(shù)為11.09，在此培養(yǎng)基上，植株生長好，無玻璃化（圖1：D）。

2.3 愈傷組織的分化

由表4可知，隨著植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的增加，愈傷組織的分化系數(shù)隨之增加，并在達(dá)到一定濃度后下降，即在一定的NAA或IAA濃度下，隨著ZT濃度的增加，分化系數(shù)先增加后減少，但變化不顯著；在一定的ZT濃度下，隨著NAA或IAA濃度的增加，分化系數(shù)也呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢。此外，添加NAA培養(yǎng)基的分化系數(shù)的顯著高于添加IAA培養(yǎng)基的分化系數(shù)，當(dāng)ZT濃度為1.0 mg·L1，NAA濃度為0.10 mg·L1時(shí)，分化系數(shù)最大（圖1：E），而添加IAA的培養(yǎng)基，分化得到的植株長勢差，玻璃化嚴(yán)重。綜上可知，生長素中，NAA較IAA更適于褐紋報(bào)春苣苔的愈傷組織分化，適宜的分化培養(yǎng)基為MS+ZT1.0 mg·L1+NAA0.10 mg·L1，分化系數(shù)為12.46，植株長勢好，苗健壯，無玻璃化。

2.4 生根培養(yǎng)與煉苗移栽

2.4.1 生根培養(yǎng)根據(jù)表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析可知，隨著生長素濃度的增加，生根率隨之增加，但增加不顯著。在1/2MS的培養(yǎng)基上附加IBA濃度為0.10 mg·L1和0.50 mg·L1時(shí)，生根率最大，為100%，平均根長無顯著差異，平均根數(shù)存在顯著差異，但植株的生長都健壯。因此，適宜褐紋報(bào)春苣苔生根的培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.1 mg·L1+活性炭0.05 g·L1或1/2MS+IBA 0.5 mg·L1+活性炭0.05 g·L1，生根率為100%，植株健壯，根長，根多，有利于后期的移栽成活（圖1：F、G）。

2.4.2 煉苗移栽移栽好的褐紋報(bào)春苣苔應(yīng)放置在遮陰處，保持空氣濕度在75%以上，早晚澆水，保持基質(zhì)濕潤，20 d后，統(tǒng)計(jì)成活率，為100.00%（圖1：H）。

3討論與結(jié)論

植物生長調(diào)節(jié)劑是組培快繁的重要影響因子，不同種類的植物生長調(diào)節(jié)劑對外植體生長和分化的作用不同，同種植物生長調(diào)節(jié)劑濃度不同，其作用也有差異，因此，對外植體的脫分化、生長和分化有關(guān)鍵作用的是植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的配比。本研究在葉片的初代誘導(dǎo)中采用了兩種不同的細(xì)胞分裂素結(jié)合同一種生長素進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)6BA結(jié)合NAA，僅能誘導(dǎo)不定芽而不能誘導(dǎo)愈傷組織，TDZ結(jié)合NAA僅能誘導(dǎo)愈傷組織而不能誘導(dǎo)不定芽，初代培養(yǎng)后期獲得的不定芽是由愈傷組織分化得到的。這與前人的結(jié)果有所不同：譚曉風(fēng)等（2009）在進(jìn)行莨山唇柱苣苔組培快繁時(shí)，以6BA 1.0 mg·L1結(jié)合NAA 0.5 mg·L1獲得較好的愈傷組織；文弢等（2016）則認(rèn)為TDZ對大苞短毛唇柱苣苔的不定芽誘導(dǎo)起主要作用，濃度為0.5 mg·L1有利于誘導(dǎo)率和不定芽數(shù)量的提高；羅潔等（2016）以培養(yǎng)基MS+TDZ 2.0 μmol·L1+NAA 0.2 μmol·L1為雙片苣苔葉片誘導(dǎo)不定芽發(fā)生的適宜培養(yǎng)基?？梢?，在前人的研究中，6BA結(jié)合NAA可以獲得較好的愈傷組織，而TDZ結(jié)合NAA可以直接從葉片誘導(dǎo)出不定芽。但潘梅等（2015）發(fā)現(xiàn)，采用0.5 mg·L1的TDZ對黃花馬鈴苣苔不定芽的增殖效果并不理想，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果是相一致的。產(chǎn)生這種差異的原因是物種自身基因型的差異，此外，植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度也是導(dǎo)致差異產(chǎn)生的重要原因。

通過組織培養(yǎng)獲得再生植株的途徑有兩個(gè)：一是直接誘導(dǎo)不定芽途徑，二是通過愈傷組織誘導(dǎo)不定芽途徑。在已有的研究中，桂林小花苣苔（蘇以麗，2012；黃寧珍等，2010a）和半蒴苣苔（阮慧澤等，2014；湯正輝等2005）通過兩種途徑成功建立了其組培快繁體系；菱葉報(bào)春苣苔（李翠等，2010）、多齒吊石苣苔（黃寧珍等，2010b）和刺齒唇柱苣苔（湯正輝等，2004）則通過愈傷組織誘導(dǎo)途徑建立了組培快繁體系；而桂黔吊石苣苔（付傳明等，2014）雖然可以誘導(dǎo)出愈傷組織，但愈傷誘導(dǎo)率較低、分化成苗困難。本研究通過兩種途徑成功建立了褐紋報(bào)春苣苔的組培快繁體系，但褐紋報(bào)春苣苔葉片直接誘導(dǎo)不定芽的組培快繁途徑，比通過愈傷組織誘導(dǎo)不定芽途徑更節(jié)省培養(yǎng)時(shí)間，而且可以避免因愈傷組織分化不定芽過程可能產(chǎn)生的變異，因此，直接誘導(dǎo)不定芽途徑是褐紋報(bào)春苣苔組培快繁的有效途徑。

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