海南龍血樹莖干石蠟切片技術(shù)的研究

陳林 王清隆 王祝年

摘要根據(jù)龍血樹的形態(tài)結(jié)構(gòu)和植物生理的特點(diǎn)，以海南龍血樹莖干為試驗(yàn)材料，探討龍血樹莖干的石蠟切片制作條件。該研究結(jié)果可為進(jìn)一步觀察龍血樹莖干的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)提供參考。

關(guān)鍵詞 海南龍血樹；莖干；石蠟切片

中圖分類號(hào)S718.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）10-0005-03

Study on the Paraffin Section Technology of Dracaena cambodiana Stems

CHEN Lin1，WANG Qinglong2，WANG Zhunian2*（1.College of Applied Science and Technology，Hainan University，Danzhou，Hainan 571737； 2.Tropical Crops Genetic Resources Institute，CATAS，Danzhou，Hainan 571737）

AbstractTaking the stems of Dracaena cambodiana as test materials，according to the morphological structure and physiological characteristics of D.cambodiana，the production conditions of their paraffin sections were discussed.The research results can provide basis for observing the microscopic morphological structure of D.cambodiana stems further.

Key wordsDracaena cambodiana；Stem；Paraffin sections

海南龍血樹（Dracaena cambodiana）又名小花龍血樹、柬埔寨龍血樹，其植物形態(tài)、生理特性和劍葉龍血樹極為相似，劍葉龍血樹樹脂也可作為血竭的代用品。海南龍血樹被列為國家二級(jí)保護(hù)野生植物，在海南儋州、東方、樂東、昌江、三亞、文昌等市（縣）均有分布，生于熱帶季雨林或石灰?guī)r山季雨林中背風(fēng)區(qū)的干燥砂土上，同屬多種和變種植物用于園林觀賞。石蠟切片技術(shù)是組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的制片方法，石蠟切片技術(shù)是觀察研究動(dòng)植物形態(tài)發(fā)育和內(nèi)部構(gòu)造的重要技術(shù)，但是對(duì)于不同植物、不同器官及不同組織制片時(shí)需要的具體條件各不相同，切片的質(zhì)量不僅與材料自身及試驗(yàn)操作相關(guān)，還與固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色等步驟的操作和時(shí)間相關(guān)[1-9]，因此應(yīng)根據(jù)植物的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇合適的制片方法。筆者在傳統(tǒng)植物石蠟切片技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合海南龍血樹莖干的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[10]，對(duì)脫水、透明、切片、染色等環(huán)節(jié)的操作技術(shù)進(jìn)行了改善，以期為進(jìn)一步觀察龍血樹莖干的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料。試驗(yàn)材料采自海南省儋州市熱帶植物園，經(jīng)王祝年研究員鑒定為海南龍血樹（Dracaena cambodiana），選取新鮮龍血樹的莖干進(jìn)行石蠟制片。

1.1.2主要試劑。無水乙醇（φ乙醇=99.7%）、冰醋酸、二甲苯、甲醛，均為分析純，由廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；藏紅T（即番紅）、固綠、切片石蠟（60～62 ℃）、中性樹膠，均為分析純，由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.3主要儀器。光學(xué)顯微鏡、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、塑料載玻片染色缸、鼓風(fēng)干燥箱、烤片機(jī)、酒精燈、切片盒等。

1.2試驗(yàn)方法

依據(jù)傳統(tǒng)的石蠟切片流程中的固定、脫水、透明、浸蠟、包埋與修蠟、切片、粘片、脫蠟與染色、封片環(huán)節(jié)，根據(jù)龍血樹莖干的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，著重對(duì)脫水、透明、切片、染色等流程進(jìn)行了改善。選取染色效果優(yōu)良、完整的切片在顯微系統(tǒng)下進(jìn)行顯微觀察并拍照。

1.2.1試劑的配制。FAA固定液：V70%乙醇∶V冰醋酸∶V37%甲醛=90∶5∶5。番紅染液：將1.0 g番紅溶于100 mL 70%乙醇中。固綠染液：將0.5 g固綠溶于100 mL 95%乙醇中。其他試劑均按照常規(guī)方法進(jìn)行配制。

1.2.2取材與固定。

從龍血樹植株上取下莖干后立即進(jìn)行分割，并迅速固定。分割莖干要快、準(zhǔn)，分割長度為5～8 mm，放入有FAA固定液的廣口瓶中，并貼上標(biāo)簽。固定用50 mL玻璃廣口瓶，每個(gè)小瓶中放置4～5段莖干，固定24 h。

1.2.3脫水與透明。對(duì)于脫水與透明環(huán)節(jié)，時(shí)間是關(guān)鍵，而脫水與透明二者密切相關(guān)。脫水越充分，透明效果也就越好。按照以下流程進(jìn)行透明與脫水：50%乙醇20 min → 70%乙醇20 min → 80%乙醇20 min → 95%乙醇20 min →無水乙醇 Ⅰ 30 min →無水乙醇 Ⅱ 30 min → 1/2 100%二甲苯+1/2無水乙醇30 min → 100%二甲苯 Ⅰ 30 min → 100%二甲苯 Ⅱ 30 min。

1.2.4浸蠟與包埋。按照以下流程進(jìn)行浸蠟（在60 ℃恒溫箱中操作）：

2/3 100%二甲苯+1/3 純石蠟→1/3 100%二甲苯+2/3 純石蠟→純石蠟 Ⅰ→純石蠟 Ⅱ。 2/3 100%二甲苯+1/3 純石蠟中可放置4～8 h或過夜，1/3 100%二甲苯+2/3 純石蠟中放置2 h，再轉(zhuǎn)入融化的純石蠟中2次，每次放置2 h。然后，將浸蠟后的試驗(yàn)材料倒入固定槽中靜置、冷卻至凝固狀。

1.2.5切片、貼片與烤片。

將蠟塊修成上、下兩邊平行的正方形或長方形，粘在小木塊支座上。用切片機(jī)夾好小木塊支座，將蠟塊切成9～12 μm的薄片。切下的薄片自然形成蠟帶，把切好的蠟帶用毛筆輕放在干凈的紙上，光面朝下。用膠頭滴管在玻片中央滴少許蒸餾水，蒸餾水的用量視蠟帶長短而定。若蠟帶比較窄，可在載片上放置1～2排蠟帶。用鑷子和解剖針將蠟帶轉(zhuǎn)移到蒸餾水上，蠟帶慢慢平展。待完全平展后，用解剖針將切片位置撥正，傾去載玻片上多余的水或用吸水紙放在載玻片邊緣吸去多余水后，按照從上到下的順序從烤片機(jī)左上角依次排列載玻片，在45 ℃烤片機(jī)上干燥24 h以上[2]。

1.2.6脫蠟、透明、染色與封片。切片先按照以下流程進(jìn)行脫蠟與透明：100%二甲苯 Ⅰ 20 min → 100%二甲苯 Ⅱ 20 min → 1/2 100%二甲苯+1/2無水乙醇20 min →無水乙醇 Ⅰ 5 min →無水乙醇 Ⅱ 5 min → 95%乙醇5 min → 80%乙醇5 min → 番紅染色22 h → 70%乙醇3～5 s→ 50%乙醇3～5 s → 70%乙醇5 min → 80%乙醇5 min → 95%乙醇5 min → 固綠染色3～5 s → 95%乙醇5 min →無水乙醇5 min →無水乙醇5 min → 1/2 100%二甲苯+1/2無水乙醇5 min → 100%二甲苯Ⅰ 5 min → 100%二甲苯 Ⅱ 5 min。采用番紅和固綠對(duì)切片進(jìn)行染色，先在染色缸中用番紅溶液染色22 h，然后在固綠溶液中染色3～5 s。完成以上過程后就可用樹膠封固，制成永久裝片。

1.2.7顯微結(jié)構(gòu)觀察。利用顯微鏡對(duì)海南龍血樹的莖干結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并通過顯微成像系統(tǒng)軟件對(duì)制作的石蠟切片進(jìn)行拍照。

2結(jié)果與分析

海南龍血樹的莖干結(jié)構(gòu)（圖1）與劍葉龍血樹十分相似，莖干的初生結(jié)構(gòu)由外至內(nèi)依次為：表皮、皮層及基本組織、散生的初生維管束。在老莖中栓化層是皮層外部細(xì)胞通過壁加厚栓化后形成的能代替表皮起保護(hù)作用的層次。皮層及基本組織由一條環(huán)帶的形成層來劃分?；窘M織由大量排列緊密的、徑向排列的、近圓形或長方形或方形的薄壁細(xì)胞組成，有的細(xì)胞中還可見草酸鈣針晶束。初生外韌有限維管束大而稀疏，分布位置靠近老莖的中央即散生于內(nèi)基本組織中。次生周木有限維管束小而密，輪廓呈橢圓形或近圓形，數(shù)目眾多，徑向排列于外基本組織中[10]。

針對(duì)海南龍血樹的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及在石蠟制片中出現(xiàn)的問題，經(jīng)過大量摸索得到其合適的石蠟切片制作方案，與普通的石蠟切片方法[11-14]相比，對(duì)脫水、透明、切片、染色等環(huán)節(jié)進(jìn)行了改進(jìn)，提高了制片成功率，制片效率得以提高，切片質(zhì)量（圖2 A～D）也有所提高。

2.1取材與固定環(huán)節(jié)

取材時(shí)應(yīng)立即對(duì)材料進(jìn)行分割，并放入有FAA固定液的廣口瓶中。FAA固定液具有滲透快、不使組織膨脹或收縮能夠保持原形、硬化組織的程度適中、能增加染色能力、具有保存劑的作用等特點(diǎn)。每個(gè)廣口瓶中固定的材料不能過多，若材料過多會(huì)相互碰撞造成組織受損，或固定不充分，以4～5個(gè)材料為宜。材料固定的時(shí)間至少24 h。

2.2脫水與透明環(huán)節(jié)

脫水先用低濃度乙醇，然后遞增乙醇濃度，直至無水乙醇。脫水必須在有蓋的玻璃器皿中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分。在低濃度乙醇中每級(jí)停留時(shí)間不能太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體；在高濃度乙醇中每級(jí)也不能停留太長時(shí)間，否則可使組織收縮變硬，影響切片[8]。在透明這個(gè)環(huán)節(jié)，脫水越充分，透明效果就越好。在進(jìn)行透明時(shí)，隨著時(shí)間的推移，能夠觀察到組織逐漸變得透明，最終整個(gè)組織都呈透明狀。二甲苯是有毒試劑，且易揮發(fā)，因此在進(jìn)行透明時(shí)要帶上口罩、手套，使用二甲苯后要隨時(shí)蓋緊蓋子，更換試劑時(shí)動(dòng)作要快。

根據(jù)海南龍血樹莖干的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為使試驗(yàn)材料在試驗(yàn)過程中不收縮，設(shè)計(jì)了5個(gè)乙醇濃度梯度，同時(shí)也使龍血樹能夠保證徹底脫水，與傳統(tǒng)的石蠟切片方法相比，縮短了脫水環(huán)節(jié)所需要的時(shí)間（每個(gè)梯度20 min），但又不影響后期切片的質(zhì)量。在透明環(huán)節(jié)，設(shè)置2個(gè)濃度梯度，對(duì)透明時(shí)間也進(jìn)行了調(diào)整。通常制片時(shí)建議采用以下流程：1/3二甲苯+ 2/3無水乙醇、1/2二甲苯+ 1/2無水乙醇、2/3二甲苯+ 1/3無水乙醇[12]。為了使材料能夠充分透明，將透明過程改為：1/2 100%二甲苯+1/2無水乙醇→ 100%二甲苯 Ⅰ→ 100%二甲苯 Ⅱ，試驗(yàn)結(jié)果表明在每個(gè)濃度梯度處理30 min能達(dá)到試驗(yàn)預(yù)期的目標(biāo)。

2.3浸蠟與包埋環(huán)節(jié)若浸蠟時(shí)溫度過高，會(huì)引起材料變硬變脆而收縮，造成切片質(zhì)量不高甚至失敗；若溫度過低，石蠟就不能完全熔化，難以均勻地滲透到組織內(nèi)部，造成組織與石蠟脫離，蠟塊中出現(xiàn)氣泡﹑裂隙。浸蠟期間要保持恒溫箱的溫度恒定，切忌忽高忽低。移材料的鑷子最好一起放在恒溫箱中，否則鑷子插入或移出后，尖端的石蠟容易凝固，造成操作困難[15]。為了節(jié)省時(shí)間，可以提前將蠟塊溶解，而浸蠟前一定要將石蠟溶解并過濾后再使用，減少其他因素的影響。包埋過程最好在恒溫箱中操作，避免溫差過大，影響石蠟浸入組織的均勻度，在切片時(shí)會(huì)出現(xiàn)植物組織從臘帶上脫落的情況，時(shí)間上也要盡量縮短，否則也會(huì)出現(xiàn)同樣的情況。包埋后的石蠟塊應(yīng)呈均勻的半透明狀態(tài)，但有時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色混濁結(jié)晶、氣泡等，影響切片。

2.4切片環(huán)節(jié)

切片前要將蠟塊修成上、下兩邊平行的面，這樣切成的蠟帶呈直線。如果上、下兩邊不平行，蠟帶容易彎曲。要將蠟塊修得盡可能小，在材料的周圍不要留太多的蠟，否則一張玻片只能貼幾個(gè)切片。通常修整蠟塊時(shí)留蠟邊3 mm左右較合適。為了保證石蠟塊牢固地黏在木塊上，可用解剖刀粘取少許石蠟碎屑放在固著蠟塊的木塊四周，解剖刀加溫后迅速將石蠟碎屑熔化燙平。石蠟塊固著后要放置幾分鐘，使其完全凝固，否則切片時(shí)蠟塊易脫落[15]。

在對(duì)組織進(jìn)行切片時(shí)，選擇9、12、16、20 μm等厚度進(jìn)行切片試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在16、20 μm切片容易出現(xiàn)重疊現(xiàn)象（圖2 E），9 μm厚度的切片效果最好。在切片時(shí)片刀必須鋒利，沒有缺口，最好使用新刀片。若刀片太鈍，會(huì)使蠟帶自行卷起或皺起（圖2 F和G），或使組織出現(xiàn)傷痕，甚至使切片破碎（圖2H）、不完整，從而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。

2.5染色環(huán)節(jié)

染色是利用石蠟切片觀察和診斷的關(guān)鍵步驟，該過程中容易出現(xiàn)的問題是切片染色對(duì)比不清晰和容易脫片。染色對(duì)比不清晰有以下原因：①固綠染色太深；②番紅染色不夠或過深。因此，染色液的濃度要準(zhǔn)確配制，酸堿度要適中，且不能有沉淀。染色時(shí)脫片是由于組織切片在染色的系列溶液中浸泡時(shí)間較長或貼片不好造成的[5]。染色時(shí)最好選用染色缸進(jìn)行染色，可以一次對(duì)多個(gè)切片進(jìn)行染色，還可以減少對(duì)切片的移動(dòng)而造成的脫片。

在試驗(yàn)過程中也對(duì)染色時(shí)間進(jìn)行了摸索，通過番紅的染色時(shí)間10和22 h等時(shí)長進(jìn)行染色條件摸索，結(jié)果表明在番紅染色10 h的效果不如22 h的染色效果。固綠能夠迅速染色，所以3～5 s即可得到具有較好染色效果的切片。

2.6封片環(huán)節(jié)

在進(jìn)行封片時(shí)，要盡量縮短操作時(shí)間，

避免組織長時(shí)間暴露在空氣中被氧化，滴加中性樹膠和用蓋玻片進(jìn)行封片時(shí)也要避免氣泡的產(chǎn)生（圖2 I）。封片時(shí)要根據(jù)材料與蓋玻片的大小來評(píng)估所需樹膠的滴數(shù)。若樹膠過多，蓋玻片容易滑動(dòng)，對(duì)封片造成影響；若樹膠過少，不能將組織完全覆蓋，部分組織會(huì)被氧化。封片時(shí)動(dòng)作要輕而快，盡量避免口﹑鼻呼吸對(duì)切片的影響；在樹膠未干前，不能用手去動(dòng)蓋玻片，避免蓋玻片移動(dòng)對(duì)切片質(zhì)量的影響。

3結(jié)論

經(jīng)過“取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、烤片、脫蠟、透明、染色、封片”一系列環(huán)節(jié)制得永久制片，其切片染色清楚，細(xì)胞界限清晰，植物組織完整，石蠟切片干凈，表皮細(xì)胞被染成紅色，基本組織被染成綠色。通過對(duì)切片進(jìn)行顯微觀察，可以清楚看到表皮、皮層及基本組織、維管束等組織結(jié)構(gòu)。

石蠟切片技術(shù)是組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的制片方法，也是觀察研究動(dòng)植物形態(tài)發(fā)育和內(nèi)部構(gòu)造的重要技術(shù)，但是對(duì)于不同植物、不同器官、不同組織制片時(shí)需要的條件各不相同。切片的質(zhì)量不僅與材料自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相關(guān)，而且與固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色等環(huán)節(jié)的操作和時(shí)間相關(guān)。

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