木薯種子體細胞胚誘導發(fā)生及植株再生體系建立

韋祖生　楊秀娟　付海天　田益農(nóng)

摘要：【目的】建立木薯雜交種子誘導體細胞胚發(fā)生及植株再生體系，為木薯育種及種質(zhì)創(chuàng)新提供技術(shù)參考。【方法】以不同成熟度的木薯華南5號（SC5）雜交種子組織為外植體材料，包括未成熟種子子葉（a1）和胚芽（b1）、成熟種子子葉（a2）和胚芽（b2）及誘導萌發(fā)種子子葉（a3）、胚芽（b3）和胚軸（c3），利用不同外源激素誘導其體細胞胚胎發(fā)生、子葉器官形成、不定芽（莖葉器官）發(fā)生和生根，并比較不同外源激素的誘導效果。【結(jié)果】利用基本培養(yǎng)基（M1）預培養(yǎng)外植體材料可有效控制其污染率（<5.00%），保持其生物活性（>90.00%），預培養(yǎng)材料的褐化率比對照（未預培養(yǎng)，CK）降低30.00%～40.00%，且預培養(yǎng)的子葉（a）、胚芽（b）和胚軸（c）膨大率分別比cK提高6.67%～13.33%、6.67%～50.00%和20.00%。利用4.00 mg/L 2，4-D和12.00 mg/L Picloram誘導體細胞胚胎發(fā)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚芽出胚率較高，胚軸次之，子葉較低；成熟度高的種子材料出胚率高于成熟度低的種子材料；4.00 mg/L 2，4-D誘導的體細胞胚胎發(fā)生效果優(yōu)于12.00 mg/L Picloram。0.10 mg/L BAP和1.00 mg/L NAA均可誘導體細胞胚胎分化、增殖，但0.05 mg/L BAP+0.50 mg/L NAA誘導下a、b和c體細胞胚胎增殖率均比單獨添加0.10 mg/L BAP或1.00 mg/L NAA顯著提高（P<0.05，下同）。a2、a3、b1、b2、b3和c3的不定芽發(fā)生率分別為30.00%、40.00%、40.00%、53.33%、70.00%和13.33%，即對于同一組織，成熟度高的種子材料體細胞誘導不定芽發(fā)生效果優(yōu)于成熟度低的種子材料，且不同成熟度的種子均以b最優(yōu)。a2、a3、b1、b2、b3和c3的生根率分別為23.33%、23.33%、16.67%、30.00%、56.67%0，其中b3的生根率顯著高于其他材料，a2、a3、b1和b2的生根率無顯著差異，也表現(xiàn)為成熟度高的種子材料比成熟度低的種子材料更易誘導生根，發(fā)育更好。7種不同成熟度的雜交種子材料組織中，a2、a3、b1、b2和b3經(jīng)體細胞誘導獲得再生植株，成功率為71.43%?！窘Y(jié)論】通過預培養(yǎng)可有效防止木薯雜交種子組織褐化，提高其膨大誘導效果。在木薯生產(chǎn)中，應在培養(yǎng)基中添加4.00 mg/L2，4-D進行體細胞胚胎發(fā)生誘導，混合添加0.05 mg/L BAP和0.50 mg/L NAA進行體細胞胚胎增殖培養(yǎng)，且應選擇成熟度高的種子材料（如萌發(fā)種子胚芽等）作為外植體材料。

關(guān)鍵詞：木薯；種子；體細胞；誘導；再生

中圖分類號：S533.035.3 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2129-07

0引言

【研究意義】木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科木薯屬植物，是全球重要的糧食作物和經(jīng)濟作物，也是我國工業(yè)發(fā)展中淀粉原材料的主要來源。在自然條件下，木薯可異花授粉形成蒴果，產(chǎn)生雜交種子，因此有性雜交是木薯育種最常規(guī)、最有效的方法。近年來，國際熱帶農(nóng)業(yè)研究中心（CIAT）通過優(yōu)化木薯雜交后代的田間選育程序縮短新品種選育周期（Ceballos et al.，2012），但木薯是基因高度雜合的群體，在雜交育種工作過程中常遇到種子胚敗育、種子成熟度低、數(shù)量少等技術(shù)難題。因此，開展木薯雜交種子體細胞胚胎誘導發(fā)生及其植株再生研究，離體培養(yǎng)雜交種子幼胚體，誘導體細胞發(fā)生（分化、增殖）、莖葉器官形成及生根，最終發(fā)育成新植株，不僅能提高雜交種子的成株率，打破育種瓶頸，還獲得大量無性株系，對木薯遺傳育種研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，以植物細胞全能性為理論基礎的組織培養(yǎng)技術(shù)已日趨成熟。在適宜條件下，任何一個植物細胞均可發(fā)育成一個新植株（劉進平，2005；鄭成木和劉進平，2006），如把未成熟的種子幼胚體剝離出來，接種在人工合成的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可發(fā)育成正常植株，是解決種子敗育的有效途徑（Zhang et al.，2000；陳穎等，2011；宋劍靈等，2012；陸柳英等，2014；孫貝貝等，2016）。根據(jù)植物種子胚齡大小，種子胚培養(yǎng)可分為幼胚培養(yǎng)和成熟胚培養(yǎng)：幼胚培養(yǎng)不僅能克服遠緣雜交的不親和性，對雜交種子進行“胚挽救”，還能有效提高植株繁育率；成熟胚培養(yǎng)能有效提高種子發(fā)芽率和增殖率，“搶救”儲藏過久或儲藏不當?shù)姆N子（賀濤等，2012）。宋劍靈等（2012）研究表明，不同發(fā)育期的木薯幼胚萌發(fā)率為5.00%～100.00%；趙珊珊等（2010）、郭軍輝（2012）利用木薯脆性胚性愈傷發(fā)生及芽器官發(fā)生誘導技術(shù)已建立成熟的木薯體細胞再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，不僅可獲得大量無性株系，還可對其進行遺傳改良，成功培育木薯新品種（系）?！颈狙芯壳腥朦c】至今，尚無利用木薯雜交種子誘導體細胞胚胎發(fā)生及再生植株的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以不同成熟度的華南5號（SC5）雜交種子組織為外植體材料，利用不同外源激素誘導其體細胞胚胎增殖、子葉器官形成、不定芽（莖葉器官）發(fā)生和生根，并比較不同外源激素的誘導效果，優(yōu)化木薯種子體細胞胚胎誘導發(fā)生及其植株再生體系，為木薯種質(zhì)創(chuàng)新和雜交育種提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

SC5由廣西木薯研究所提供，于2013-2015年在廣西亞熱帶作物研究所木薯種質(zhì)圃和中國科學院（上海）植物生理生態(tài)研究所三亞大茅育種基地進行開放式雜交育種試驗，收集雜交種子。主要試劑：基礎培養(yǎng)基（MS）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸（Picloram）、6-芐基腺嘌呤（BAP）和a-萘乙酸（NAA）均購于上海美艾斯生物科技有限公司。主要儀器設備：高壓蒸汽滅菌鍋（LDZF-30KB）、超凈工作臺（SW-CJ-1FD/1F）和人工氣候培養(yǎng)箱（RQH-250）等。

1.2試驗方法

1.2.1培養(yǎng)基配制 由于2，4-D和Picloram可誘導植物體細胞胚胎發(fā)生，BAP和NAA可促進植物細胞分化和增殖，因此，本研究參照前人研究結(jié)果（趙珊珊等，2011；張東向等，2011；宋劍靈等，2012；陸柳英等，2014）對培養(yǎng)基的激素濃度進行改良?；九囵B(yǎng)基（M1）：基礎培養(yǎng)基（MS，含維生素）+2.00 μmol/LCuSO₄+2.00%蔗糖+0.30%Gelrite，pH 5.8；誘導膨大培養(yǎng)基（M2）：MI+10.00 mg/L BAP，pH 5.8；誘導體細胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)基（M3）：M1+4.00 mg/L 2，4-D或12.00 mg/L Picloram，pH 5.8；誘導體細胞胚胎增殖培養(yǎng)基（M4）：MI+0.10 mg/L BAP或1.00 mg/L NAA或0.05 mg/L BAP+0.50 mg/L NAA，pH 5.8；誘導體細胞胚胎成熟培養(yǎng)基（M5）：M1+0.10 mg/L BAP+0.50 mg/L IBA，pH 5.8；誘導莖葉器官發(fā)生及生根培養(yǎng)基（M6）：M1+0.40 mg/L BAP，pH 5.8。

1.2.2樣品采集及前處理 采集不同成熟度的雜交種子組織，包括未成熟種子（圖1-A）子葉（a1）和胚芽（b1）、成熟種子（圖1-B）子葉（a2）和胚芽（b2）及誘導萌發(fā)種子（圖1-C）子葉（a3）、胚芽（b3）和胚軸（c3）。種子材料消毒處理：ddH20沖洗30 s，2次→無水乙醇浸泡沖洗10 s→ddH₂O沖洗30 s，2次→0.1%升汞浸泡沖洗（未成熟/成熟種子2 min，誘導萌發(fā)種子60 s）1次→ddH₂O沖洗30 s，2次→75%乙醇浸泡沖洗20 s，2次+ddH₂O浸泡沖洗30 s，2次→無菌濾紙吸干。在無菌條件下，解剖、切取子葉（a）、胚芽（b）和胚軸（c）（2.00～3.00 mm）為外植體材料，放置于M1上培養(yǎng)基上保濕，每皿10個外植體，3次重復。

1.2.3膨大誘導處理 將外植體置于M1進行預培養(yǎng)處理3 d，以無預培養(yǎng)材料為對照（CK），然后轉(zhuǎn)置于M2，26.0℃下16 h光/8 h暗、光照強度800～1000 lX培養(yǎng)1周；在體視顯微鏡下，用無菌針頭挑取無褐化的膨大材料（圖1-D和圖1-E）備用，并統(tǒng)計不同種子材料的污染率、褐化率及膨大率。

1.2.4體細胞胚胎發(fā)生誘導 將膨大材料轉(zhuǎn)置于M3，26.0℃下24 h暗培養(yǎng)2周。每隔3 d在體視顯微鏡下觀察體細胞胚胎的發(fā)生情況，當出現(xiàn)球型胚和魚雷型胚繭狀嵌合體（圖1-F和圖1-G），將其分離后于M3繼代培養(yǎng)，統(tǒng)計不同種子材料的出胚率。

1.2.5體細胞胚增殖培養(yǎng) 將體細胞胚胎轉(zhuǎn)置于M4，26.0 ℃下16h光/8 h暗培養(yǎng)，光照強度800～1000 lx，誘導體細胞胚胎分化、增殖（圖1-H和圖1-I），每2周繼代1次，觀察體細胞胚胎分化情況，統(tǒng)計不同種子材料的體細胞胚胎增殖率。

1.2.6體細胞胚胎成熟及子葉器官發(fā)生誘導 將2～3個體細胞胚胎組成的小團簇置于M5，26.0℃下24 h光培養(yǎng)，光照強度800-1000 lx培養(yǎng)，2周后觀察體細胞胚狀體成熟及不定芽誘導發(fā)生情況，直至觀察到出現(xiàn)有子葉明顯長大并變綠（圖1-J和圖1-K），再繼代培養(yǎng)，并及時處理褐化材料，統(tǒng)計不同種子材料的不定芽發(fā)生率。

1.2.7莖葉器官伸長及生根誘導 切取3.00～5.00cm長的成熟不定芽（圖1-L）或面積約0.04 cm2綠色子葉（圖1-M）置于M6，26.0℃下16 h光/8 h暗培養(yǎng)，光照強度800-1000 lx，每周繼代1次，3周后觀察莖葉器官伸長及生根情況（圖1-N和圖1-O），并統(tǒng)計不同種子材料的生根率。

1.2.8再生植株繼代培養(yǎng) 將再生植株小苗轉(zhuǎn)置于M1，26.0℃下16 h光/8 h暗培養(yǎng)，光照強度800～1000 lX，每2周繼代培養(yǎng)1次，繁育無性株系。

1.3統(tǒng)計分析

采用SAS 9.0和SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行整理分析。

2結(jié)果與分析

2.1膨大誘導處理結(jié)果

通過外植體預培養(yǎng)可有效控制外植體污染率（<5.00%）和保持其生物活性（>90.00%）。將外植體置于M1預培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)置于M2進行誘導膨大培養(yǎng)，結(jié)果表明，預培養(yǎng)材料的褐化率比CK降低30.00%～40.00%；預培養(yǎng)的a、b和c膨大率分別比CK提高6.67%～13.33%、6.67%～50.00%和20.00%，且同一成熟度種子材料的不同組織膨大率均存在顯著差異（P<0.05，下同），以a的膨大率最低（圖2）。綜上所述，外植體預培養(yǎng)可有效防止其褐化，提高其膨大誘導效果。

2.2體細胞胚胎發(fā)生誘導結(jié)果

將膨大外植體置于M3誘導其體細胞胚胎發(fā)生，結(jié)果表明，4.00 mg/L 2，4-D誘導下不同種子材料的出胚率存在一定差異，其中a1為0，a2為3.33%，a3為13.33%，b1為6.67%，b2為36.67%，b3為56.67%，c3為50.00%；12.00 mg/L Picloram誘導下不同種子材料的出胚率也存在差異，其中a1為0，a2為6.67%，a3為13.33%，b1為10.00%，b2為30.00%，b3為50.00%，c3為33-33%；4.00 mg/L 2，4-D和12.00 mg/L Picloram誘導下a1、a2和a3的出胚率均無顯著差異（P>0.05，下同）（圖3-A），而b1、b2和b3的出胚率均存在顯著差異（圖3-B）；4.00 mg/L 2，4-D誘導3的出胚率比12.00 mg/LPicloram提高了16.67%，但差異不顯著（圖3-C）。綜上所述，以b的出胚率較高，c次之，a較低，且4.00mg/L 2，4-D的體細胞胚胎發(fā)生誘導效果優(yōu)于12.00mg/L Picloram，成熟度高的種子材料更有利于誘導體細胞胚胎發(fā)生。

2.3體細胞胚胎增殖培養(yǎng)結(jié)果

將體細胞胚胎置于M3誘導其分化、增殖，結(jié)果表明，0.10 mg/L BAP誘導下a、b和c的體細胞胚胎增殖率分別為26.67%，36.67%和33.33%；1.00 mg/LNAA誘導下a、b和c的體細胞胚胎增殖率分別為23.33%、36.67%和40.00%，0.10 mg/L BAP誘導下a、b和c的體細胞胚胎增殖率與1.00 mg/L NAA均無顯著差異；0.05 mg/L BAP+0.50 mg/L NAA誘導下a、b和c的體細胞胚胎增殖率分別為73.33%、83.33%和73.33%，比單獨使用0.10 mg/L BAP分別顯著提高46.66%、46.66%和40.00%，比單獨使用1.00 mg/LNAA分別顯著提高50.00%、46.66%和33.33%（圖4）。綜上所述，混合使用0.05 mg/L BAP和0.50 mg/LNAA能更有效地促進體細胞胚胎分化和增殖。

2.4體細胞胚胎成熟及子葉器官發(fā)生誘導結(jié)果

將體細胞胚胎小團簇置于M5誘導其成熟及子葉器官發(fā)生，結(jié)果表明，a2、a3、b1、b2、b3和c3的不定芽發(fā)生率分別為30.00%、40.00%、40.00%、53.33%、70.00%和13.33%，其中b3不定芽發(fā)生率顯著高于其他材料，b1、b2、a2和a3的不定芽發(fā)生率無顯著差異，a1、a2和c3間的不定芽發(fā)生率差異顯著（圖5）；誘導體細胞胚胎成熟較容易，但誘導子葉器官發(fā)生較難，誘導胚狀體不定芽形成存在明顯差異，多數(shù)以葉簇的形式生長（圖1-J），少數(shù)胚狀體相對獨立，發(fā)育成完整的綠色子葉（圖1-K）。綜上所述，對于同一組織，成熟度高的種子材料體細胞誘導不定芽發(fā)生效果優(yōu)于成熟度低的種子材料，且不同成熟度的種子均以b最優(yōu)。

2.5莖葉器官伸長及生根誘導結(jié)果

將成熟不定芽或綠色子葉置于M5進行培養(yǎng)，胚狀體子葉逐漸變粗、增長，發(fā)育為莖葉器官，而誘導其生根較難。由圖6可知，a2、a3、b1、b2、b3和c3的生根率分別為23.33%、23.33%、16.67%、30.00%、56.67%和0，其中b3的生根率顯著高于其他材料，a2、a3、b1和b2的生根率無顯著差異，c3未獲得誘導生根材料，表明對于同一組織，成熟度高的種子材料比成熟度低的種子材料更易誘導生根，發(fā)育更好，且不同成熟度的種子均1）Ab最優(yōu)。綜上所述，7種不同成熟度的雜交種子材料中，a2、a3、b1、b2和b3經(jīng)體細胞誘導獲得再生植株，成功率為71.43%。

2.6不定芽及再生株系的培養(yǎng)與擴繁

將不定芽及再生株系轉(zhuǎn)置于M1，每2周繼代培養(yǎng)1次，可有效獲得大量無性株系，a2、a3、b1、b2和b3的擴繁率無顯著差異。經(jīng)過3次繼代培養(yǎng)，獲得了再生植株共269株，其中a2有40株，a3有52株，b1有43株，b2有66株和b3有68株。

3討論

目前，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已日趨完善和成熟，但仍存在很多因素影響其成功率。其中，外植體材料是決定植物組織培養(yǎng)中植株繁殖速率和再生植株直立的重要因素。本研究選取外植體材料的理論依據(jù)：子葉為種子萌發(fā)提供養(yǎng)料，也是暫時性葉器官，幼苗出土后可進行光合作用；胚芽位于胚軸的頂端，具有極小幼葉（真葉—初生葉）包卷，萌發(fā)后發(fā)育成幼苗的葉和莖；胚軸為子葉著生點與胚根之間的軸體，發(fā)育成為連接莖和根的部分。結(jié)果表明，在不同木薯種子材料中，胚芽體細胞出胚率較高，胚軸次之，子葉較低，其原因是胚芽為細胞分化、發(fā)育最旺盛的組織部分。但對于同一組織，成熟度高的種子材料明顯優(yōu)于成熟度低的種子材料。其次外植體消毒和滅菌處理是植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，常用的消毒液為無水/75.0%乙醇和0.10%升汞，可使生物細胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性、失活、致死，從而達到滅菌的目的，但對外植體材料有毒害作用，使其產(chǎn)生褐化、水漬狀壞死及腐爛。本研究根據(jù)外植體材料特點選擇最佳消毒劑量和消毒時間，外植體消毒均在無菌條件下進行，并在短時間內(nèi)進行反復多次的液體浸泡沖洗（其中0.1%升汞1次，無水乙醇1次，75%乙醇2次，ddH₂O共8次，消毒時間控制在6～7 min），既有利于消毒液對有害生物的滅活、清除，還能及時去除殘留在外植體的消毒液，減少對其毒害作用，提高材料的使用效率。

此外，培養(yǎng)基中外源激素種類及濃度也是植物組織培養(yǎng)的重要影響因素。本研究將2，4-D和Piclo-ram添加至誘導培養(yǎng)基中，其原因是二者均可干擾植物體內(nèi)激素平衡，影響核酸和蛋白質(zhì)代謝，從而促進或抑制某些器官生長發(fā)育。已有研究表明，2，4-D既可誘導愈傷組織發(fā)生，也可抑制細胞進一步發(fā)育，而Picloram在誘導培養(yǎng)后期對體細胞胚胎的發(fā)育不具有明顯抑制作用（殷麗青等，2013）。本研究結(jié)果表明，2，4-D和Picloram可誘導體細胞胚狀體發(fā)生，與郭軍輝（2012）研究結(jié)果相符。本研究還發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加BAP（0.10 mg/L）或NAA（1.00 mg/L）均可誘導木薯體細胞胚胎分化、增殖，但混合添加BAP（0.05 mg/L）和NAA（0.5 mg/L）可極顯著提高體細胞胚胎增殖率，進一步證實混合添加激素對植物體細胞胚胎分化增殖具有促進效應（別曉敏等，2011；時劍等，2011；張燕等，2013）。

4結(jié)論

以木薯雜交種子組織外植體經(jīng)預培養(yǎng)可有效防止其褐化，提高膨大誘導效果。在實際生產(chǎn)中，應在培養(yǎng)基中添加4.00 mg/L 2，4-D進行體細胞胚胎發(fā)生誘導，混合添加0.05 mg/L BAP和0.50 mg/L NAA進行體細胞胚胎增殖培養(yǎng)，且應選擇成熟度高的種子材料（如萌發(fā)種子胚芽等）作為外植體材料。