外源水楊酸對(duì)稻瘟病菌效應(yīng)蛋白BAS4過(guò)表達(dá)菌株耐受性的影響

王云鋒　王春梅　王長(zhǎng)秘　張婭玲　劉林　李成云　楊靜

摘要：【目的】研究不同水楊酸（SA）濃度對(duì)稻瘟病菌菌株形態(tài)發(fā)育及受侵染水稻防御相關(guān)基因表達(dá)的影響，探究SA對(duì)稻瘟病活體寄生相關(guān)效應(yīng)蛋白BAS4在稻瘟病菌與水稻互作中的作用機(jī)制，為生產(chǎn)上有效防控稻瘟病提供理論依據(jù)?！痉椒ā坷貌煌瑵舛萐A（50、100、200、500、1000和2000μmol/L）處理稻瘟病菌過(guò)表達(dá)菌株（35S：BAS4/Mo-1）和野生型菌株（A1343R-7），統(tǒng)計(jì)分析sA對(duì)過(guò)表達(dá)菌株和野生型菌株菌落生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)和附著胞形成等形態(tài)發(fā)育的影響。調(diào)查200μmol/L SA處理稻瘟病菌菌株侵染水稻的發(fā)病率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析受侵染水稻防御相關(guān)基因表達(dá)情況。【結(jié)果】不同SA濃度對(duì)過(guò)表達(dá)菌株菌落生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和附著胞形成的影響低于sA對(duì)野生型菌株的影響，經(jīng)200μmol/L SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻的發(fā)病率降低，但降低幅度小于200μmol/L SA處理野生型菌株侵染水稻的發(fā)病率。200μmol/L SA處理能提高過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻病程相關(guān)基因PR1a早期上調(diào)表達(dá)及PR10a基因72 h時(shí)的高效表達(dá)；使SA途徑PAL基因表達(dá)量下調(diào)，JA途徑AOS2基因早期上調(diào)表達(dá)，LOX2基因各時(shí)間點(diǎn)下調(diào)表達(dá)；使PR5基因早期上調(diào)表達(dá)，后期急劇下調(diào)；HSP90基因早期上調(diào)表達(dá)，但低于野生型菌株侵染水稻的表達(dá)量?！窘Y(jié)論】BAS4過(guò)表達(dá)菌株對(duì)外源SA刺激有較強(qiáng)的耐受性。

關(guān)鍵詞：水稻；稻瘟病菌；效應(yīng)蛋白；水楊酸

中圖分類號(hào)：S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）12-2169-07

0引言

【研究意義】植物與病原菌協(xié)同進(jìn)化導(dǎo)致雙方均進(jìn)化形成一系列相應(yīng)的防御與反防御機(jī)制。植物病原菌利用細(xì)胞壁降解酶降解寄主植物細(xì)胞壁以利于其進(jìn)一步穿透，當(dāng)病原菌成功侵入寄主后即分泌大量的胞外效應(yīng)蛋白。病原菌效應(yīng)蛋白操縱寄主細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以利于病原菌侵染和抑制寄主免疫響應(yīng)（Hogenhout et al.，2009），一旦分泌的效應(yīng)蛋白進(jìn)入寄主，它們不僅能在胞外基質(zhì)中發(fā)揮作用，還能改變寄主細(xì)胞環(huán)境而有利于病菌侵染和定殖，病原菌所處環(huán)境條件決定了病原菌分泌的效應(yīng)蛋白種類和數(shù)量（Kamoun，2006；Ridout et al.，2006）。因此，研究外源水楊酸（SA）對(duì)稻瘟病菌株形態(tài)發(fā)育的影響及在稻瘟病菌與水稻互作中的作用機(jī)制，可為稻瘟病的防控提供重要理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大量研究表明，SA信號(hào)途徑、茉莉酸（JA）信號(hào)途徑和乙烯信號(hào)途徑在植物抵抗腐生病原菌和半活體寄生菌侵染中具有重要的作用（Campbell and Madden，1990）。在病原菌侵染寄主植物過(guò)程中，寄主植物周圍的pH、溫度、濕度及寄主植物細(xì)胞的微環(huán)境如植物響應(yīng)病原菌侵染時(shí)產(chǎn)生的SA和JA等激素水平上升或下降均會(huì)影響病原菌侵染寄主過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、裂解酶類或次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生（Verhoeff et al.，1988；Ten et al.，2001）。SA作為一種信號(hào)分子在植物細(xì)胞的一些重要代謝過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。SA可作為植物抗病反應(yīng)的信號(hào)分子激活植物防御保護(hù)機(jī)制，在抗逆反應(yīng)和植物信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用，當(dāng)病原菌侵染植物時(shí)，SA處理可誘導(dǎo)植物內(nèi)源防御基因表達(dá)（Malamy et al.，1990；Mitraux et al.，1990；Durrant and Dong，2004；Tsudant et al.，2009；孟雪嬌等，2010）。稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）因?qū)λ井a(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重危害而被認(rèn)為是影響水稻生產(chǎn)最嚴(yán)重的子囊菌亞門真菌之一。稻瘟病菌接種水稻葉片后12 h，侵染菌絲在最開(kāi)始穿透的表皮細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)增殖，隨后IH（Invasive hyphae）擴(kuò)展至臨近的其他細(xì)胞，這時(shí)效應(yīng)蛋白可能作為病菌成功侵人相鄰細(xì)胞的“先鋒”；稻瘟病菌效應(yīng)蛋白包括質(zhì)外體效應(yīng)蛋白（BAS4、BAS113和Slp1）及細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)蛋白（Pwl2、AVR-Pita、BAS1、BAS2、BAS3和BAS107）（St Leger et al.，1999）。BAS2和BAS3是兩個(gè)BIC相關(guān)蛋白，在侵染菌絲中表達(dá)上調(diào)，其在穿過(guò)細(xì)胞壁進(jìn)入相鄰細(xì)胞的菌絲中聚集（Giraldo et al.，2013）。BAS4在稻瘟病菌侵染水稻早期高效表達(dá)的基因，在IH和EIHM（Extra-invasive hyphal membrane）間的基質(zhì)中聚集，而不在BIC中積累?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組在前期的研究中獲得了BAS4過(guò)表達(dá)稻瘟病菌株，并對(duì)其毒性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BAS4在稻瘟病菌株內(nèi)過(guò)表達(dá)提高了菌株的毒性。目前，有關(guān)SA對(duì)BAS4過(guò)表達(dá)稻瘟病菌株耐受性的影響尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在前期研究基礎(chǔ)上，利用不同SA濃度處理BAS4過(guò)表達(dá)稻瘟病菌株和野生型菌株，觀察不同濃度的SA對(duì)其形態(tài)發(fā)育的影響，并分析不同SA濃度處理BAS4過(guò)表達(dá)菌株和野生型菌株后孢子侵染水稻防御相關(guān)基因的表達(dá)和受侵染水稻發(fā)病率等，探明SA對(duì)稻瘟病菌效應(yīng)蛋白在稻瘟病菌與水稻互作中的作用機(jī)制，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有效防控稻瘟病提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

稻瘟病菌株：野生型菌株（構(gòu)建BAS4過(guò)表達(dá)菌株的稻瘟病菌株A1343R-7，保存于云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）；過(guò)表達(dá)菌株35S：BAS4/Mo-1（云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并獲得的轉(zhuǎn)化菌株，是mCherry與35S啟動(dòng)下的BAS4融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到A1343R-7后獲得的菌株）。水稻品種：麗江新團(tuán)黑谷（LTH，普通感病水稻品種，保存于云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1不同SA濃度對(duì)稻瘟病菌產(chǎn)孢的影響 挑取稻瘟病菌株35S：BAS4/Mo-1和A1343R-7的菌絲放入PSB培養(yǎng)基中并置于28℃、150 r/mim的搖床培養(yǎng)，將液體培養(yǎng)的稻瘟病菌株的菌絲液接人含不同濃度SA[50、100、200、500、1000和2000μmol/L，依次記為處理1～處理6，以二甲基亞砜（DMSO）溶液為對(duì)照（CK）]的PA培養(yǎng)基（西梅汁40 mL、酵母粉1 g、乳糖5 g、瓊脂15 g和H20 1000 mL）上，先在28℃光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)4 d后，再晝夜交替（黑暗、光照各12 h）培養(yǎng)6 d。用5 mL ddH₂O將孢子洗下，利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。試驗(yàn)設(shè)生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)各3次。

1.2.2不同SA濃度對(duì)稻瘟病菌菌落生長(zhǎng)的影響用打孔器取在PDA培養(yǎng)基上已活化好的稻瘟病菌株35S：BAS4/Mo-1和A1 343R-7的菌塊，接種到不同SA濃度的PDA培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d測(cè)量一次菌落直徑，持續(xù)至10 d。試驗(yàn)設(shè)生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)各3次。

1.2.3不同SA濃度對(duì)稻瘟病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響 將稻瘟病菌株35S：BAS4/Mo-1和A1 343R-7的孢子用蒸餾水洗下后離心去上清液，分別加入不同濃度的SA ddH₂O溶液，將孢子懸浮液濃度稀釋為1×10⁵個(gè)/mL，混勻后用移液槍取10μL孢子懸浮液滴到疏水玻片上，2 h時(shí)觀察孢子萌發(fā)率，6 h時(shí)觀察孢子附著胞形成情況（Spence et al.，2015）。試驗(yàn)設(shè)生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)各3次。

1.2.4 SA對(duì)稻瘟病菌致病性的影響 挑選飽滿的水稻種子進(jìn)行消毒（75%酒精消毒浸泡1 min，清水沖洗3～5次，1.5%次氯酸鈉消毒浸泡5 min，清水沖洗直至無(wú)次氯酸鈉的氣味為止），消毒后將種子用清水浸泡后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，種子露白后播種到育秧盤中，水稻幼苗長(zhǎng)到3葉1心時(shí)用于接種。

將稻瘟病菌株35S：BAS4/Mo-1和A1343R-7的孢子洗下過(guò)濾后制備孢子懸浮液，離心去上清液，加入200 μmol/L SA，調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度為1×10⁵個(gè)/mL，再加入懸浮液總體積0.02%的吐溫-20后用于噴霧接種；以DMSO配制孢子懸浮液接種為對(duì)照。在黑暗、高溫、高濕條件下放置24 h后，將其轉(zhuǎn)移至溫室培養(yǎng)；噴霧接種后分別于0、24、48、72、96和120 h取樣，液氮速凍后于-80℃保存。接種7 d后進(jìn)行病害調(diào)查，每次調(diào)查的樣本量為60株幼苗，計(jì)算發(fā)病率。發(fā)病率（%）=發(fā)病葉片數(shù)/總?cè)~片數(shù)×100。試驗(yàn)設(shè)生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)各3次。

1.2.5總RNA提取、cDNA逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析 總RNA提?。焊鶕?jù)EasteprSuper總RNA提取試劑盒LS 1040操作。cDNA逆轉(zhuǎn)錄：根據(jù)GoScript^TMReverse Transcription System A5001試劑盒操作。qRT-PCR熒光染料：SYBR Premix EXTaq Ⅱ，反應(yīng)體系根據(jù)說(shuō)明配制，總體稱為20.0 μL。分析防御相關(guān)基因在受侵染水稻中的表達(dá)情況，引物設(shè)計(jì)根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道或在文獻(xiàn)報(bào)道基礎(chǔ)上進(jìn)行修改設(shè)計(jì)（Marcel et al.，2010；Xie et al.，2011）（表1），利用2^-ΔΔCt法（Livak and Schmittgen，2001）分析檢測(cè)結(jié)果。

利用qRT-PCR分析不同SA濃度處理過(guò)表達(dá)菌株35S：BAS4/Mo-1孢子接種水稻后不同時(shí)間點(diǎn)（0、24、48、72、96和120 h）水稻病程相關(guān)基因OsPR1a和OsPR10a、SA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因OsPAL和OsEDS1及JA途徑相關(guān)基因OsLOX2、OsAOS2和逆境脅迫相關(guān)基因HSP90、OsPR5的表達(dá)情況。qRT-PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃20 s，60℃20 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；60℃升溫到98℃獲取溶解曲線。3次重復(fù)。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 13.0完成，用最小顯著極差法（LSD_0.05）進(jìn)行平均數(shù)顯著性檢驗(yàn)，再利用Excel 2007作圖分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同SA濃度對(duì)過(guò)表達(dá)菌株35S：BAS4/Mo-1和野生型菌株A1343R-7形態(tài)發(fā)育的影響

2.1.1不同SA濃度對(duì)過(guò)表達(dá)菌株菌落生長(zhǎng)速率的影響 以配制的不同SA濃度處理過(guò)表達(dá)菌株，測(cè)量其菌落生長(zhǎng)速率，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可看出，培養(yǎng)10 d后野生型菌株和過(guò)表達(dá)菌株的菌落生長(zhǎng)速率基本一致，隨著SA濃度的增加，野生型菌株與過(guò)表達(dá)菌株菌落生長(zhǎng)直徑均無(wú)顯著差異（P>0.05，下同）。

2.1.2不同SA濃度對(duì)過(guò)表達(dá)菌株產(chǎn)孢量的影響利用不同濃度的SA處理過(guò)表達(dá)菌株孢子，統(tǒng)計(jì)其對(duì)產(chǎn)孢量的影響，結(jié)果（圖1）表明，與對(duì)照相比，SA處理能降低過(guò)表達(dá)菌株和野生型菌株的產(chǎn)孢量，且隨著SA濃度的增加，過(guò)表達(dá)菌株產(chǎn)孢量降低幅度越來(lái)越大，直至SA濃度為2000 μmol/L時(shí)顯著降低了過(guò)表達(dá)菌株和野生型菌株的產(chǎn)孢量（P<0.05，下同）。

2.1.3不同SA濃度對(duì)過(guò)表達(dá)菌株孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響 利用不同SA濃度處理過(guò)表達(dá)菌株和野生型菌株的孢子，于2 h時(shí)觀察孢子萌發(fā)，結(jié)果（圖2）顯示，與對(duì)照相比，50和100μmol/L SA處理未顯著影響過(guò)表達(dá)菌株和野生型菌株的孢子萌發(fā)率，而150和200μmol/L SA處理顯著降低過(guò)表達(dá)菌株和野生型菌株孢子的萌發(fā)率，其中200μmol/L SA處理使野生型菌株孢子萌發(fā)率降低的幅度大于過(guò)表達(dá)菌株。表明50和100μmaol/L SA對(duì)過(guò)表達(dá)菌株和野生型菌株孢子萌發(fā)沒(méi)有影響，150μmol/L SA時(shí)開(kāi)始抑制稻瘟病菌孢子萌發(fā)，200μmol/L SA時(shí)顯著抑制稻瘟病菌孢子萌發(fā)。

于6 h時(shí)觀察附著胞形成情況，結(jié)果（圖3）顯示，與對(duì)照相比，50和100μmol/L SA對(duì)野生型菌株和過(guò)表達(dá)菌株附著胞形成無(wú)影響，150μmol/L SA時(shí)開(kāi)始抑制稻瘟病菌株附著胞形成，200μmol/L SA時(shí)顯著抑制稻瘟病菌株附著胞形成，其中對(duì)野生型菌株附著胞形成的抑制作用明顯大于對(duì)過(guò)表達(dá)菌株的抑制作用。因此，不同SA濃度對(duì)稻瘟病菌株附著胞形成影響的趨勢(shì)與其對(duì)菌株孢子萌發(fā)的影響趨勢(shì)基本一致。

2.2 SA對(duì)過(guò)表達(dá)菌株和野生型菌株致病性及水稻防御相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.2.1 SA處理過(guò)表達(dá)菌株孢子侵染水稻病害調(diào)查結(jié)果 對(duì)接種7 d的水稻葉片進(jìn)行病害調(diào)查，結(jié)果（圖4）顯示，經(jīng)200μmol/L SA處理過(guò)表達(dá)菌株和野生型菌株孢子侵染水稻引起的發(fā)病程度較未經(jīng)SA處理稻瘟病菌株孢子侵染水稻引起的發(fā)病程度輕。

對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行發(fā)病率統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（表3）顯示，經(jīng)200μmol/L SA處理過(guò)表達(dá)菌株和野生型菌株噴霧接種水稻引起的發(fā)病率均低于未經(jīng)200μmol/LSA處理野生型菌株和過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻引起的發(fā)病率，其中以200μmol/L SA處理野生型菌株噴霧接種水稻引起的發(fā)病率最低，顯著低于未經(jīng)200μmol/L SA處理野生型菌株和過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻引起的發(fā)病率，但與經(jīng)200μmol/L SA處理過(guò)表達(dá)菌株噴霧接種水稻引起的發(fā)病率差異不顯著。

2.2.2 SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻防御相關(guān)基因表達(dá)分析結(jié)果

2.2.2.1 SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻不同時(shí)間點(diǎn)病程相關(guān)基因PR1a和PR10a的表達(dá)分析結(jié)果 利用200μmol/L SA處理過(guò)表達(dá)菌株孢子接種水稻后，運(yùn)用SPSS 13.0分析接種后水稻在0、24、48、72、96和120 h時(shí)病程相關(guān)基因的表達(dá)量，結(jié)果（圖5）顯示，病程相關(guān)基因PR1a在SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻各時(shí)間點(diǎn)（96 h時(shí)除外）的表達(dá)量均顯著高于SA處理野生型菌株侵染水稻的表達(dá)量；PR10a基因在SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻各時(shí)間點(diǎn)（96 h時(shí)除外）的表達(dá)量均高于SA處理野生型菌株侵染水稻的表達(dá)量。PRla基因在SA處理野生型菌株侵染水稻各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量逐漸上調(diào)，但上調(diào)幅度較小，最大表達(dá)量出現(xiàn)在96 h時(shí)；過(guò)表達(dá)菌株的PR10a和PR1a基因均在72 h時(shí)出現(xiàn)表達(dá)峰值。

2.2.2.2 SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻不同時(shí)間點(diǎn)水SATLJA信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)分析結(jié)果 利用200μmol/L SA處理過(guò)表達(dá)菌株孢子接種水稻，采用qRT-PCR分析接種水稻在0、24、48、72、96和120 h時(shí)SA和JA途徑相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果（圖6）顯示，SA途徑相關(guān)基因EDS1在SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量高于SA處理野生型菌株侵染水稻的表達(dá)量，其中在120 h時(shí)的表達(dá)量最高；SA途徑相關(guān)基因PAL在SA處理過(guò)表達(dá)菌株和野生型菌株侵染水稻各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量明顯下調(diào)，但在SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻中表達(dá)量在72 h后下調(diào)幅度小于野生型菌株侵染水稻的表達(dá)；JA途徑相關(guān)基因LOX2在SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均下調(diào)，且下調(diào)幅度大于野生型菌株侵染水稻各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量；JA途徑相關(guān)基因AOS2在SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻24、48、96和120 h時(shí)的表達(dá)量顯著高于野生型菌株侵染水稻的表達(dá)量。

2.2.2.3 SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻不同時(shí)間點(diǎn)水稻抗性相關(guān)基因及脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)分析結(jié)果利用200μmol/L SA處理過(guò)表達(dá)菌株孢子接種水稻后分析水稻在0、24、48、72、96和120 h時(shí)脅迫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果（圖7）顯示，脅迫相關(guān)基因PR5在SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻24和48 h的表達(dá)量顯著高于野生型菌株侵染水稻的表達(dá)量，而在侵染水稻72、96和120 h的表達(dá)量低于野生型菌株侵染水稻的表達(dá)量；脅迫相關(guān)基因HSP90在SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻除96 h外的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均小于野生型菌株侵染水稻的表達(dá)量。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)SA影響了稻瘟病菌過(guò)表達(dá)菌株的形態(tài)發(fā)育，但影響幅度小于對(duì)野生型菌株的影響；SA對(duì)過(guò)表達(dá)菌株致病性也有一定影響，但對(duì)致病性的影響幅度亦小于野生型菌株。進(jìn)一步研究SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻在0、24、48、72、96和120 h時(shí)防御相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SA提高了過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻病程相關(guān)基因PR1a的表達(dá)量，表明PR1a基因表達(dá)量被外源SA誘導(dǎo)上調(diào)，且PR1a作為PCD信號(hào)途徑的相關(guān)基因，其表達(dá)量上調(diào)會(huì)促進(jìn)受侵染水稻細(xì)胞死亡，能進(jìn)一步阻礙病原菌侵染，而本研究中PR1a基因上調(diào)表達(dá)，表明過(guò)表達(dá)菌株活體營(yíng)養(yǎng)期水稻細(xì)胞大量死亡，不利于過(guò)表達(dá)菌株從活體營(yíng)養(yǎng)向死體營(yíng)養(yǎng)期轉(zhuǎn)變；PR10a基因在侵染早期（24和48 h）表達(dá)量較低，在72 h時(shí)表達(dá)量急劇上調(diào)，表明PR10a基因在過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻早期并未識(shí)別與其互作的稻瘟病菌蛋白，而在72 h時(shí)隨著病菌的進(jìn)一步侵染，菌株分泌了一些新的能被PR10a基因識(shí)別的效應(yīng)蛋白，因此PR10a基因上調(diào)表達(dá)。由此看出，雖然SA影響了BAS4過(guò)表達(dá)菌株的形態(tài)發(fā)育，但菌株自身仍能調(diào)控侵染水稻的病程相關(guān)基因PR1a基因上調(diào)和PR10a基因下調(diào)，有利于其進(jìn)一步侵入水稻，使水稻發(fā)病。

SA途徑的PAL基因是SA合成關(guān)鍵酶基因，本研究發(fā)現(xiàn)外源SA降低了受侵染水稻PAL基因表達(dá)，表明外源SA可能抑制了受侵染水稻內(nèi)源SA的合成，因此在后期觀察到受侵染水稻仍處于較高發(fā)病率。有研究表明，JA途徑的AOS2基因過(guò)量表達(dá)提高了內(nèi)源JA含量、PR1基因表達(dá)量及水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性（Xie et al.，2011）。本研究發(fā)現(xiàn)JA途徑的AOS2基因的表達(dá)量在SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻各時(shí)間點(diǎn)雖然有上調(diào)，但上調(diào)幅度均不明顯，LOX2基因的表達(dá)量則出現(xiàn)急劇下調(diào)，由于LOX2是催化JA合成的第一步，雖然AOS2基因表達(dá)量有上調(diào)，但LOX2基因的表達(dá)量大幅下調(diào)，因此總體來(lái)說(shuō)受侵染水稻內(nèi)源JA的合成也受到抑制。其是在水稻應(yīng)對(duì)病原菌侵染及脅迫時(shí)上調(diào)表達(dá)的基因，PR5在受到JA和SA誘導(dǎo)時(shí)也呈上調(diào)表達(dá)，提高了水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性（Datta et al.，1999；Jwa et al.，2001）。本研究還發(fā)現(xiàn)PR5基因在外源SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻早期表達(dá)量上調(diào)，表明受侵染水稻早期響應(yīng)了BAS4過(guò)表達(dá)菌株的侵染，但后期其響應(yīng)程度降低。水稻脅迫響應(yīng)基因HSP90在水稻應(yīng)對(duì)環(huán)境刺激及防御響應(yīng)時(shí)起關(guān)鍵作用，其在外源SA處理的過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻早期也出現(xiàn)上調(diào)，但上調(diào)幅度稍低于野生型菌株侵染的水稻，表明外源SA處理過(guò)表達(dá)菌株侵染水稻受到的脅迫程度較外源SA處理野生型菌株侵染水稻的低。

綜上所述，盡管過(guò)表達(dá)菌株35S：BAS4/Mo-1受到外源SA處理后其菌株形態(tài)發(fā)育和致病性均受到一定影響，但受影響的幅度較小，表明BAS4過(guò)表達(dá)菌株和野生型菌株均受到外源SA的刺激，但BAS4過(guò)表達(dá)菌株較野生型菌株有較強(qiáng)的調(diào)控水稻防御相關(guān)基因在不同時(shí)間的表達(dá)量促進(jìn)其成功侵染定殖水稻的能力，預(yù)示著BAS4過(guò)表達(dá)菌株對(duì)SA的刺激有較強(qiáng)的耐受性，但其機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

4結(jié)論

不同濃度的外源SA對(duì)過(guò)表達(dá)菌株35S：BAS4/Mo-1形態(tài)發(fā)育和致病率的影響小于其對(duì)野生型菌株A1343R-7的影響，但過(guò)表達(dá)菌株通過(guò)調(diào)控受侵染水稻防御相關(guān)基因的表達(dá)量，促進(jìn)其成功侵入水稻，表明BAS4過(guò)表達(dá)菌株對(duì)外源SA刺激有較強(qiáng)的耐受性。