甘藍(lán)型油菜離體培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化

郭婷婷　周曉嬰　張維

摘要：為優(yōu)化甘藍(lán)型油菜離體培養(yǎng)再生體系，本研究分析了影響再生頻率的多個(gè)關(guān)鍵因素，包括品種、外植體類型、苗齡、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間以及激素濃度與配比等。結(jié)果表明：品種對(duì)再生頻率影響較大，Westar的外植體再生頻率高于寧油18號(hào)和中雙11號(hào)；不同外植體再生頻率也存在差異，子葉柄的再生頻率顯著高于下胚軸；苗齡以4 d較好，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間以2 d較適宜；預(yù)培養(yǎng)基中激素2，4-D最適濃度為1 mg/L，分化培養(yǎng)基中，6-BA/NAA比例為10 ∶ 1時(shí)子葉柄的再生頻率最高，為70.79%，6-BA/NAA比例為9 ∶ 1時(shí)下胚軸的再生頻率最高，達(dá)到96.73%。經(jīng)過優(yōu)化后，油菜外植體再生頻率得到顯著提高。

關(guān)鍵詞：油菜；離體培養(yǎng)；再生；優(yōu)化；影響因素

中圖分類號(hào)： S634.304+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0076-04

油菜為世界第二大油料作物[1-3]，也是我國重要油料作物之一，在人類的生活和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著極其重要的作用。油菜花具有一定觀賞價(jià)值，可用作旅游資源；油菜的莖葉可食用，還可用來飼養(yǎng)動(dòng)物；油菜種子不僅可用來榨取食用油，餅粕還可用來做飼料。此外，油菜屬于可再生資源，低芥酸菜籽油中的脂肪酸碳鏈組成與柴油分子碳數(shù)相近，因此被認(rèn)為是生物柴油最理想的原料[4]。當(dāng)今育種學(xué)家把提高油菜產(chǎn)量和品質(zhì)，培育抗病和抗逆油菜新品種作為重要內(nèi)容來研究[5]。

目前，組織培養(yǎng)技術(shù)被廣泛地應(yīng)用到油菜育種中[6]，并得到了大量不同優(yōu)良特性的油菜種質(zhì)資源[7-12]。高效的植株再生體系是油菜基因工程育種中的重要環(huán)節(jié)。在已有的研究報(bào)道中[13-18]，油菜可用下胚軸、子葉柄、根、莖、小孢子等作為外植體來進(jìn)行組織培養(yǎng)。經(jīng)過多年研究，國內(nèi)外許多機(jī)構(gòu)已建立了較為成熟的油菜離體培養(yǎng)再生體系[19-21]。然而，研究表明，在油菜組織培養(yǎng)中，不同基因型、不同外植體之間的最佳再生條件存在差異，這在一定程度上阻礙了油菜轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展。本研究主要對(duì)影響油菜離體培養(yǎng)再生體系的關(guān)鍵因素進(jìn)行分析，以期摸索出一套穩(wěn)定、高效的油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系，為油菜組織培養(yǎng)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并進(jìn)一步為通過植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得預(yù)期優(yōu)良性狀的油菜新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試油菜品種有Westar、寧油18號(hào)、中雙11號(hào)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)主要研究油菜離體培養(yǎng)再生體系的關(guān)鍵影響因素，包括：品種、外植體類型、苗齡、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、激素濃度和配比等。其中品種有3個(gè)，即：Westar、寧油18號(hào)、中雙11號(hào)；外植體類型包括子葉柄和下胚軸；苗齡分為4、5、6 d，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間分為1、2、3 d；2，4-D濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/L；在固定NAA或6-BA濃度的基礎(chǔ)上（NAA基本濃度為0.4 μmol/L，6-BA基本濃度為4 μmol/L），將6-BA/NAA的配比分別調(diào)整為9 ∶ 1、10 ∶ 1、11 ∶ 1。以期從上述組合中篩選出最適合的油菜離體培養(yǎng)再生體系。

1.3 培養(yǎng)基配方

無菌苗生長培養(yǎng)基：1/2MS+20 g/L蔗糖+0.8%瓊脂，pH值5.8；預(yù)培養(yǎng)基：MS+1.0 mg/L 2，4-D+9.8 μg/L AS（乙酰丁香酮），pH值5.8；芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+0.4 μmol/L NAA+4 μmol/L 6-BA+0.2 g/L PVP（聚乙烯比咯烷酮）+5 μmol/L MES（乙-嗎啉乙磺酸）+200 μmol/L AdSO4（硫酸腺嘌呤）+15 μmol/L AgNO3+250 mg/L Carb（羧芐青霉素）+0.2 μmol/L GA3+30 g/L 蔗糖+2 g/L Gelrite（植物凝膠），pH值5.8；MS培養(yǎng)基：MS+30 g/L 蔗糖+250 mg/L Carb +2 g/L Gelrite，pH值5.8。

1.4 離體培養(yǎng)程序

1.4.1 無菌苗培養(yǎng) 取大離心管1支，倒入種子，加適量的“84消毒液”滅菌，不停振蕩20 min，再用無菌水沖洗5遍，每次30 s。清洗完的種子鋪在MS培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基50～60粒，然后將培養(yǎng)瓶在（25±1） ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d。后移至光下培養(yǎng)1 d，在25 ℃、光照度為2 000 lx、16 h/d光照條件下培養(yǎng)，待用。

1.4.2 預(yù)培養(yǎng) 將培養(yǎng)4～6 d的無菌苗，在底部放置了MS濕潤濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，用解剖刀切下2個(gè)子葉中較大的子葉柄和下胚軸，下胚軸切成5～10 mm的小段，將切下的外植體置于預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 d。

1.4.3 芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 預(yù)培養(yǎng)后，將外植體轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在強(qiáng)光照下25 ℃培養(yǎng)4周。每隔2周換1次新鮮培養(yǎng)基，以保證芽的正常生長。

1.4.4 壯芽生長 將外植體轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)2～4周，16 h/d光照，25 ℃；待芽長至2～4 cm時(shí)，切分芽于MS培養(yǎng)基上，進(jìn)一步生長。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種和外植體對(duì)油菜離體培養(yǎng)再生頻率的影響

采用4 d苗齡、在預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 d的不同油菜品種子葉柄和下胚軸，在芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。1周左右，切口處膨大突起，陸續(xù)長出質(zhì)地緊密、大小不一的淺綠色愈傷組織，10 d左右愈傷組織分化出青綠色的嫩芽。不同油菜品種離體培養(yǎng)再生頻率存在顯著差異（表1），Westar、寧油18號(hào)和中雙11號(hào)3個(gè)品種子葉柄的平均再生頻率分別為7079%、50.05%、35.18%，下胚軸的平均再生頻率分別為5853%、28.15%、13.74%?？梢钥闯觯瑹o論是子葉柄，還是下胚軸，Westar的再生頻率均顯著高于寧油18號(hào)和中雙11號(hào)，并且子葉柄的再生頻率顯著高于下胚軸。

2.2 苗齡對(duì)油菜離體培養(yǎng)再生頻率的影響

選取不同苗齡的子葉柄和下胚軸，在預(yù)培養(yǎng)2 d后進(jìn)行分化培養(yǎng)，研究苗齡對(duì)油菜離體培養(yǎng)再生頻率的影響，結(jié)果表明，4 d苗齡的子葉柄離體培養(yǎng)再生頻率最高，為70.79%，顯著大于5 d苗齡的再生頻率再生頻率，但與6 d苗齡差異不顯著。苗齡對(duì)下胚軸離體培養(yǎng)再生頻率的影響與子葉柄相似，以4 d苗齡的下胚軸再生頻率最高，為58.53%，顯著大于5 d苗齡的再生頻率，但與6 d苗齡的再生頻率差異不顯著（表2）。

2.3 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)油菜離體培養(yǎng)再生頻率的影響

采用4 d苗齡的油菜子葉柄和下胚軸，在預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1、2、3 d，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，待外植體誘導(dǎo)出芽，分別統(tǒng)計(jì)再生頻率。結(jié)果表明，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)子葉柄的離體培養(yǎng)再生頻率的影響不顯著，1～3 d的再生頻率變幅為 62.60%～70.79%。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)下胚軸的離體培養(yǎng)再生頻率的影響達(dá)顯著水平，以預(yù)培養(yǎng)2 d效果較好，再生頻率為58.53%，顯著大于3 d的再生頻率，預(yù)培養(yǎng)1 d和2 d間差異不顯著（表3）。

2.4 2，4-D濃度對(duì)油菜離體培養(yǎng)再生頻率的影響

采用4 d苗齡的外植體，切下子葉柄和下胚軸分別于不同2，4-D濃度的預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 d，然后轉(zhuǎn)到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)再生頻率。結(jié)果表明，2，4-D濃度為1.0 mg/L的共培養(yǎng)基對(duì)子葉柄再生頻率最高，為7079%，顯著大于0.5 mg/L和1.5 mg/L的濃度；2，4-D濃度對(duì)下胚軸再生頻率的影響與子葉柄相同，以1.0 mg/L濃度

最佳，再生頻率為58.53%，顯著高于2，4-D濃度為0.5、1.5 mg/L 的處理（表4），因此，無論是子葉柄還是下胚軸，培養(yǎng)基中2，4-D最適濃度為1.0 mg/L。

2.5 6-BA/NAA對(duì)油菜離體培養(yǎng)再生頻率的影響

采用4 d苗齡、2 d預(yù)培養(yǎng)的子葉柄和下胚軸，通過固定6-BA 和NAA其中之一的濃度，并調(diào)節(jié)另一種激素的濃度，形成6-BA/NAA的不同配比，在激素比例不同的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，待外植體誘導(dǎo)出芽，統(tǒng)計(jì)再生頻率。結(jié)果（表5）表明，固定NAA濃度的3個(gè)6-BA/NAA配比分化培養(yǎng)基的效果好于固定6-BA濃度的3個(gè)配比。在固定NAA濃度時(shí)，6-BA/NAA為10 ∶ 1的分化培養(yǎng)基對(duì)子葉柄再生頻率最好，為70.79%，顯著大于9 ∶ 1和11 ∶ 1的比例；而下胚軸卻出現(xiàn)相反的結(jié)果，6-BA與NAA比例10 ∶ 1時(shí)的再生頻率顯著低于其他2個(gè)濃度比值，6-BA/NAA比例為9 ∶ 1時(shí)，再生頻率達(dá)到96.73%。推測在6-BA/NAA為10 ∶ 1時(shí)，有利于下胚軸愈傷組織的生長，愈傷組織越長越大，越不利于愈傷組織分化出芽，從而致使再生頻率較低。

3 討論與結(jié)論

前人研究結(jié)果表明，油菜離體培養(yǎng)再生頻率與品種、外植體類型、苗齡、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、2，4-D濃度、生長素（NAA）和細(xì)胞分裂素（6-BA）的比值都有密切的關(guān)系[15-16，21]，本研究是在前人研究的基礎(chǔ)上開展的，試驗(yàn)中，培養(yǎng)基中其他必要成分，如AgNO3和GA3等的添加均參照其他研究者的經(jīng)驗(yàn)[5，13，15]，試驗(yàn)條件的設(shè)定也比對(duì)前人的結(jié)果。

本研究結(jié)果表明，不同油菜基因型的離體培養(yǎng)再生頻率存在顯著差異，Westar的再生頻率顯著大于中雙11號(hào)和寧油18號(hào)，并且子葉柄的再生頻率普遍高于下胚軸。推測可能由于不同的基因型對(duì)愈傷組織的形成產(chǎn)生一定的影響，從而導(dǎo)致再生頻率的差異。子葉柄與下胚軸再生頻率存在差異的原因在于，相對(duì)于下胚軸，子葉柄有子葉在培養(yǎng)初期為其提供營養(yǎng)，并且子葉中所含的內(nèi)源激素對(duì)切口處細(xì)胞分化與再生具有一定的協(xié)調(diào)促進(jìn)作用，子葉柄的切割傷口也遠(yuǎn)小于下胚軸，因此子葉柄具有較強(qiáng)的再生能力。研究中筆者還發(fā)現(xiàn)，在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，應(yīng)確保子葉柄插入培養(yǎng)基中而子葉仍保留在培養(yǎng)基的上方，待培養(yǎng)10 d左右，轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基時(shí)，再切除子葉，這樣更有利于芽的分化。

苗齡的長短對(duì)外植體的再生頻率產(chǎn)生顯著差異，本研究結(jié)果表明，苗齡4 d的子葉柄再生頻率最高，與下胚軸得到的結(jié)果相似。預(yù)培養(yǎng)基中的2，4-D有刺激外植體切口處膨大的作用，研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的長短對(duì)子葉柄沒有顯著影響，而對(duì)下胚軸再生頻率則存在影響，預(yù)培養(yǎng)2 d處理的再生頻率顯著大于3 d，與1 d的差異不顯著。苗齡和預(yù)培養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果與杜坤等的結(jié)論[5]存在差異。

植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)外植體形成愈傷組織，進(jìn)而分化成芽具有重要意義[19-20]。在植物離體培養(yǎng)的過程中，植物本身的內(nèi)源激素水平會(huì)不斷發(fā)生變化；分化培養(yǎng)基加入的植物生長調(diào)節(jié)劑（6-BA和NAA）也直接影響和改變著外植體內(nèi)源激素的水平，而且6-BA與NAA之間也可能相互影響。內(nèi)源激素和外源激素之間的相互影響，與愈傷組織的形成和芽的誘導(dǎo)具有密切關(guān)系[22-24]。本研究表明，子葉柄在6-BA與NAA含量的比值為10 ∶ 1時(shí)，其再生頻率顯著大于其他2個(gè)水平，而下胚軸的結(jié)果卻相反，推測可能是因?yàn)樵摫壤贿m于下胚軸的分化，上述結(jié)果與楊長友等的試驗(yàn)結(jié)果[15]相似，下胚軸對(duì)外源激素配比較敏感，當(dāng)6-BA/NAA為10 ∶ 1時(shí)抑制了下胚軸愈傷組織的活性，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

再生芽的誘導(dǎo)過程中，出現(xiàn)大量的玻璃化再生苗，這種再生苗，生長遲緩，葉片厚、呈深綠色，含水量較大，透明或半透明狀，葉片綠化作用小，并且慢慢會(huì)黃化，直至死亡，但通過適當(dāng)處理，可以使玻璃化現(xiàn)象慢慢變?nèi)酰詈筠D(zhuǎn)化為正常植株，該方面結(jié)果已申請(qǐng)國家發(fā)明專利。本研究結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化了油菜離體培養(yǎng)條件，獲得了最適合的離體培養(yǎng)再生體系，外植體再生頻率最高達(dá)到96.73%，顯著高于其他研究結(jié)果，為進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得預(yù)期優(yōu)良性狀的油菜新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ben Ghnaya A，Charles G，Branchard M. Rapid shoot regeneration from thin cell layer explants excised from petioles and hypocotyls in four cultivars of Brassica napus L.[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2008，92（1）：25-30.

[2]Maheshwari P，Selvaraj G，Kovalchuk I. Optimization of Brassica napus （canola） explant regeneration for genetic transformation[J]. New Biotechnology，2011，29（1）：144-155.

[3]Tang G X，Zhou W J，Li H Z，et al. Medium，explant and genotype factors influencing shoot regeneration in oil seed Brassica spp.[J]. Journal of Agronomy and Crop Science，2003，189（2）：351-358.

[4]管偉萍，肖彌彰，王國槐. 油菜作為生物柴油原料的研究進(jìn)展[J]. 作物研究，2006，20（增刊1）：453-455.

[5]杜 坤，范 蕓，吳 冕，等. 提高甘藍(lán)型油菜下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)率的研究[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2012，33（2）：58-61.

[6]傅榮昭.植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)手冊[M]. 北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1994.

[7]Voelker T A，Worrell A C，Anderson L，et al. Fatty acid biosynthesis redirected to medium chains in transgenic oilseed plants[J]. Science，1992，257（566）：72-74.

[8]Jones A，Davies H M，Voelker T A. Palmitoyl-acyl carrier protein （ACP） thioesterase and the evolutionary origin of plant acyl-ACP thioesterases[J]. The Plant Cell，1995，7（3）：359-371.

[9]王景雪，趙福永，徐培林，等. 油菜轉(zhuǎn)抗草甘膦、抗蟲基因獲得雙抗植株[J]. 遺傳學(xué)報(bào)，2005，32（12）：1293-1300.

[10]韓德俊，陳耀鋒，李春蓮，等. 轉(zhuǎn)甜菜堿醛脫氫酶基因油菜的獲得及其耐鹽性研究[J]. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2007，25（4）：6-11.

[11]付紹紅，張汝全，牛應(yīng)澤. Floral-dip轉(zhuǎn)化法將PEPC基因 ihpRNA 干擾表達(dá)載體導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2009，25（8）：764-769.

[12]夏鴻亮，汪 洪. 滬油16號(hào)油菜的組織培養(yǎng)和植株再生[J]. 種子，2011，30（10）：92-93.

[13]周曉馥，呂 杰，苗 璐，等. 紫花苜蓿組織培養(yǎng)體系的建立及其遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2013（4）：63-68.

[14]張立軍，趙成昊，葛 超. 玉米再生體系建立及其影響因素的研究[J]. 玉米科學(xué)，2008，16（2）：77-79，87.

[15]楊長友，袁中厚，鄭小敏，等. 甘藍(lán)型油菜高效離體再生體系的建立[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2013（1）：111-115.

[16]劉曉慶，沈 源，蔡小寧，等. 甘藍(lán)型油菜下胚軸離體培養(yǎng)再生植株研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（31）：13547-13548，13582.

[17]田志宏，孟金陵.甘藍(lán)型油菜原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生的研究[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)，2002，24（2）：10-13.

[18]王仙萍，沈 奇，曾章麗，等. 油菜組織培養(yǎng)過程及常見問題研討[J]. 耕作與栽培，2012（4）：59-60.

[19]王景雪，孫 毅，崔貴梅. 在油菜組織培養(yǎng)中激素及基因型對(duì)下胚軸分化的影響[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)，2000，22（1）：11-13.

[20]孫 潔，黃 團(tuán)，李加納，等. 農(nóng)桿菌培養(yǎng)方式和預(yù)培養(yǎng)基激素配比對(duì)甘藍(lán)型油菜下胚軸轉(zhuǎn)化效應(yīng)分析[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，29（12）：49-53.

[21]劉海燕，隆小華，劉兆普. 南鹽油1號(hào)油菜的組織培養(yǎng)及植株再生研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（3）：59-61.

[22]張 悅，張正海，李愛民，等. 優(yōu)質(zhì)觀賞百合品種“索邦”愈傷組織培養(yǎng)研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（8）：49-51.

[23]蘇慧慧，韓興杰，李同建，等. 三葉木通下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及分化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（7）：50-52.

[24]劉思言，高 瑋，夏海豐，等. 植物激素對(duì)大豆愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（4）：40-42.