亞硝化單胞菌 is79a3 Sec途徑分泌系統(tǒng)及底物蛋白分析

朱德全　王純巖　溫馨　張武　張躍華

摘要 [目的]分析亞硝化單胞菌is79a3 Sec途徑分泌裝置及底物蛋白。[方法]從NCBI中選取亞硝化單胞菌 is79a3菌株基因組注釋的蛋白質(zhì)氨基酸序列，采用Blast程序搜尋基因組中編碼Sec途徑分泌裝置的蛋白，同時(shí)采用SignalP 4.0、LipoP、TMHMM 2.0軟件分析該菌株基因組中Sec途徑的底物蛋白，同時(shí)采用COG功能數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能分析。[結(jié)果]通過分析發(fā)現(xiàn)亞硝化單胞菌is79a3菌株編碼Sec途徑分泌裝置有關(guān)的蛋白15個(gè)，包含Sec途徑分泌系統(tǒng)中12個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因，1個(gè)信號(hào)肽識(shí)別蛋白編碼基因和2個(gè)信號(hào)肽酶蛋白編碼基因；Sec途徑底物蛋白分析結(jié)果顯示366個(gè)含有Sec途徑Spase I類肽酶識(shí)別的信號(hào)肽，36個(gè)蛋白只含有Spase II類肽酶識(shí)別的信號(hào)肽。402個(gè)Sec途徑底物蛋白功能分析結(jié)果顯示：有272個(gè)蛋白功能不清楚，130個(gè)蛋白有具體的功能注釋。[結(jié)論]亞硝化單胞菌is79a3 Sec途徑分泌裝置完整，該菌株Sec途徑底物蛋白大多數(shù)沒有功能注釋和功能未知，在有功能注釋的蛋白中，主要參與細(xì)胞壁/細(xì)胞膜的生物合成、蛋白質(zhì)翻譯后修飾/蛋白更替、無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、能源產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換。

關(guān)鍵詞 亞硝化單胞菌；分泌蛋白；分泌途徑；功能分析

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）29-0153-02

Analysis of the Secretory System and Substrate Proteins of Sec Pathway of Nitrosomons is79a3

ZHU Dequan， WANG Chunyan*，WEN Xin et al

（College of Science， Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007）

Abstract [Objective]To study the secretory system and substrate proteins of sec pathway of Nitrosomons is79a3. [Method]Genome sequences of Nitrosomons is79a3 were used to predict to the secretory system of sec pathway by Blast software and then SignalP 4.0， LipoP， TMHMM 2.0 softwares were used to analyze the substrate proteins of sec pathway. Function of substrate proteins was also analyzed by COG （Cluster of Orthologous Groups of proteins） database.[Result] There were15 proteins of secretory system of sec pathway which included 12 transporters gene， 1 signal peptide recognition protein gene and two signal peptidase gene. Results of substrate proteins of sec pathway showed there were 366 proteins identified by type I Signal peptide enzyme （Spase I） and 36 proteins identified by type II signal peptide enzyme （Spase II）.Function analysis of 402 proteins showed there were 272 proteins without specific function and 130 proteins had concrete function.[Conclusion]The secretory system of sec pathway in genome of Nitrosomons is79a3 was complete and substrate proteins of sec pathway with annotation of COG functions were mainly involved in cell wall/membrane biogenesis， posttranslational modification， protein turnover， inorganic ion transport and metabolism，energy production and conversion.

Key words Nitrosomons；Secreted proteins；Secretion pathway；Function analysis

基金項(xiàng)目 黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目（2016-KYYWF-0544）。

作者簡(jiǎn)介 朱德全（1980—），男，貴州遵義人，講師，博士，從事微生物生物技術(shù)研究。

*通訊作者，副教授，從事地理科學(xué)研究。

收稿日期 2017-08-09

硝化細(xì)菌屬于自養(yǎng)型細(xì)菌，包括2種完全不同的代謝群：亞硝酸菌屬（Nitrosomonas）及硝酸菌屬（Nitrobacter），它們包括形態(tài)互異的桿菌、球菌和螺旋菌[1]。氨氮是引起水體富營(yíng)養(yǎng)化的物質(zhì)之一，生物脫氮原理是通過硝化細(xì)菌將氨氮氧化為亞硝酸鹽至硝酸鹽，反硝化細(xì)菌將硝酸鹽還原為氮?dú)?。生物脫氮工藝因具有處理效果好，處理成本低，操作管理方便等?yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，為水體中氮的去除提供了有效手段[2]。

亞硝化細(xì)菌在生物脫氮過程中控制著硝化作用的速度和進(jìn)程。投加亞硝化菌作為提高生物脫氮效率的有效途徑之一，已經(jīng)在很多行業(yè)開始應(yīng)用，然而硝化細(xì)菌大多數(shù)為無(wú)機(jī)化能自養(yǎng)菌，生長(zhǎng)緩慢，對(duì)環(huán)境因子的變化極為敏感[3]。理解硝化細(xì)菌的各項(xiàng)生理功能和了解該菌株適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制顯得尤為重要。細(xì)菌的分泌蛋白在介導(dǎo)細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換和與外界環(huán)境相互作用方面扮演重要的角色[4-5]。細(xì)菌蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)合成后，通過不同的途徑跨膜分泌到細(xì)胞外。Sec途徑是細(xì)菌蛋白分泌跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要途徑，Sec途徑的分泌裝置主要由依靠Sec途徑分泌有關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞基（SecA、SecB、SecD、SecE、SecG、SecM、SecY、YidC、YijC等）、信號(hào)肽識(shí)別受體和蛋白（Ffh、Ffs、FtsY）以及信號(hào)肽酶（Spase I和Spase Ⅱ）構(gòu)成[6]。

亞硝化單胞菌 is79a3是一株能夠生長(zhǎng)在低氨濃度條件下的氨氧化細(xì)菌，該菌株全基因組測(cè)序于2011年完成，該菌株基因組大小為3.78 Mb，G+C含量為45.40%，基因數(shù)目為3 521，蛋白數(shù)目為3 349。該研究從NCBI中選取亞硝化單胞菌 is79a3基因組注釋的蛋白質(zhì)氨基酸序列，采用Blast方法搜尋該菌株基因組中編碼Sec途徑的分泌裝置蛋白，然后用SignalP 4.0、LipoP、TMHMM 2.0軟件分析該基因組中Sec途徑的底物蛋白，同時(shí)采用COG功能數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)的底物蛋白進(jìn)行功能注釋和聚類分析，從而為了解該菌株適應(yīng)環(huán)境的分子機(jī)制以及為環(huán)境管理和環(huán)境保護(hù)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

下載美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）GenBank公布的亞硝化單胞菌 is79a3基因組編碼蛋白的氨基酸序列，GenBank的登錄號(hào)是CP002876.1。

1.2 方法

1.2.1 亞硝化單胞菌is79a3 菌株Sec途徑分泌裝置分析。

下載is79a3基因組編碼蛋白的氨基酸序列，采用Blast程序搜尋該菌株基因組中編碼Sec途徑分泌裝置的蛋白，并統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 亞硝化單胞菌is79a3 菌株Sec途徑底物蛋白預(yù)測(cè)及功能分析。

Sec途徑分泌蛋白包括具有Spase I肽酶識(shí)別的I型和Spase II肽酶識(shí)別的II型Sec分泌蛋白。利用SignalP 4.0 軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）分析I型Sec途徑的分泌信號(hào)肽，同時(shí)采用TMHMM 2.0 軟件（http：//genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)含有I型Sec途徑信號(hào)肽的蛋白進(jìn)行跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域分析。采用COG（http：//eggnog.embl.de/）功能數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)分析得到的Sec途徑底物蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝化單胞菌is79a3 菌株Sec途徑分泌裝置分析

該研究對(duì)亞硝化單胞菌is79a3菌株基因組中的Sec途徑分泌裝置進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得到該菌株編碼Sec途徑分泌裝置有關(guān)蛋白基因15個(gè)，包含Sec途徑分泌系統(tǒng)中12個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因，1個(gè)信號(hào)肽識(shí)別蛋白編碼基因（Signal recognition particledocking protein）和2個(gè)信號(hào)肽酶蛋白編碼基因（Signal peptidase I和Lipoprotein signal peptidase），結(jié)果見表1。

2.2 亞硝化單胞菌is79a3 菌株Sec途徑底物蛋白分析

根據(jù)分析結(jié)果表明Sec途徑Spase I類肽酶識(shí)別的蛋白個(gè)數(shù)為366個(gè)，占整個(gè)基因組編碼蛋白的10.9%，Spase Ⅱ 類肽酶識(shí)別的信號(hào)肽蛋白個(gè)數(shù)為110個(gè)，其中有74個(gè)含有Spase I類肽酶識(shí)別的信號(hào)肽，有36個(gè)蛋白只含有Spase Ⅱ 類肽酶識(shí)別的信號(hào)肽。402個(gè)Sec途徑底物蛋白功能分析結(jié)果顯示：有272個(gè)蛋白功能未知和沒有COG功能注釋，130個(gè)蛋白有具體的功能注釋，這些有功能注釋的蛋白主要參與細(xì)胞壁/細(xì)胞膜的生物合成、蛋白質(zhì)翻譯后修飾/蛋白更替、無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、能源產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換，具體的Sec途徑底物蛋白功能見圖1。

3 討論

高活性的氨氧化細(xì)菌是治理富營(yíng)養(yǎng)化水體比較理想的技術(shù)選擇之一。但是，氨氧化菌是一種自養(yǎng)菌，其生長(zhǎng)所需的能量和還原力都源于氨氮氧化為亞硝酸氮的過程，其效率遠(yuǎn)低于通常的異養(yǎng)細(xì)菌。生長(zhǎng)慢，發(fā)酵液細(xì)胞密度低是氨氧化菌大規(guī)模應(yīng)用的瓶頸[7-8]。

分泌蛋白是微生物細(xì)胞內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換和適應(yīng)外界環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ)。Sec途徑是細(xì)菌中蛋白分泌跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要途徑[9]。對(duì)亞硝化單胞菌is79a3菌株基因組Sec途徑分泌裝置和底物蛋白的預(yù)測(cè)和功能分析有助于了解該菌株適應(yīng)外界環(huán)境的分子機(jī)制，也為該菌株的高效富集培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

該研究通過對(duì)亞硝化單胞菌is79a3菌株分泌裝置和底物蛋白的分析，結(jié)果得到該菌株中編碼Sec途徑分泌裝置的蛋白種類完善，為蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)分泌提供物質(zhì)基礎(chǔ)。該菌株Sec途徑底物蛋白的功能分析結(jié)果顯示：大多數(shù)底物沒有COG功能注釋和蛋白功能不清楚，需在以后的研究中，對(duì)這些蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的功能注釋。另外在有具體功能注釋的蛋白中，其主要與細(xì)胞壁/細(xì)胞膜的生物合成、蛋白質(zhì)翻譯后修飾/蛋白更替、無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、能源產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換有關(guān)。該研究結(jié)果表明，is79a3菌株在適應(yīng)外界環(huán)境過程中，通過Sec途徑分泌的蛋白主要與菌體構(gòu)成、能量轉(zhuǎn)換和無(wú)機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)功能有關(guān)。對(duì)硝化細(xì)菌Sec途徑分泌裝置蛋白和底物蛋白的分析，為以后分析該類細(xì)菌與外界環(huán)境相互作用的分子機(jī)制提供靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1] 馬英，錢魯閩，王永勝，等.硝化細(xì)菌分子生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展 [J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2007，14（5）：872-879.

[2] 劉志培，劉雙江.硝化作用微生物的分子生物學(xué)研究進(jìn)展 [J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2004，10（4）：521-525.

[3] KUAI L，VERSTRAETE W.Ammonium removal by the oxygenlimited autotrophic nitrificationdenitrification system [J].Applied and environmental microbiology，1998，64（11）：4500-4506.

[4] LIU C，ZHANG Z Y，DONG K，et al.Adhesion and immunomodulatory effects of Bifidobacterium lactis HN019 on intestinal epithelial cells INT-407 [J].World journal of gastroenterology，2010，16（18）：2283-2290.

[5] BARINOV A，LOUX V，HAMMANI A，et al.Prediction of surface exposed proteins in Streptococcus pyogenes，with a potential application to other Grampositive bacteria [J].Proteomics，2009，9（1）：61-73.

[6] DESVAUX M，KHAN A，SCOTTTUCKER A，et al.Genomic analysis of the protein secretion systems in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 [J].Biochimica et biophysica acta，2005，1745（2）：223-253.

[7] 賀紀(jì)正，張麗梅.氨氧化微生物生態(tài)學(xué)與氮循環(huán)研究進(jìn)展 [J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，29（1）：406-415.

[8] 向燕，李建光，關(guān)梅，等.好氧氨氧化微生物生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展 [J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（9）：115-120.

[9] TJALSMA H，ANTELMANN H，JONGBLOED J D，et al.Proteomics of protein secretion by Bacillus subtilis：separating the “secrets”of the secretome [J].Microbiology and molecular biology reviews，2004，68（2）：207-233.