甘肅產(chǎn)藏藥綠絨蒿中總黃酮和總生物堿的含量測(cè)定

文喜艷 王蘭霞　邵晶　郭玫

摘要 [目的]測(cè)定甘肅產(chǎn)藏藥綠絨蒿中總黃酮、總生物堿含量，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。[方法]采用紫外分光光度法，以蘆丁為對(duì)照，測(cè)定總黃酮含量；以罌粟堿為對(duì)照，測(cè)定總生物堿含量。[結(jié)果]綠絨蒿中總黃酮含量測(cè)定條件為：60%乙醇回流提取制備供試品溶液，以蘆丁為對(duì)照，以5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁顯色，在500 nm處測(cè)定吸光度；綠絨蒿中總生物堿含量測(cè)定條件為：采用氨水堿化處理，95%乙醇超聲提取，0.01 mol/L鹽酸溶解定容制備供試品溶液，以罌粟堿為對(duì)照，溴甲酚綠顯色，在416 nm處測(cè)定吸光度。甘肅甘南產(chǎn)五脈綠絨蒿中總黃酮含量介于四川產(chǎn)五脈綠絨蒿和青海產(chǎn)五脈綠絨蒿中總黃酮含量之間，總生物堿含量均低于青海產(chǎn)五脈綠絨蒿和四川產(chǎn)五脈綠絨蒿中總生物堿含量。[結(jié)論]所建立的綠絨蒿中總黃酮、總生物堿含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、可行、重現(xiàn)性好，可作為綠絨蒿藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的科學(xué)依據(jù)，試驗(yàn)結(jié)果也為甘肅產(chǎn)綠絨蒿藥材內(nèi)在品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 綠絨蒿；總黃酮；總生物堿；含量測(cè)定

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）29-0134-05

Determination of Total Flavonoids and Total Alkaloids Content from Tibetan Medicine Meconopsis Produced in Gansu

WEN Xiyan1，WANG Lanxia2*，SHAO Jing1，3* et al

（1.Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou，Gansu 730000；2.Gansu Institute for Drug Control，Lanzhou，Gansu 730000；3.Provincial Key Laboratory of Chemistry and Quality Research of Chinese Medicine in Gansu Province，Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou，Gansu 730000）

Abstract [Objective] The research aimed to determine the content of total flavonoids and total alkaloids in Meconopsis， and provide the basis for its quality evaluation.[Method]Using ultraviolet spectrophotometry，the contents of total flavonoids were determined by using rutin as control，the content of total alkaloid content was determined by using papaverine as the control.[Result]The content of total flavonoids in Meconopsis was determined as follows： 60% ethanol was refluxed to prepare the test solution，using rutin as the control， with 5% sodium nitrite， 10% aluminum nitrate color，the absorbance was measured at 500 nm.The content of total alkaloids in Meconopsis was determined as follows：using ammonia water alkalization treatment， 95% ethanol ultrasonic extraction， 0.01 mol/L hydrochloric acid dissolved constant volume preparation of the test solution，using papaverine as the control， bromocresol green color，the absorbance was measured at 416 nm.The content of total flavonoids in Meconopsis quintuplinervia in Gannan of Gansu Province was between that of Sichuan and Qinghai，and the content of total alkaloid was lower than that of Qinghai and Sichuan.[Conclusion]The method is simple， feasible and reproducible， and it can be used as the scientific basis for the quality evaluation of the quality of Meconopsis. The experimental results also provide the scientific basis for the intrinsic quality of the medicinal plants Meconopsis produced in Gansu.

Key words Meconopsis；Total flavonoids；Total alkaloids；Content determination

基金項(xiàng)目 甘肅省教育廳科研項(xiàng)目（2013A-085）；甘肅省高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（2013-1）；甘肅省高等中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（zzy-2014-04）。

作者簡(jiǎn)介 文喜艷（1989—），女，甘肅平?jīng)鋈?，碩士研究生，研究方向：中藥有效成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。*通訊作者：王蘭霞，主任藥師，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事中藥有效成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究；邵晶，副教授，在讀博士，從事中藥有效成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

收稿日期 2017-07-26

藏藥綠絨蒿是罌粟科（Papaveraceae）綠絨蒿屬（Meconopsis）植物，載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》第一冊(cè)，主流品種有五脈綠絨蒿（Meconopsis quintuplinervia Regel）、全緣綠絨蒿[Meconopsis integrifolia（Maxim.）Franch.]和紅花綠絨蒿（Meconopsis punicea Maxim.）[1]，主要分布于西藏東南部、青海東南部、甘肅西部、四川西南部等地。在傳統(tǒng)藏藥中稱為“歐氏完?！薄皻W貝”“刺兒恩”等，是極具特色的高山植物藏藥[2-4]。味甘，澀，性涼，有清熱、消炎、止痛、平喘、利尿等功效，藏醫(yī)主要用其治療肝炎、肺炎、膽囊炎、肺結(jié)核、胃潰瘍等癥[1-2]?，F(xiàn)從綠絨蒿中得到的黃酮類化合物主要有槲皮素、木犀草素、柯伊利素、洋芹素等，生物堿類成分主要有罌粟紅堿A、C、D、E和黑水罌粟菲酮堿等[2-4]。王志旺等[5-6]以甘肅產(chǎn)藏藥綠絨蒿為研究對(duì)象，先后進(jìn)行了抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、降酶保肝、抗肝纖維化等研究，活性物質(zhì)篩選結(jié)果顯示總黃酮、總生物堿是其主要活性部位。為了深入研究綠絨蒿抗炎鎮(zhèn)痛、抗肝損傷的作用機(jī)制及量效關(guān)系，必須建立準(zhǔn)確可行的含量測(cè)定方法。該研究對(duì)藏藥綠絨蒿中總黃酮、總生物堿含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，確定測(cè)定方法和條件，并對(duì)甘肅產(chǎn)綠絨蒿樣品進(jìn)行檢測(cè)，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)方法，也為綠絨蒿提取物新藥開發(fā)提供工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

試材。五脈綠絨蒿分別采自甘肅甘南地區(qū)、甘肅榆中馬銜山，全緣葉綠絨蒿分別采自甘肅省臨洮縣、甘肅榆中馬銜山，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室晉玲教授鑒定為罌粟科綠絨蒿屬植物五脈綠絨蒿（Meconopsis quintuplinervia Regel）、全緣葉綠絨蒿[Meconopsis integrifolia（Maxim.）Franch.]，憑證標(biāo)本存于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)系生藥實(shí)驗(yàn)室。青海、四川產(chǎn)五脈綠絨蒿分別通過當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)購(gòu)買，經(jīng)鑒定為罌粟科植物五脈綠絨蒿[Meconopsis integrifolia （Maxim.）Franch.]的干燥全草。

1.1.2

試劑。罌粟堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所）；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；其余試劑均為分析純。

1.1.3

儀器。UV-2401PC紫外分光光度計(jì)（日本島津）；BS110S型塞多利斯電子分析天平（北京塞多利斯天平有限公司）；KQ-250TD超聲波清洗儀（上海必能信超聲有限公司）；HH-S 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市正基儀器有限公司）；ZK-82B型真空干燥箱（上海市試驗(yàn)儀器總廠）。

1.2 方法

1.2.1

綠絨蒿中總黃酮的含量測(cè)定[1，7]。

1.2.1.1

對(duì)照品溶液的制備。精密稱定蘆丁對(duì)照品9.6 mg于50 mL容量瓶中，加60%乙醇約20 mL，超聲處理使之完全溶解，以60%乙醇定容至刻度，即得濃度為0.192 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

1.2.1.2

供試品溶液的制備。精密稱取各綠絨蒿藥材粗粉1.0 g，置于圓底燒瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，回流提取1.5 h，冷卻，再次稱重，以60%乙醇補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液備用。

1.2.1.3

測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。根據(jù)《中國(guó)藥典》2010版一部可知黃酮類化合物多在500 nm下測(cè)定，由于蘆丁在500 nm處有吸收，并且綠絨蒿中黃酮是多以槲皮素為基本母核的黃酮苷，因此采用紫外分光光度法在500 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.1.4

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取“ 1.2.1.1 ”中蘆丁對(duì)照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇 稀釋至刻度，分別配制成濃度為0.019 2 、0.038 4、0.076 8、0.115 2、0.153 6、0.192 0 mg/mL的系列對(duì)照品溶液。精密量取各濃度對(duì)照品溶液各2.0 mL于25 mL量瓶中，依次精密加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL和10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，各放置6 min，分別用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置10 min。以60%乙醇加相應(yīng)試劑為空白，于500 nm處測(cè)定吸光度值。以蘆丁對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為Y=13118X+6.926 8（r=0.998 6），表明蘆丁濃度在0.192～19.200 mg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.2.1.5

方法學(xué)考察。

（1）精密度試驗(yàn)。精密吸取同一供試品溶液4.0 mL，按照“ 1.2.1.4 ”方法進(jìn)行處理，連續(xù)測(cè)定吸光度6次，計(jì)算其RSD值。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密稱取1.0 g綠絨蒿藥材粗粉，按“ 1.2.1.2 ”方法制備供試品溶液，精密吸取4 mL，按“ 1.2.1.4 ”方法進(jìn)行處理，每隔0.5 h測(cè)定吸光度，并計(jì)算其RSD值。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取1.0 g綠絨蒿藥材粗粉5份，按“ 1.2.1.2 ”方法制備供試品溶液，精密吸取4 mL，按“ 1.2.1.4 ”方法進(jìn)行處理，測(cè)定吸光度，并計(jì)算其RSD值。

（4）加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取已知含量的同一樣品9份，分別加入稀釋后的蘆丁對(duì)照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，按“ 1.2.1.2 ”方法制備供試品溶液，精密吸取4 mL，按“ 1.2.1.4 ”方法進(jìn)行處理，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率和RSD值。

1.2.1.6 綠絨蒿中總黃酮提取條件的篩選。

（1）提取方法對(duì)綠絨蒿中總黃酮含量的影響。精密稱取1.0 g綠絨蒿藥材粗粉，以80%乙醇為溶劑，料液比1 ∶30，分別采用超聲（40 min）、連續(xù)回流（2 h）和回流法（2 h）進(jìn)行提取，按“ 1.2.1.4 ”方法測(cè)定提取液中總黃酮含量。

（2）乙醇濃度對(duì)綠絨蒿中總黃酮含量的影響。精密稱取1.0 g綠絨蒿藥材粗粉，分別以40%、60%、80%、95%的乙醇回流提取2 h，料液比1 ∶30，按“ 1.2.1.4 ”方法測(cè)定提取液中總黃酮含量。

（3）提取時(shí)間對(duì)綠絨蒿中總黃酮含量的影響。精密稱取1.0 g綠絨蒿藥材粗粉，以60%乙醇分別回流提取0.5、1.0、1.5、2.0 h進(jìn)行試驗(yàn)，按“ 1.2.1.4 ”方法測(cè)定提取液中總黃酮含量。

（4）料液比對(duì)五脈綠絨蒿中總黃酮含量的影響。精密稱取1.0 g綠絨蒿藥材粗粉，以50%乙醇回流提取1.5 h，料液比分別為1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35，所得提取液按“ 1.2.1.4 ”方法測(cè)定總黃酮含量。

1.2.1.7

樣品含量的測(cè)定。精密稱取不同產(chǎn)地綠絨蒿藥材粗粉各1.0 g，按“ 1.2.1.6 ”篩選的條件制備供試品溶液，精密吸取0.5 mL，按“ 1.2.1.4 ”方法測(cè)定吸光度，并計(jì)算總黃酮的含量。

1.2.2 綠絨蒿中總生物堿的含量測(cè)定[1，8]。

1.2.2.1

對(duì)照品溶液的制備。精密稱取罌粟堿對(duì)照品15.4 mg，用0.01 mol/L的鹽酸溶液溶解并定容至250 mL容量瓶中，即得濃度為61.6 μg/mL的鹽酸罌粟堿對(duì)照品溶液。

1.2.2.2

供試品溶液的制備。精密稱取各綠絨蒿藥材粉末2.0 g，至錐形瓶中加10 mL濃氨水充分?jǐn)嚢?，浸?0 min，加95℅乙醇60 mL浸漬2 h后超聲處理30 min，抽濾，濾液至蒸發(fā)皿中水浴蒸干，殘?jiān)?.01 mol/L鹽酸5 mL使其完全溶解，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。

1.2.2.3

測(cè)定波長(zhǎng)選擇。通過對(duì)鹽酸罌粟堿的全波長(zhǎng)掃描結(jié)果，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，選擇在416 nm下進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.4

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取鹽酸罌粟堿對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置分液漏斗中，依次加入醋酸鹽緩沖液5.0 mL、溴甲酚綠2.0 mL搖勻，再加16 mL 氯仿充分振搖，靜置1.5 h，取氯仿層，在416 nm處測(cè)定其吸光度，以0.01 mol/L鹽酸同法作空白對(duì)照。以罌粟堿濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為A=0.032 3C+0.026 3（r=0.998 5），表明罌粟堿濃度在61.6～369.6 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2.5

方法學(xué)考察。

（1）精密度試驗(yàn)。精密吸取同一供試品溶液0.5 mL，按“ 1.2.2.4 ”方法連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算RSD。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密稱取2.0 g綠絨蒿藥材粗粉，按“ 1.2.2.2 ”方法制備供試品溶液，精密吸取0.5 mL，按“ 1.2.2.4 ”方法進(jìn)行處理，分別于每30 min測(cè)定其吸光度，并計(jì)算其RSD。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取2.0 g綠絨蒿藥材粗粉5份，按“ 1.2.2.2 ”方法制備供試品溶液，精密吸取0.5 mL，按“ 1.2.2.4 ”方法進(jìn)行處理，測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中總黃酮的平均含量和RSD。

（4）加樣回收率試驗(yàn)。精密稱定已知含量的同一樣品9份，每份1.0 g，分別加入鹽酸罌粟堿對(duì)照品溶液12、16、20 mL，按“ 1.2.2.2 ” 方法制備供試品溶液，精密吸取0.5 mL，按“ 1.2.2.4 ”方法進(jìn)行處理，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率和RSD。

1.2.2.6 綠絨蒿中總生物堿提取條件的篩選。

（1）提取溶劑對(duì)綠絨蒿中總生物堿含量的影響。精密稱取綠絨蒿藥材粗粉2.0 g，2組分別以50 mL 95%乙醇、50 mL氯仿為溶劑進(jìn)行回流提取2 h，另2組分別加濃氨水10 mL，充分?jǐn)嚢璨㈧o置30 min后再分別以60 mL 95%乙醇、60 mL氯仿為溶劑回流提取2 h，濾液至蒸發(fā)皿中水浴蒸干，殘?jiān)?.01 mol/L鹽酸5 mL使其完全溶解，過濾，精密量取續(xù)濾液0.5 mL，按“ 1.2.2.4 ”方法測(cè)定其吸光度，并計(jì)算含量。

（2）提取方法對(duì)綠絨蒿中總生物堿含量的影響。精密稱取綠絨蒿藥材粗粉2.0 g，至250 mL錐形瓶中，加濃氨水10 mL，充分?jǐn)嚢璨㈧o置30 min，加95%乙醇60 mL分別采用超聲（40 min）、回流（2 h）、浸漬（2 h）以及浸漬2 h并超聲處理30 min進(jìn)行提取，提取液至蒸發(fā)皿中水浴揮干溶劑，殘留物加5 mL 0.01 mol/L鹽酸使其完全溶解， 過濾，精密吸取續(xù)濾液0.5 mL，按“ 1.2.2.4 ”方法處理，測(cè)定吸光度，并計(jì)算含量。

（3）料液比對(duì)綠絨蒿中總生物堿含量的影響。精密稱取綠絨蒿藥材粗粉2.0 g，加濃氨水10 mL，充分?jǐn)嚢璨㈧o置 30 min，分別加15、20、25、30倍95%乙醇浸漬2 h后，超聲處理30 min，提取液至蒸發(fā)皿中水浴揮干溶劑，殘留物加5 mL 001 mol/L鹽酸使其完全溶解，過濾，精密吸取續(xù)濾液0.5 mL，按“ 1.2.2.4 ”方法處理，測(cè)定吸光度，并計(jì)算含量。

1.2.2.7

樣品含量的測(cè)定。精密稱取不同產(chǎn)地綠絨蒿藥材粗粉各2.0 g，按“ 1.2.2.6 ”篩選的條件制備供試品溶液，精密吸取0.5 mL，按“ 1.2.2.4 ”方法測(cè)定吸光度，并計(jì)算其總生物堿含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠絨蒿中總黃酮的含量測(cè)定

2.1.1 方法學(xué)考察。

2.1.1.1

精密度試驗(yàn)。按“ 1.2.1.5 ”方法操作，計(jì)算6次吸光度平均值為0.401，RSD為0.13%，表明儀器的精密度良好。

2.1.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“ 1.2.1.5 ”方法操作，計(jì)算其RSD為1.21%，表明樣品在2.5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)。按“ 1.2.1.5 ”方法操作，計(jì)算其RSD為1.84%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.1.4 加樣回收率試驗(yàn)。由表1可知，綠絨蒿中總黃酮的加樣回收率平均為98.58%，RSD為1.82%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.1.2 提取條件的篩選。

2.1.2.1

提取方法對(duì)綠絨蒿中總黃酮含量的影響。由圖1可知，在限定時(shí)間內(nèi)超聲提取的效果不好，綠絨蒿中總黃酮含量為0.068 6 mg/g；連續(xù)回流提取和回流提取在相同時(shí)間內(nèi)提取率相差不大，綠絨蒿中總黃酮含量分別為0.116 3和0.118 4 mg/g。綜合考慮，選定回流提取作為綠絨蒿中總黃酮的提取方法，且提取時(shí)間為2 h。

2.1.2.2

乙醇濃度對(duì)綠絨蒿中總黃酮含量的影響。由圖2可知，隨著乙醇濃度的升高，總黃酮含量也相應(yīng)的增加，當(dāng)提取溶劑乙醇濃度為60%時(shí)，綠絨蒿中總黃酮的含量最高（0112 1 mg/g），但到80%乙醇時(shí)總黃酮含量又有所下降，這可能與樣品中所含總黃酮極性有關(guān)。因此，提取綠絨蒿中總黃酮的最佳乙醇濃度為60%。

2.1.2.3

提取時(shí)間對(duì)綠絨蒿中總黃酮含量的影響。由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間為0.5～1.0 h時(shí)，綠絨蒿中總黃酮含量呈上升趨勢(shì)，而1.0～2.0 h無(wú)明顯變化。綜合考慮，初步確定10 h為水浴回流最佳時(shí)間。

2.1.2.4

料液比對(duì)五脈綠絨蒿中總黃酮含量的影響。由圖4可知，當(dāng)料液比為1 ∶20～1 ∶25時(shí)，綠絨蒿中總黃酮含量上升趨勢(shì)明顯，料液比為1 ∶25～1 ∶30時(shí)，綠絨蒿中總黃酮含量上升趨勢(shì)不明顯；但當(dāng)料液比為1 ∶35時(shí)，綠絨蒿中總黃酮含量稍降低。因此，確定最佳料液比為1 ∶25。

綜合上述單因素篩選試驗(yàn)結(jié)果，最終確定供試品溶液的制備方法為：精密稱取各綠絨蒿藥材粗粉1.0 g，置于圓底燒瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，回流提取1.0 h，冷卻，再次稱重，以60%乙醇補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液備用。

2.1.3

樣品的含量測(cè)定。精密稱取6種不同產(chǎn)地的綠絨蒿藥材粗粉1.0 g，置于圓底燒瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，回流提取1.0 h，冷卻，再次稱重，以60%乙醇補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液0.5 mL，按“ 1.2.1.4 ”方法測(cè)定吸光度，計(jì)算其總黃酮含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表2），青海產(chǎn)五脈綠絨蒿中總黃酮含量最高，甘肅榆中馬銜山產(chǎn)全緣綠絨蒿中總黃酮含量最低；甘肅甘南產(chǎn)五脈綠絨蒿中總黃酮含量介于四川產(chǎn)五脈綠絨蒿和青海產(chǎn)五脈綠絨蒿中總黃酮含量之間。

2.2 綠絨蒿中總生物堿的含量測(cè)定。

2.2.1

方法學(xué)考察。

2.2.1.1

精密度試驗(yàn)。按“ 1.2.2.5 ”方法操作，計(jì)算其RSD為0.33%，表明儀器的精密度良好。

2.2.1.2

穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“ 1.2.2.5 ”方法操作，計(jì)算其RSD為1.95%，表明樣品在2.5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.1.3

重復(fù)性試驗(yàn)。按“ 1.2.2.5 ”方法操作，計(jì)算其RSD為2.30%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.1.4

加樣回收率試驗(yàn)。從表3可看出，樣品的平均回收率為97.56%，RSD為1.14%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.2.2 提取條件的篩選。

2.2.2.1

提取溶劑對(duì)綠絨蒿中總生物堿含量的影響。 由表4可知，當(dāng)綠絨蒿藥材粗粉采用濃氨水處理后，再采用95%乙醇提取時(shí)，綠絨蒿中總生物堿的含量最高，為0.964 4 mg/g。

2.2.2.2

提取方法對(duì)綠絨蒿中總生物堿含量的影響。由表5可知，當(dāng)綠絨蒿藥材粗粉加濃氨水浸漬2 h后，超聲處理30 min時(shí)，綠絨蒿中總生物堿的含量最高，為0.938 6 mg/g。

2.2.2.3

料液比對(duì)綠絨蒿中總生物堿含量的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)提取綠絨蒿中總生物堿的溶劑料液比為1 ∶20～1 ∶30時(shí)，綠絨蒿中總生物堿的含量呈明顯上升趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1 ∶30，綠絨蒿中總生物堿的含量最高，為0.908 3 mg/g；但當(dāng)料液比為1 ∶35時(shí)，綠絨蒿中總生物堿的含量稍降低。故選取最佳料液比為1 ∶30。

綜合上述單因素篩選試驗(yàn)結(jié)果，最終確定供試品溶液的制備方法為：精密稱取綠絨蒿藥材粉末2.0 g，加10 mL濃氨水充分?jǐn)嚢?，浸?0 min，加95%乙醇60 mL，浸漬2 h后超聲處理30 min，抽濾，濾液至蒸發(fā)皿中水浴蒸干，殘?jiān)?.01 mol/L鹽酸5 mL使其完全溶解，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。

2.2.3

樣品的含量測(cè)定。精密稱取6種不同產(chǎn)地的綠絨蒿藥材粉末2.0 g，加10 mL濃氨水充分?jǐn)嚢?，浸?0 min，加95%乙醇60 mL，浸漬2 h后超聲處理30 min， 抽濾，濾液至蒸發(fā)皿中水浴蒸干，殘?jiān)?.01 mol/L鹽酸5 mL使其完全溶解，過濾，取續(xù)濾液0.5 mL，按“ 1.2.2.4 ”方法測(cè)定吸光度，計(jì)算其總生物堿含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表6），四川產(chǎn)五脈綠絨蒿中總生物堿含量最高，甘肅榆中馬銜山產(chǎn)全緣綠絨蒿中總生物堿含量最低；甘肅甘南產(chǎn)五脈綠絨蒿中總生物堿含量均低于青海產(chǎn)五脈綠絨蒿和四川產(chǎn)五脈綠絨蒿中總生物堿含量。

3 結(jié)論與討論

采用紫外分光光度法，以蘆丁為對(duì)照，測(cè)定總黃酮含量；以罌粟堿為對(duì)照，測(cè)定總生物堿含量。結(jié)果表明，綠絨蒿中總黃酮含量測(cè)定條件為：60%乙醇回流提取制備供試品溶液，以蘆丁為對(duì)照，以5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁顯色，在500 nm處測(cè)定吸光度；綠絨蒿中總生物堿含量測(cè)定條件為：

采用氨水堿化處理，95%乙醇超聲提取，0.01 mol/L鹽酸溶解定容制備供試品溶液，以罌粟堿為對(duì)照，溴甲酚綠顯色，在416 nm處測(cè)定吸光度。采用所建立的方法，對(duì)采集到的甘肅4個(gè)產(chǎn)地綠絨蒿以及購(gòu)買的四川和青海產(chǎn)綠絨蒿均進(jìn)行了檢測(cè)，甘肅甘南產(chǎn)五脈綠絨蒿中總黃酮含量、總生物堿含量最高，甘肅榆中馬銜山產(chǎn)五脈綠絨蒿中總黃酮含量、總生物堿含量最低；但甘肅甘南產(chǎn)五脈綠絨蒿中總黃酮高于四川產(chǎn)五脈綠絨蒿、低于青海產(chǎn)五脈綠絨蒿，總生物堿含量均低于四川產(chǎn)五脈綠絨蒿和青海產(chǎn)五脈綠絨。

現(xiàn)階段，綠絨蒿基本還是以野生為主，沒有形成人工栽培的規(guī)模，且由于采集到的不同產(chǎn)地樣品有限，因此，不能以檢測(cè)數(shù)據(jù)來武斷地評(píng)價(jià)不同產(chǎn) 地藥材質(zhì)量的優(yōu)劣，但檢測(cè)結(jié)果說明所建立的綠絨蒿中總黃酮、總生物堿含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、可行、重現(xiàn)性好，可以作為將來綠絨蒿藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的科學(xué)依據(jù)，也為甘肅產(chǎn)綠絨蒿的藥材內(nèi)在品質(zhì)提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

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