正交試驗(yàn)優(yōu)化羅布麻莖中總黃酮的提取工藝

楊永濤　潘思源　田英姿 韋世鵬

摘要 [目的]優(yōu)化羅布麻莖中總黃酮的提取工藝。[方法]采用乙醇浸提法從羅布麻莖中提取總黃酮。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)羅布麻莖中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]羅布麻莖中總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度50%、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間1.5 h、料液比1 ∶40（g ∶mL）、樣品目數(shù)100，此條件下的提取率達(dá)2.033%。[結(jié)論]該研究為羅布麻的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 羅布麻莖；總黃酮；提取工藝；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）29-0114-03

Optimization of Extraction Technology of Total Flavonoids from Stems of Apocynum venetum L.by Orthogonal Experiment

YANG Yongtao，PAN Siyuan，TIAN Yingzi* et al

（Institute of Light Industry Science and Engineering，South China Unversity of Technology，Guangzhou，Guangdong 510640）

Abstract [Objective] The research aimed to optimize the extraction technology of total flavonoids from Apocynum venetum stems.[Method]Total flavonoids from Apocynum venetum stems were extracted by ethanol extraction.On the basis of single factor experiment，orthogonal experiment was used to optimize the extraction technology of total flavonoids from Apocynum venetum stems.[Result]The optimum extraction technology of total flavonoids from Apocynum venetum stems were ethanol concentration 50%，extraction temperature 50 ℃，extraction time 1.5 h，solidliquid rate 1 ∶40 （g ∶mL），sample number 100，the extraction rate under this condition was 2.033%.[Conclusion]The study laid the foundation for the development and utilization of Apocynum venetum.

Key words Stems of Apocynum venetum L.；Total flavonoids；Extraction technology；Orthogonal experiment

基金項(xiàng)目 廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目（粵煙工05XM-QK〔2015〕001）。

作者簡介 楊永濤（1992—），男，湖北廣水人，碩士研究生，研究方向：植物資源綜合利用。*通訊作者，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事植物資源綜合利用研究。

收稿日期 2017-08-09

羅布麻為夾竹桃科白麻屬大花羅布麻，維吾爾族語也稱其為“野務(wù)其干”“陶格其干”等[1-2]。在我國新疆、青海和甘肅等省區(qū)廣泛分布，新疆有豐富的野生羅布麻資源，主要分布在羅布泊、塔里木河及阿克蘇地區(qū)[3]，可以防止土地沙漠化，全株可入藥，被譽(yù)為“沙漠瑰寶”[4]。

羅布麻在煙草工業(yè)[5]、紡織[6]、成分鑒定[7-9] 、藥理[10]等方面均有研究。研究者對(duì)羅布麻葉中總黃酮的含量測定、提取工藝進(jìn)行了大量的探索，陳彥云等[11]采用超聲波輔助的方法提取羅布麻中總黃酮；阿依古麗·塔什波拉提等[12]采用近紅外光譜法快速測定羅布麻葉中總黃酮含量。工藝條件的探索中，溶劑、料液比、提取溫度常被作為總黃酮提取效率的主要因素[11-13]，而對(duì)樣品目數(shù)這一因素考慮研究較少。目前，羅布麻葉大多制成茶葉或者藥材，而莖被大量遺棄[14]。通過對(duì)羅布麻莖的研究，可為羅布麻莖的深度開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)，以期達(dá)到廢棄資源的綜合利用。該研究采用乙醇浸提法提取羅布麻莖中總黃酮，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響總黃酮提取工藝較大的5個(gè)因素 （乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間及樣品目數(shù)）進(jìn)行優(yōu)化，擬獲得科學(xué)可行的工藝條件，以期為羅布麻的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)其他天然產(chǎn)物的提取具有一定的借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 試材

羅布麻莖（購自新疆國藥集團(tuán)）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，HPLC≥98%）；無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 儀器 DR6000型紫外可見分光光度計(jì)，哈希（上海）儀器有限公司；TDL-80-2B低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；其他一些常規(guī)的試驗(yàn)設(shè)備。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羅布麻莖中總黃酮的提取。取少量羅布麻莖，室內(nèi)晾干，粉碎、過40目篩。采用乙醇浸提法對(duì)羅布麻莖中總黃酮進(jìn)行提取。

1.3.2 單因素試驗(yàn)。

采用 “1.3.1” 方法提取羅布麻莖中總黃酮。采用單因素試驗(yàn)，固定其他提取條件，分別考察乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間及樣品目數(shù)對(duì)羅布麻莖中總黃酮提取率的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮的提取率為考察指標(biāo)。通過L16（45）正交試驗(yàn)確定溶劑濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間及樣品目數(shù)等因素的最佳組合，從而優(yōu)化羅布麻莖中總黃酮的提取工藝。

1.3.4 羅布麻莖中總黃酮的測定。

1.3.4.1 標(biāo)樣溶液配制。

稱取在 110 ℃真空干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 20 mg 于 100 mL 容量瓶中，加 60%的乙醇溶解。定容至刻度，即為0.2 mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液，搖勻，冷藏備用。

量取 25 mL 上述0.2 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液于 50 mL 容量瓶中，60%乙醇稀釋至刻度，即可得到 0.1 mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[15]。

量取蘆丁對(duì)照品溶液（0.1 mg/mL） 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于 10 mL 容量管中，加入 5% NaNO3溶液 0.3 mL，搖勻，靜置 4 min； 再加 10% Al（NO3）3溶液 0.3 mL，搖勻，靜置4 min；移液槍移取4% NaOH溶液 4 mL，超純水稀釋至 10 mL，搖勻，靜置 15 min。

編號(hào)為0、1、2、3、4、5，以0號(hào)樣品溶液為空白對(duì)照。在510 nm 波長處測定吸光度[16]，以蘆丁對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.3.4.3 總黃酮的測定。

將提取液離心、過濾，移取一定量澄清液。精確量取 1.00 mL，移至 10 mL容量管中。按照 “1.3.4.2” 中方法測定提取液吸光度。

總黃酮提取率Y=[（C×V2）/（V1×m×1 000）]×100%

式中，C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的提取液總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL），V1為測定用提取液體積（mL），V2為樣品提取液總體積（mL），m為樣品絕干重量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=13.034x-0.007 5（R2=0.999 3），經(jīng)檢驗(yàn)P<0.01。因此，該回歸方程可用于定量測定。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)羅布麻莖中總黃酮提取率的影響。

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，羅布麻莖中總黃酮的提取率也隨之提高。當(dāng)濃度高于60%，總黃酮的提取率呈現(xiàn)下降趨勢，反而不利于總黃酮的提取。考慮到乙醇濃度過大會(huì)浪費(fèi)原料，將濃度控制在50%～70%較為合適。

2.2.2 料液比對(duì)羅布麻莖中總黃酮提取率的影響。

由圖3可知，總黃酮提取率隨料液比的改變呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，料液比在1 ∶40 （g ∶mL）時(shí)，提取率達(dá)到最大值，之后隨料液比增大而平緩下降。增加浸提液體積，傳質(zhì)速率增大，更多的黃酮溶出，提取率增大。提取劑過多時(shí)，多余的提取劑稀釋了提取液，傳質(zhì)速率減小，提取率減小。故將料液比控制在1 ∶20～1 ∶40較為合適。

2.2.3 提取溫度對(duì)羅布麻莖中總黃酮提取率的影響。

由圖4可知，溫度較低時(shí)，總黃酮的提取率隨溫度升高而升高；溫度高于60 ℃時(shí)，提取率增加緩慢并趨于平緩?？赡軠囟冗^高會(huì)破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致部分黃酮類物質(zhì)分解，故將溫度控制為50～70 ℃較為適宜。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)羅布麻莖中總黃酮提取率的影響。

由圖5可知，0～2 h時(shí)，總黃酮提取率隨時(shí)間增加而顯著提高；在2 h時(shí)，提取率達(dá)到最大值。2 h后，提取率出現(xiàn)緩慢下降，可能是一些黃酮類物質(zhì)因受熱時(shí)間較長而分解破壞。浸提時(shí)間過長雜質(zhì)溶出增加，因此將提取時(shí)間控制為 1.5～2.0 h較為合適。

2.2.5 樣品目數(shù)對(duì)羅布麻莖中總黃酮提取率的影響。

由圖6可知，總黃酮提取率隨樣品目數(shù)的增大而呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢。樣品目數(shù)越大，羅布麻莖粉末與浸提液的接觸面積越大，接觸愈加充分。當(dāng)樣品目數(shù)小于80時(shí)，提取率明顯增加；當(dāng)樣品目數(shù)大于80目時(shí)，提取率基本保持平穩(wěn)，可能是總黃酮的提取率已達(dá)到最大值；繼續(xù)增大樣品目數(shù)，反而會(huì)增加樣品處理的難度。故將樣品目數(shù)控制在80～100目較為合適。

2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，每個(gè)因素選取4個(gè)對(duì)總黃酮提取率影響較大的水平，建立五因素四水平的正交試驗(yàn)因素和水平表（表1）。

用 L16 （45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)羅布麻莖中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明（表2），各因素對(duì)提取率的影響程度從大到小依次為D、A、B、E、C，即料液比為主要影響因素，其次為乙醇濃度，提取溫度、樣品目數(shù)和提取時(shí)間對(duì)提取率影響較小。

對(duì) L16（45）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，料液比對(duì)總黃酮提取率的影響顯著，而乙醇濃度、提取溫度、樣品目數(shù)、提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響不顯著。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果，按照正交試驗(yàn)所得到的最佳工藝條件，即乙醇濃度50%、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間1.5 h、料液比為1 ∶40、樣品目數(shù)100，重復(fù)試驗(yàn)6次。結(jié)果表明，羅布麻莖中總黃酮的平均提取率為2.036%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD為 0.321%，表明該工藝具有可重復(fù)性。

3 結(jié)論

單因素試驗(yàn)得到各個(gè)因素的適宜范圍，但是單因素驗(yàn)未考慮到各因素之間的相互作用，需要正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化工藝條件。

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響總黃酮提取率的乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比、樣品目數(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，各因素對(duì)提取率的影響從大到小依次為料液比、乙醇濃度、提取溫度、樣品目數(shù)、提取時(shí)間，即料液比對(duì)提取率影響最大，樣品目數(shù)對(duì)提取率影響最小。

正交試驗(yàn)優(yōu)化得出羅布麻莖中總黃酮的提取工藝為：乙醇濃度50%，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間1.5 h，料液比為1 ∶40，樣品目數(shù)為100目，提取率達(dá)到2.033%。經(jīng)驗(yàn)證，在該工藝條件下重復(fù)6次試驗(yàn)，羅布麻莖總黃酮的平均提取率為2.036%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD為 0.321%，表明該工藝條件重復(fù)性良好。

參考文獻(xiàn)

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