鐵樹種子提取物的抑菌活性

袁素素　秦武灑　張耀　張瑋瑋　葉秀娟

摘要[目的]研究鐵樹種子提取物的抑菌活性。[方法]采用紙片擴(kuò)散法、牛津杯法、瓊脂稀釋法和熒光染色法，研究提取物抑菌活性。[結(jié)果]提取物具有光譜抗菌活性，對(duì)禾谷鐮刀菌的IC50為1.65 mg/mL，對(duì)其分生孢子的IC50為2.93 mg/mL，改變禾谷鐮刀菌菌絲尖端幾丁質(zhì)的量和線粒體內(nèi)膜負(fù)電性。[結(jié)論]提取物具有較好的抑菌活性。

關(guān)鍵詞蘇鐵；種子提取物；病原菌；抑菌活性

中圖分類號(hào)S-3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）31-0012-03

Abstract[Objective]The aim was to study antibacterial activity of extract of Cycas siamensis seed. [Method]The antibacterial activity of extract of Cycas siamensis seed was studied by filter paper method， agar dilution method and fluorescent staining method. [Result]The extract had a broadspectrum antibacterial activity， and the IC50 of Fusarium graminearum and spores were 1.65 and 2.93 mg/mL. The extracts changed hypha chitin and mitochondrial membrane potential. [Conclusion]The extract has stronger antibacterial activity.

Key wordsCycas siamensis；Seed extracts；Pathogenic bacteria；Antibacterial activity

蘇鐵（Cycas siamensis），在我國又名莎樹或欀木，是距今2億年前地質(zhì)歷史時(shí)期的裸子植物[1]。蘇鐵莖桿高大，供人采食淀粉，但多食有害[2]，常作為藥用本草，又名繼之、鐵蕉、鳳蕉、鳳尾蕉（松）等。蘇鐵廣泛分布于全球熱帶、亞熱帶地區(qū)，我國分布1屬10種，其中5種已經(jīng)被林業(yè)部列為國家級(jí)瀕危保護(hù)植物[1]。目前，蘇鐵植物常作為園林和庭院觀賞樹種[3]，蘇鐵的種子可藥用[4]。筆者研究了鐵樹種子提取物的抑菌活性，旨在為保護(hù)和利用蘇鐵植物提供新思路。

1材料與方法

1.1材料

10種供試菌：小白菜炭疽病菌（Colletotrichum higginsianum）、煙草炭疽病菌（Colletotrichum micotianae）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、玉米小斑病菌（Helminthosporium maydis）、芭樂炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、茄病鐮刀菌（Fusarium solani）、蘋果黑腐皮殼菌（Valsa mali）、凸臍蠕孢菌（Exserohilum monoceras）、落花生球腔菌（Mycosphaerella arachidicola），均由福建農(nóng)林大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

23種人體腸道病原細(xì)菌：ATCC10987蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus），ATCC29212糞腸球菌（Enterococcus faecali），ATCC27270屎腸球菌（Enterococcus faecium），CMCC26069表皮葡萄球菌（Staphylococcus），ATCC29521兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum），ATCC11774枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），ATCC1911、CMCC54004單核增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes），CMCC（B）28001藤黃微球菌（Micrococcus luteus），ATCC29213金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），ATCC25944阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii），ATCC10536、ATCC8739、ATCC25922、O157：H7、K7大腸桿菌（Escherichia coli），CMCC（B）49005奇異變形桿菌（Micrococcus luteus），ATCC9027銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa），ATCC12076沙門氏菌（Salmonella），ATCC12022福氏志賀氏菌（Shigella flexneri），CMCC51252痢疾志賀氏菌，ATCC17202副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus），CMCC（B）52204小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica），均由福建福州市疾病預(yù)防控制中心提供。

鐵樹種子采自福建農(nóng)林大學(xué)校園，去除種皮，洗凈，晾干備用。

1.2方法

1.2.1提取物的提取。

100 g鐵樹種子加入400 mL水進(jìn)行勻漿，4 ℃過夜，8 000 r/min離心30 min，浸提2次，收集上清液冷凍干燥，得提取物干粉備用。

1.2.2抗真菌活性檢測。

采用紙片擴(kuò)散法，將10種植物病原真菌接種于培養(yǎng)皿中，28 ℃恒溫培養(yǎng)，待真菌生長的圓面直徑為3 cm時(shí)，將已滅菌的濾紙圓片置于距菌邊緣0.5 cm處，在濾紙片上加入15 μL提取物溶液，以無菌水為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)至菌絲長至濾紙片邊緣時(shí)，觀察有無抑菌結(jié)果。

1.2.3抗細(xì)菌活性檢測。

采用牛津杯法，將50 μL細(xì)菌溶液加入含有5 mL腦心浸液肉湯（BHI）液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃、150 r/min活化12 h后備用。加熱100 mL 1.5% BHI固體培養(yǎng)基，倒入10～12個(gè)培養(yǎng)皿（90 mm×15 mm）中冷凝。將100 μL活化細(xì)菌溶液加入20 mL溫度為45～50 ℃的07%BHI固體培養(yǎng)基中并混勻，細(xì)菌濃度約為1×108 CFU/mL，倒入含有5個(gè)牛津杯的水平平板中冷凝，然后拔出牛津杯。1孔加入50 μL 1 mg/mL制真菌素為陽性對(duì)照，1孔加入50 μL無菌水為陰性對(duì)照，3孔加入粗提液，4 ℃冰箱過夜后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中6～12 h，觀察有無抑菌活性。

1.2.4禾谷鐮刀菌的半抑制濃度（IC50）測定。

采用瓊脂平板稀釋法，準(zhǔn)確稱量待測樣品，用無菌水配成不同濃度溶液，過0.22 μm的濾頭除菌。加熱融化0.7%馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，待冷卻至40～50 ℃時(shí)，分別吸取0.5 mL上述樣品溶液和無菌水分別與1.5 mL 0.7%PDA培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿（30 mm×15 mm）中混勻。取直徑6 mm禾谷鐮刀菌菌餅置于平皿中心位置，28 ℃恒溫培養(yǎng)至對(duì)照組真菌長至平皿邊緣時(shí)，用十字交叉法測量真菌的生長直徑并計(jì)算提取物對(duì)禾谷鐮刀菌的IC50，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Probit回歸分析，計(jì)算IC50。

菌絲生長抑制率=（對(duì)照組菌絲生長面積-處理組菌絲生長面積）/對(duì)照組菌絲生長面積×100%

1.2.5抗禾谷鐮刀菌分生孢子萌發(fā)活性測定。

1.2.5.1禾谷鐮刀菌分生孢子制備。

將禾谷鐮刀菌接種于羧甲基纖維素鈉（CMC）液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4～5 d，過濾取孢子，用無菌水將孢子稀釋成約1×106 CFU/mL，將等體積的0.05%葡萄糖溶液與孢子溶液混合備用。

1.2.5.2禾谷鐮刀菌分生孢子的IC50測定。

采用凹玻片法，準(zhǔn)確稱量待測樣品，用無菌水配成不同濃度的樣品溶液，過0.22 μm濾頭除菌。處理組為20 μL樣品溶液與20 μL上述孢子懸浮液混勻，對(duì)照組為20 μL無菌水與20 μL的上述孢子懸浮液混勻。加于凹玻片中央，并置于有2層無菌水浸濕濾紙片的培養(yǎng)皿（90 mm×15 mm）中，28 ℃恒溫保濕培養(yǎng)至對(duì)照組孢子萌發(fā)率在90%以上時(shí)，用光學(xué)顯微鏡觀察并記錄各組孢子的萌發(fā)情況，每個(gè)處理至少觀察300個(gè)孢子，每個(gè)處理3次重復(fù)。運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Probit回歸分析，計(jì)算IC50。

分生孢子萌發(fā)率=分生孢子萌發(fā)數(shù)/觀察分生孢子數(shù)×100%

分生孢子萌發(fā)抑制率=（對(duì)照組分生孢子萌發(fā)率-處理組分生孢子萌發(fā)率）/對(duì)照組萌發(fā)率×100%

1.2.6熒光染色試驗(yàn)。

將禾谷鐮刀菌接種于馬鈴薯葡萄糖（PD）水培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。吸取含有菌絲的PD水培養(yǎng)基與等量含有提取物溶液混合，提取物終濃度為8.7 mg/mL，對(duì)照組為PBS緩沖液，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。用剛果紅染料和羅丹明染液分別處理對(duì)照組和樣品組。剛果紅黑暗條件下染色1 h，羅丹明染色30 min，多余的染液用PBS緩沖液清洗，制作玻片，共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.7提取物穩(wěn)定性試驗(yàn)。

1.2.7.1

pH穩(wěn)定性。稱取1 mg提取物溶于200 μL無菌水中。分別吸取10 μL提取物溶液和90 μL pH 為2、3、4、5、6、8、9、10、11、12的緩沖液，混勻，靜置30 min，以蘋果黑腐皮殼菌為指示菌，用紙片擴(kuò)散法檢測有無抑菌活性。

1.2.7.2

存放時(shí)間穩(wěn)定性。稱取5 mg提取物溶于1 mL無菌水中。分別取100 μL鐵樹果提取物溶液于6個(gè)1.5 mL離心管中，在20 ℃恒溫下密封保存，并每隔3 d

取1管置于-20 ℃下保存?zhèn)溆?，以蘋果黑腐皮殼菌為指示菌，用紙片擴(kuò)散法檢測有無抑菌活性。

2結(jié)果與分析

2.1鐵樹種子提取物的抗真菌活性

由圖1可知，鐵樹果提取物對(duì)尖孢鐮刀菌、蘋果黑腐皮殼菌、禾谷鐮刀菌、茄病鐮刀菌和小白菜炭疽病菌5種植物病原真菌具有抑制活性，并且對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性較強(qiáng)。

2.2禾谷鐮刀菌的IC50

禾谷鐮刀菌的IC50檢測結(jié)果（圖

2）表明，隨著鐵樹提取物和百菌清濃度的升高，對(duì)禾谷鐮刀

菌的抑制作用隨之加強(qiáng)。由表1可知，提取物對(duì)禾谷鐮刀菌的IC50為1.650 0 mg/mL，百菌清對(duì)禾谷鐮刀菌的IC50為0004 7 mg/mL，可見，提取物對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制效果較百菌清弱。

2.3禾谷鐮刀菌分生孢子的IC50

提取物對(duì)禾谷鐮刀菌分生孢子具有抑制活性，進(jìn)而檢測提取物對(duì)禾谷鐮刀菌孢子的IC50。由圖3可知，在提取物濃度為0.23 mg/mL時(shí)，對(duì)禾谷鐮刀菌孢子的萌發(fā)反而有促進(jìn)作用，之后隨著提取物濃度的增大，對(duì)禾谷鐮刀菌孢子的抑制活性增強(qiáng)。運(yùn)用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步處理，得到提取物對(duì)禾谷鐮刀菌分生孢子的Probit回歸方程為：Probit（p）=0.741+1.585x，IC50為2.93 mg/mL。

2.4熒光染色試驗(yàn)結(jié)果

剛果紅染色試驗(yàn)中，通過觀察圖4中箭頭指示菌絲尖端染色情況，提取物處理組的禾谷鐮刀菌菌絲尖端有明顯紅色熒光，熒光強(qiáng)度強(qiáng)于對(duì)照組。在熒光綠染色試驗(yàn)結(jié)果（圖5）中，提取物處理組熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于對(duì)照組，因此推測提取物在作用于禾谷鐮刀菌時(shí)，使菌絲尖端幾丁質(zhì)的量和線粒體內(nèi)膜的電負(fù)性發(fā)生變化，對(duì)禾谷鐮刀菌的生長產(chǎn)生不利影響。

2.5提取物穩(wěn)定性檢測

以蘋果黑腐皮殼菌作為指示菌，檢測提取物的穩(wěn)定性。由圖6可知，提取物20 ℃放置12 d時(shí)具有抑制真菌的活性，放置15 d時(shí)抑菌活性喪失。由圖7可知，在不同pH（pH 2～12）處理后，提取物對(duì)真菌仍具有抑制活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，提取物具有耐酸堿、易于貯存的特性。

2.6抗人體腸道病原細(xì)菌活性

采用牛津杯法檢測提取物對(duì)人體腸道病原細(xì)菌的抑制活性。結(jié)果表明，鐵樹種子提取物對(duì)5種大腸桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌具有抑制活性。

3結(jié)論與討論

蘇鐵作為觀賞植物，在園林中應(yīng)用較多，研究多集中于鐵樹的栽培和管理[5]，鐵樹的種子常用于育苗[6]。鐵樹種子作為中藥，具有廣譜抗菌活性，對(duì)多種植物病原真菌和人體腸道病原細(xì)菌都具有抑制活性。陶文琴等[7]研究表明，蘇鐵蕨的根狀莖水提液[1 g（生藥）/mL]對(duì)表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制活性。在鐵樹種子中分離得到3種抗菌肽，能抑制尖孢鐮刀菌和白地霉2種植物病原真菌，以及馬鈴薯環(huán)腐病菌、萎蔫短小桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌等植物病原細(xì)菌的生長[8]。此外，人們也發(fā)現(xiàn)種子中存在具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的蛋白[9]和Ⅴ型幾丁質(zhì)酶[10]。綜上，鐵樹種子中存在多種活性物質(zhì)，進(jìn)一步拓寬了鐵樹的潛在應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步研究和挖掘。

參考文獻(xiàn)

[1] 林鴻榮.蘇鐵植物名實(shí)考[J].四川林業(yè)科技，1995，16（4）：55-61.

[2] 潘春記，徐蕓鋒，潘雷靈，等.鐵樹果急性中毒38例臨床分析[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2014，21（6）：158-159.

[3] 陳少萍.朱蕉栽培管理[J].中國花卉園藝，2015（6）：27-29.

[4] 賴維遠(yuǎn)，孫皓.鐵樹果中毒30例臨床分析[J].現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)，2010，36（2）：141-141.

[5] 董帥敏，王婭蕾，付蕓菡，等.鐵樹栽培管理技術(shù)要點(diǎn)[J].現(xiàn)代園藝，2014（15）：73-74.

[6] 羅益群.鐵樹的人工授粉和種子繁殖實(shí)驗(yàn)[J].生物學(xué)通報(bào)，2011，46（11）：52-54.

[7] 陶文琴，雷曉燕，麥旭峰，等.4種中藥貫眾原植物提取物的體外抗菌活性研究[J].武漢植物學(xué)研究，2009，27（4）：412-416.

[8] YOKOYAMA S，KATO K，KOBA A，et al.Purification，characterization，and sequencing of antimicrobial peptides，CyAMP1，CyAMP2，and CyAMP3，from the Cycad（Cycas revoluta）seeds[J].Peptides，2008，29（12）：2110-2117.

[9] KONAREV A V，LOVEGROVE A，SHEWRY P R.Serine proteinase inhibitors in seeds of Cycas siamensis and other gymnosperms[J].Phytochemistry，2008，69（13）：2482-2489.

[10] TAIRA T，F(xiàn)UJIWARA M，DENNHART N，et al.Transglycosylation reaction catalyzed by a class V chitinase from cycad，Cycas revoluta：A study involving sitedirected mutagenesis，HPLC，and realtime ESIMS[J].Biochimica et biophysica actaproteins and proteomics，2010，1804（4）：668-675.