依蘭（番荔枝科）雌配子體發(fā)育研究

甘陽英 徐鳳霞

摘 要：荔枝科是被子植物的基部類群之一，依蘭屬是番荔枝科較為原始的類群，其有性生殖過程，特別是胚胎發(fā)生與發(fā)育的研究結(jié)果，可以補(bǔ)充被子植物胚胎學(xué)原始特征的相關(guān)基礎(chǔ)資料。該研究利用常規(guī)石蠟切片技術(shù)，對依蘭胚珠、大孢子和雌配子體的發(fā)生發(fā)育過程進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明：依蘭的胚珠為倒生胚珠、厚珠心、三層珠被，第三層珠被（中間珠被）發(fā)生在大孢子母細(xì)胞時(shí)期，于外珠被與內(nèi)珠被之間、胚珠合點(diǎn)端兩側(cè)發(fā)生并隆起；雌配子體為蓼型。此外，依蘭的個(gè)別胚珠中存在雙雌配子體現(xiàn)象，且兩個(gè)雌配子體均由大孢子母細(xì)胞發(fā)育而來，大小、形狀相近，呈線形排列。該研究結(jié)果對于揭示原始被子植物胚胎發(fā)育特征具有重要意義。

關(guān)鍵詞：胚珠， 大孢子， 蓼型雌配子體， 三層珠被， 多胚

中圖分類號：Q945.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2017）04-0517-07

Abstract：Annonaceae is one of the basic groups of angiosperms and Cananga is a primitive genus in it. The study on its embryo development is of great significance to reveal the embryological characteristics of the basic angiosperms.

In this study， the ovule， megaspore and female gametophyte development of C. odorata were studied with the traditional pa-raffin section method. The results showed that the ovules of C. odorata were anatropous， assinucellate and tritegmic. The third integument （or middle integument） occured in the megaspore mother cell stage， initials and enlarges between the inner and outer integuments， on the two sides of the chalaza end. The development of the female gametophyte conformed to the polygonum type. Occassionaly two linear arranged female gametophytes were found in the same ovule and both female gametophytes were developed from megaspore mother cell， with similar size and shape. This study on sexual reproduction process， especially on the process of embryogenesis and development will add some basic information about the primitive embryological features of angiosperms.

Key words：ovule， megaspore， polygonum female gametophyte， tritegment， polyembryony

番荔枝科（Annonaceae）是被子植物基部類群之一，具有物種數(shù)量多、變異性大的特點(diǎn)，目前本科已鑒定有129 屬，超過2 300種（Li & Michael，2013）。已有的研究中，對番荔枝科大孢子發(fā)生和雌配子體形成的研究還很少，國內(nèi)未見有相關(guān)報(bào)道，國外也只有少量研究，且大多為早期研究（Oes，1914；Schnarf，1931；Juliano，1935；Corner，1949；Periasamy & Swamy，1959；Kapil & Bhandari，1964；Svoma，1998），而早期的研究由于受技術(shù)條件限制，多數(shù)文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還是手繪圖，直觀的胚胎學(xué)證據(jù)較少。此外，現(xiàn)有的研究僅針對少數(shù)幾種材料，對于一個(gè)變異性豐富的基部類群來說，還不能全面體現(xiàn)該科植物胚胎發(fā)育的特征。

依蘭（Cananga odorata）屬于番荔枝科依蘭屬植物，依蘭屬是番荔枝科中比較原始的一個(gè)屬。針對依蘭大孢子發(fā)生與雌配子體形成的研究僅見于Periasamy & Swamy（1959），他們通過石蠟切片發(fā)現(xiàn)依蘭的雌配子體為蓼型，胚珠倒生，厚珠被，在兩層珠被之間存在中間珠被；但與早期其他胚胎研究一樣，其研究結(jié)果是采用手繪圖，在一些發(fā)育過程的細(xì)節(jié)上不能提供直觀的證據(jù)。因此，本研究通過對依蘭胚珠、大孢子和雌配子體的發(fā)生發(fā)育過程進(jìn)行觀察，可以為被子植物胚胎學(xué)原始特征提供一些直觀、詳細(xì)的證據(jù)。

1 材料與方法

材料為依蘭不同花期的花朵，于2012年3月底采自華南植物園。將采集的材料用FAA（95% 乙醇 700 mL、冰醋酸 50 mL、甲醛 50 mL）固定保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)剝?nèi)∫捞m雌蕊，用蘇木精整體染色，石蠟切片法制片（切片厚度8～10 μm），中性樹脂封藏，于Leica DFC550 （Leica Microsystem， German） 顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。所有圖片采用Photoshop CS5軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 依蘭胚珠發(fā)育和大孢子發(fā)生

依蘭的胚珠原基于每年3月發(fā)生，心皮的腹縫線處出現(xiàn)短指狀突起，形成最初的胚珠原基，每心皮具6～12枚胚珠，2列，倒生胚珠，著生于腹膜上（圖版Ⅰ：1-3）。隨著胚珠原基的逐漸隆起伸長增大，在頂端的表皮下第二層細(xì)胞處分化形成一個(gè)孢原細(xì)胞（圖版Ⅰ：4-6），孢原細(xì)胞經(jīng)有絲分裂形成周緣細(xì)胞和造孢細(xì)胞（圖版Ⅰ：7）。周緣細(xì)胞經(jīng)多次平周和垂周分裂，最后形成多層珠心細(xì)胞（圖版Ⅰ：7-8）。造孢細(xì)胞體積逐漸增大，發(fā)育為大孢子母細(xì)胞，并具有豐富的細(xì)胞質(zhì)和大的細(xì)胞核（圖版Ⅰ：8）。此時(shí)內(nèi)珠被已明顯分化，為2層細(xì)胞組成（圖版Ⅰ：8）。

胚珠的體積繼續(xù)增大，頭部逐漸向下彎曲，形成倒生胚珠（圖版 Ⅰ：6，8，9）。大孢子母細(xì)胞變?yōu)闄E圓形（圖版 Ⅰ：9），開始進(jìn)行減數(shù)第一次分裂，形成二分體，靠近合點(diǎn)端的細(xì)胞體積稍大（圖版 Ⅱ：1）；減數(shù)第二次分裂后形成線形四分體（圖版 Ⅱ：2，3）或T形四分體（圖版 Ⅱ：4），靠近合點(diǎn)端的一個(gè)大孢子發(fā)育為功能大孢子，而珠孔端的三個(gè)細(xì)胞逐漸萎縮、退化消失（圖版 Ⅱ：5）。功能大孢子不斷膨大，進(jìn)一步伸長，具有豐富的細(xì)胞質(zhì)。

2.2 雌配子體形成

功能大孢子首先發(fā)育成為單核雌配子體，然后進(jìn)行第一次有絲分裂，形成兩個(gè)細(xì)胞核，二核之間無細(xì)胞壁，為二核雌配子體（圖版 Ⅱ：6）。二核逐漸移向雌配子體兩端，每個(gè)配子體再各自進(jìn)行一次分裂，形成四核雌配子體，兩兩位于雌配子體兩端（圖版 Ⅱ：7）。四核雌配子體的每個(gè)核再各自進(jìn)行第三次有絲分裂，形成八核雌配子體（圖版 Ⅱ：8）。八核雌配子體形成后，兩端各有一個(gè)核移向雌配子體中央，在靠近珠孔端的位置匯合，形成二倍體的中央極核。此時(shí)，八核雌配子體細(xì)胞化，珠孔端的三個(gè)細(xì)胞形成卵器，包括一個(gè)卵細(xì)胞和兩個(gè)助細(xì)胞，合點(diǎn)端的三個(gè)細(xì)胞發(fā)育成反足細(xì)胞（圖版 Ⅱ：8，9）。可見，依蘭的雌配子體為蓼型。

2.3 珠被的發(fā)生發(fā)育

在胚珠原基隆起并產(chǎn)生孢原細(xì)胞的時(shí)候，由兩層細(xì)胞組成的內(nèi)珠被也開始分化并不斷伸長（圖版Ⅰ：7-8），在大孢子母細(xì)胞時(shí)期，由4～5層細(xì)胞組成的外珠被逐漸分化并不斷伸長（圖版Ⅰ：8；圖版Ⅲ：7）。在大孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂的時(shí)期，在內(nèi)外珠被之間靠近合點(diǎn)端的兩邊，一部分細(xì)胞開始脫分化形成分生組織，產(chǎn)生一個(gè)4～5層的多細(xì)胞并逐漸隆起，形成中間珠被（圖版Ⅱ：1-4，6；圖版Ⅲ：8）。到雌配子體發(fā)育至大孢子四分體時(shí)期，珠被基本發(fā)育完成并包圍整個(gè)珠心，內(nèi)珠被在珠孔處突出，通過平周分裂發(fā)育為3～4層細(xì)胞，并緊密合在一起，形成一個(gè)珠心帽（nucellar cap），將珠心密封（圖版Ⅱ：2； 圖版 Ⅲ：9）。

2.4 雙雌配子體胚珠

實(shí)驗(yàn)中多次在一個(gè)胚珠中發(fā)現(xiàn)雙雌配子體的現(xiàn)象（圖版 Ⅲ：1-3）。并且兩個(gè)雌配子體已經(jīng)發(fā)育到單核雌配子體時(shí)期（圖版 Ⅲ：3），但由于雙雌配子體發(fā)生概率較低，在有限的材料中暫時(shí)未觀察到有兩個(gè)成熟雌配子體共在一個(gè)胚珠的情況。

2.5 分泌細(xì)胞、維管束與單寧物質(zhì)

在胚珠與心皮之間形成的空隙中，常見大量分泌細(xì)胞（圖版 Ⅲ：4）。分泌細(xì)胞從胚珠珠柄處一直延伸到珠孔的位置，在雌配子體形成后期，分泌細(xì)胞更加明顯（圖版 Ⅲ：5，6）。在大孢子母細(xì)胞開始進(jìn)行減數(shù)分裂時(shí)，外珠被纖維素類物質(zhì)逐漸聚集（圖版 Ⅰ：9），并在后期更加明顯（圖版 Ⅱ：1，5，9）。在雌配子體發(fā)育后期，內(nèi)珠被的內(nèi)層細(xì)胞上有少量單寧類物質(zhì)聚集（圖版 Ⅱ：5； 圖版 Ⅲ：6）。

3 討論

3.1 雌配子體發(fā)育類型

從本研究結(jié)果來看，依蘭的雌配子體發(fā)育為典型的蓼型，這與 Periasamy & Swamy（1959）的研究結(jié)果一致，同時(shí)，也與早期對于番荔枝科其他種胚胎發(fā)育研究結(jié)果類似（Oes，1914；Schnarf，1931；Juliano，1935；Corner，1949； Kapil & Bhandari，1964；Svoma，1998；Lora等，2010），粗略統(tǒng)計(jì)，已有的番荔枝科12屬（Annona， Uvaria， Artabotrys，Bocagea，Papualthia，Polyalthia，Xylopia，Tetrameranthus，Disepalum，Mitrephora，Cananga，Miliusa）16種植物的雌配子體發(fā)育類型均為蓼型。

3.2 中間珠被

在被子植物中，珠被通常由1～2層組成，一般來講，雙子葉植物合瓣花類的珠心為單層珠被，而較原始的雙子葉植物和多數(shù)單子葉植物的胚珠為2層珠被（陳樹思和唐為萍，1998）。多層珠被在被子植物中較少見，且大多為假種皮，覆蓋在內(nèi)外珠被以外。例如：蘭花蕉（Orchidantha chinensis）（溫穎群和廖景平，2001）、荔枝（Litchi chinensis）（陳健輝等，2001）、龍眼（Dimocarpus longan）（李金珠，1984）等。陳霞和杜凡（2008）統(tǒng)計(jì)，我國具有假種皮的被子植物有26科90屬571種。這些假種皮具有一個(gè)共同的基本特征，就是包裹種皮，盡管有的完全包裹，有的不完全包裹（成為種阜），但都位于種皮（內(nèi)外珠被）之外。而在番荔枝科中，發(fā)現(xiàn)多個(gè)物種在位于兩層珠被之間，合點(diǎn)端兩側(cè)發(fā)育出第三層珠被（中間珠被），Svoma（1998）總結(jié)番荔枝科中具有中間珠被的有10 屬：鷹爪花屬（Artabotrys）、依蘭屬（Cananga）、Cleistopholis屬、Cyathocalyx屬、Guamia屬、Lettowianthus屬、Meiocarpidium屬、Mezzettia屬、蟻花屬（Mezzettiopsis）、Platymitra屬（Corner，1949；Periasamy & Swamy，1961； Mohana Rao，1975；Christmann，1985；Steinecke，1993），加上Xylpia 屬和Tetrameranthus屬共有12屬。雖然依蘭的中間珠被在早期就有報(bào)道（Corner，1949；Periasamy & Swamy，1959），但二者的結(jié)果均為手繪圖，且對中間珠被的發(fā)生時(shí)間與過程還沒有很詳細(xì)的說明。本研究對中間珠被的發(fā)生時(shí)間確定為大孢子母細(xì)胞時(shí)期，發(fā)生的位置為合點(diǎn)端兩側(cè)內(nèi)外珠被之間。Corner（1949）對于成熟的依蘭種子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解剖觀察，發(fā)現(xiàn)中間珠被不斷生長，最終覆蓋到珠孔下端，并且在后期木質(zhì)化，在種子成熟時(shí)呈嚼爛狀；同時(shí)，外珠被最終發(fā)育成一層膜狀結(jié)構(gòu)。而在那些沒有中間珠被的種子中，嚼爛狀木質(zhì)化的覆蓋層往往是由外珠被發(fā)育而成的。從這個(gè)結(jié)果來看，中間珠被可能在后期起到替換外珠被功能的作用。

3.3 雙雌配子體胚珠

多胚現(xiàn)象廣泛存在于被子植物中。據(jù)統(tǒng)計(jì)，被子植物中具有多胚現(xiàn)象的植物有 59 科 140 屬 244 種（Tisserat et al，1979），主要集中在風(fēng)媒植物、水生植物、寄生或附生植物中（邢樹平等，1998）。多胚現(xiàn)象根據(jù)胚胎的來源可分為配子體型和孢子體型，被子植物中的多胚大多為無融合多胚（Batygina & Vinogradova，2007），如亞麻科亞麻屬（Linum）（康慶華等，2011）、禾本科早熟禾（Poa annua）（田震霞，2014）、稻屬（Oryza）（Mu et al，2010）、蕓香科柑橘屬（Citrus）（張斯淇等，2014）、薔薇科蘋果屬（Malus xiaojinensis）（楊曉紅和周志欽，2009）等。但也有一些多胚是由配子體發(fā)育而來的，如波喜蕩草科波喜蕩草屬的Posidonia oceanica 的雙雌配子體（Balestri et al，2008），樺木科鐵木屬Ostrya virginiana的多雌配子體（邢樹平等，1998）、菊科二色金光菊（Rudbeckia bicolor）的雙雌配子體（Musiaet al，2012）等，都是大孢子母細(xì)胞發(fā)育而來的。

有關(guān)多雌配子體現(xiàn)象在被子植物基部類群中發(fā)生的報(bào)道較少。在林仙科（Winteraceae）部分種的個(gè)別胚珠中發(fā)現(xiàn)過二個(gè)大孢子母細(xì)胞或雙雌配子體的現(xiàn)象（Bhandari，1963；Bhandari & Venkataraman，1968）。在番荔枝科中，僅Juliano（1935）發(fā)現(xiàn)在刺果番荔枝（Annona muricata）的少數(shù)胚珠中有并列兩個(gè)大孢子母細(xì)胞和兩個(gè)雌配子體的現(xiàn)象，由于Juliano同時(shí)發(fā)現(xiàn)番荔枝（Annona squamosa）的大孢子母細(xì)胞在分裂形成4個(gè)大孢子后，靠近合點(diǎn)端的兩個(gè)大孢子均增大并呈現(xiàn)功能大孢子的特征，并且觀察到刺果番荔枝的二個(gè)雌配子體間只有一層膜細(xì)胞相隔，因此他推測刺果番荔枝的雙雌配子體可能是來源于相鄰兩個(gè)大孢子共同作為功能大孢子發(fā)育而來的，并且認(rèn)為兩個(gè)雌配子體極有可能在后期發(fā)生融合。本研究中在依蘭的胚珠中，多次發(fā)現(xiàn)雙雌配子體現(xiàn)象，并且均為正常的雌配子體發(fā)育，大小形態(tài)相近，總體呈直線排列，與線形大孢子四分體的結(jié)構(gòu)有相近之處，但二個(gè)雌配子體間隔有2～3層細(xì)胞，這又與Juliano（1935）的發(fā)現(xiàn)不同。這個(gè)結(jié)果的原因可能有兩個(gè)：其一是兩個(gè)雌配子體是源自兩個(gè)不同的大孢子母細(xì)胞，其二是兩個(gè)雌配子體源自四分體大孢子中間隔的兩個(gè)大孢子（如第二、四個(gè)大孢子或第一、三個(gè)大孢子）。不過由于雙雌配子體發(fā)生的概率很低，因此研究材料十分有限，對于雙雌配子體的發(fā)生機(jī)理和發(fā)育過程的完整了解，還有待于進(jìn)一步研究。但可以肯定的是，在番荔枝科的原始種依蘭中和進(jìn)化種刺果番荔枝中均存在雙雌配子體現(xiàn)象，且他們的雙雌配子體類型都是配子體型。

參考文獻(xiàn)：

BALESTRI E， LUCCARINI G， LARDICCI C， 2008. Abnormal embryo development in the seagrass Posidonia oceanica [J]. Aquat Bot， 89（1）：71-75.

BATYGINA TB， VINOGRADOVA GY， 2007. Phenomenon of polyembryony. Genetic heterogeneity of seeds [J]. Ontogenez， 38（3）：166-191.

BHANDARI NN， 1963. Embryology of Pseudowintera colorata—a vesselless dicotyledon [J]. Phytomorphology， 13（1）：303-316.

BHANDARI NN， VENKATARAMAN R， 1968. Embryology of Drimys winteri [J]. J Arnold Arbor， 49（4）：509-524.

CHEN JH， YANG JH， PAN KQ， 2001. Study on developmental process of aril in seedless-litch [J]. Guihaia， 21（4）：362-366. [陳健輝， 楊俊慧， 潘坤清， 2001. 無核荔枝假種皮發(fā)育過程的研究 [J]. 廣西植物， 21（4）：362-366.]

CHEN SS， TANG WP， 1998. Integument and its development [J]. Bull Biol， 33（6）：4-5. [陳樹思，唐為萍. 1998. 珠被及其發(fā)育 [J]. 生物學(xué)通報(bào)，33（6）：4-5.]

CHEN X， DU F， 2008. Advances in study on aril of spermatophyte [J]. J SW For Univ， 28（1）：34-38. [陳霞， 杜凡， 2008. 種子植物假種皮研究綜述 [J]. 西南林學(xué)院學(xué)報(bào)， 28（1）：34-38.]

CHRISTMANN M， 1985. Beitrge zur Histologie der Annonaceen-Samen [D]. Rheinland-Pfalz：University of Kaiserslautern， Germany.

CORNER EJH， 1949. The Annonaceous seed and its four integuments [J]. New Phytol， 48（3）：332-364.

JULIANO JB， 1935. Morphological contribution on the genus Annona Linn [J]. Philipp Pine Agric， 24（1）：528-541.

KANG QH， XU H， GUANG FZ， et al.， 2011. Research and application of polyembryonic germplasm [J]. Plant Fiber Sci Chin， 33（4）：179-182. [康慶華， 徐涵， 關(guān)鳳芝， 等， 2011. 多胚亞麻種質(zhì)的研究與利用 [J]. 中國麻業(yè)科學(xué)， 33（4）：179-182.]

KAPIL RN， BHANDARI NN， 1964. Morphology and embryology of Magnolia Dill. ex Linn [J]. Proc Nat Acad Sci， India， Sec. B， 30（1）：245-262.

LI PT， 1976. Some notes on the Annonaceae of China [J]. J Syst Evol，14（1）：96-113. [李秉滔， 1976. 中國番荔枝科的研究 [J]. 植物分類學(xué)報(bào)， 14（1）：96-113.]

LI BT， MICHAEL， 2013. Annonaceae [M]// The Editorial Board of Flora of China. Flora of China. Beijing：Science Press； Missouri：Missouri Botanical Garden Press， 19：672-713.

LI JZ， 1984. Studies on fertilization of Dimocarpus longana [J]. Acta Hortic Sin， 11（4）：243-247. [李金珠， 1984. 龍眼受精作用的研究 [J]. 園藝學(xué)報(bào)， 11（4）：243-247.]

MOHANA RAO PR， 1975. Seed anatomy of Artabotrys odoratissimus with a discussion on chalaza， integumentary bundles and ruminate endosperm [J]. Phytomorphology， 25（1）：215-228.

MUSIA K， KOS'CIN'SKA-PAJAK M，SLIWINSKA E，et al， 2012. Developmental events in ovules of the ornamental plant Rudbeckia bicolor Nutt [J]. Flora， 207（1）：3-9.

MU XJ， JIN B， TENG NJ， 2010. Studies on the early development of zygotic and synergid embryo and endosperm in polyembryonic rice ApIII [J]. Flora， 205（6）：404-410.

OES A， 1914. Beitrge sur Entwicklungsgeschichte der Annonaceen. Verh. naturf. Ges [J]. Basel， 25：168-178.

PERIASAMY K， SWAMY BGL， 1959. Studies in the Annonaceae I. Microsporogenesis in Cananga odorata and Miliusa Wightiana [J]. Phytomorphology， 9（1）， 251-63.

PERIASAMY K， SWAMY BGL， 1961. Studies in the Annonaceae. II. The development of ovule and seed in Cananga odorata and Miliusa wightiana [J]. J Ind Bot Soc， 40（1）：206-216.

SCHNARF K， 1931. Vergleichende embryologie der angiospermen [M]. Berlin：Bomtraeger.

STEINECKE H， 1993. Embryologische， morphologische und systematische untersuchungen ausgewhlter Annonaceae [J]. Dissert Bot， 205（1）：1-237.

SVOMA， 1998. Studies on embryology and gynoecium structures in Drimys winteri （Winteraceae） and some Annonaceae [J]. Plant Syst Evol， 209（3-4）：205-229.

TIAN ZZ， 2014. Embryo types and characteristics of apomixis in Poa pratensis L. [D]. Lanzhou：Gansu Agricultural University. [田震霞， 2014. 草地早熟禾胚胎發(fā)育特征的研究 [D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué).]

TISSERAT B， ESAN EB， MURASHIGE T， 1979. Somatic embryogenesis in angiosperms [J]. Hortic Rev， 1（1）：1-78.

WEN YQ， LIAO JP， 2001. Embryological study of Orchidantha chinensis （Lowiaceae） [J]. J Trop Subtrop Bot， 9（4）：301-305. [溫穎群， 廖景平， 2001. 蘭花蕉的胚胎學(xué)研究 [J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 9（4）：301-305.]

XING SP， CHEN ZD， LU AM， 1998. Development of ovules and embryo sacs in Ostrya virginiana （Betulaceae） and its systematic significance [J]. Acta Phytotax Sin， 36（5）：428-435. [邢樹平，陳之端，路安民， 1998. Ostrya virginiana（Betulaceae）的胚珠和胚囊發(fā)育及其系統(tǒng)學(xué)意義 [J]. 植物分類學(xué)報(bào)，36（5）：428-435.]

YANG XH， ZHOU ZQ， 2009. Anatomical characters of apomixes development in the gynoecia of Malus xiaojinensis [J]. J Fruit Sci， 26（1）：1-5. [楊曉紅， 周志欽， 2009. 小金海棠雌蕊無融合生殖發(fā)育的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)觀察 [J]. 果樹學(xué)報(bào)， 26（1）：1-5.]

ZHANG SQ， XU Q， DENG XX， 2014. Advances in apomixes and polyembryony research in Citrus plants [J]. Plant Sci J， 32（1）：88-96. [張斯淇，徐強(qiáng)，鄧秀新， 2014. 無融合生殖與柑橘多胚現(xiàn)象的研究進(jìn)展 [J]. 植物科學(xué)學(xué)報(bào)， 32（1）：88-96.]